Mechanizmy regulace proteinové homeostázy ve vývoji nádorových onemocnění

Souhrn

Východiska:
Proteom eukaryotické buňky představuje komplexní systém, jehož složky jsou vystaveny nepříznivým vlivům vnitřního a vnějšího prostředí. Funkce buněčného proteomu je tudíž závislá na existenci kompenzačních mechanizmů udržujících vnitřní proteinovou homeostázu – proteostázu. K těmto mechanizmům náleží síť molekulárních chaperonů a transkripční program řídící jejich syntézu. Proces kancerogeneze je provázen výraznými změnami faktorů vnitřního prostředí nádorových buněk – teplota, pH, dostupnost živin. Tyto změny představují na jedné straně důsledek deregulovaného růstu nádorové tkáně a na straně druhé mohou být zdrojem selekčního tlaku, který umožňuje vznik rezistentních a agresivních populací nádorových buněk. Popis složek proteostatického aparátu a mechanizmus jejich zapojení ve vývoji nádorové tkáně jsou předmětem tohoto přehledového článku.

Cíl:
Tento přehledový článek se věnuje popisu dvou kauzálně propojených skupin proteostatických dějů, jejichž vzájemná koordinace je klíčová pro průběh odpovědi nádorové buňky a potažmo i celé nádorové tkáně na environmentální i vnitřní stresové faktory. První skupina těchto dějů je zastoupena „vykonavatelskou“ úlohou molekulárních chaperonů z rodiny HSP70, HSP90 a tzv. malých molekulárních chaperonů. Tyto proteiny se podílejí na udržování stability buněčných proteinů nezbytných pro regulaci proliferace, apoptózy, senescence, migrace a fenotypové plasticity nádorových buněk. K druhé skupině popisovaných dějů pak náleží posttranslační řízení „systémové“ úlohy transkripčního faktoru HSF1 při regulaci exprese genů pro molekulární chaperony a dalších genů specificky regulovaných tímto transkripčním faktorem v nádorových a stromálních buňkách.

Klíčová slova:
molekulární chaperony – heat-shock factor 1 – rakovina – proteinová homeostáza

Úvod

Proteinová homeostáza nebo také proteostáza je souhrnné označení molekulárních dějů podílejících se na udržení balancovaného stavu buněčného proteomu [1]. Mezi procesy, jejichž průběh je regulován proteostatickým buněčným aparátem, patří zejména syntéza proteinů na ribozomech, jejich skládání, intracelulární transport a konečně degradace. Homeostáza intracelulárního proteinového prostředí je za fyziologických podmínek udržována konstitutivní syntézou proteinů tepelného šoku (heat-shock proteins – HSP). HSP proteiny představují molekulární chaperony („gardedámy“, doprovod) napomáhající skládání sekundárních, terciárních i kvarterních proteinových struktur, umožňují transport proteinů, jejich modifikace typu ubikvitinace a také jejich řízenou degradaci v proteazomu [2]. Překročení proteostatické kapacity HSP proteinů vlivem vnějších či vnitřních faktorů vyvolává v buňce stav proteotoxického stresu provázený akumulací/agregací poškozených a nedegradovaných proteinů [3]. Proteotoxický stres aktivuje evolučně konzervovaný transkripční program, v jehož důsledku dochází k silné indukci exprese molekulárních chaperonů [4,5]. Tento transkripční program se nazývá heat-shock response (HSR) a je řízen skupinou sekvenčně příbuzných transkripčních faktorů HSF (heat-shock factor). Klíčovým členem (master regulator) této rodiny transkripčních faktorů je protein HSF1 [6]. Inhibice aktivity HSF1 vede k narušení indukce HSR a činí buňky vysoce senzitivními k proteotoxickému stresu [7,8]. Buňky s inaktivovaným genem pro protein HSF1 nejsou schopny indukovat expresi HSP70 při zvýšení intracelulární teploty, což vede k jejich snížené termotoleranci a indukci apoptózy [7].

Zvýšená anabolická aktivita, mutační a metabolická zátěž představují významné zdroje proteotoxického stresu provázejícího proces maligní transformace a následné proliferace nádorové tkáně [9–11]. V nádorových buňkách byla prokázána zvýšená hladina HSP proteinů a stejně tak konstitutivní aktivace transkripčního faktoru HSF1 v důsledku chronického narušení homeostázy vnitrobuněčného prostředí [12,13]. Způsob, jakým jsou výše popsané složky proteostatického aparátu (HSP a HSF1) zapojeny v procesu kancerogeneze, bude detailněji popsán v následujících odstavcích.

HSP – molekulární chaperony

V souvislosti se stresem indukovaným v nádorových buňkách se zaměříme na popis dvou skupin molekulárních chaperonů, které se liší mechanizmem svého působení (obr. 1).

První skupinou jsou HSP proteiny s multidoménovou strukturou vyžadující ke své aktivitě enzymatickou konverzi molekul ATP. Tato skupina chaperonů je reprezentována evolučně konzervovanými proteiny HSP70 a HSP90 (výskyt už v prokaryotech, sekvenční konzervovanost s lidskými proteiny je až 50 %) [14,15], jejichž klidová hladina v buňce dosahuje v případě HSP90 až 1–2 % celkového proteomu [16,17]. Strukturně jsou proteiny HSP70/HSP90 definovány přítomností nukleotid a substrát vázajících domén, jejichž vazebná aktivita je obousměrně alostericky regulována [18,19]. Výrazná konformační flexibilita těchto alostericky aktivních proteinů řízená hydrolýzou ATP představuje mechanistickou podstatu jejich úlohy jakožto molekulárních chaperonů. Avšak zatímco protein HSP70 váže svou substrátovou doménou krátké hydrofobní sekvence existujících či nově tvořených proteinů, čímž zabraňuje jejich denaturaci a agregaci [20], molekulární chaperon HSP90 postrádá přesně definovaný vazebný motiv ve struktuře svých substrátů a přednostně kontaktuje konformačně nestabilní proteiny typu receptorů pro steroidní  hormony nebo protein kináz [21–23]. Je nutné poznamenat, že ATP závislý chaperonový cyklus, selekce substrátů a také lokalizace HSP70 a HSP90 v buňce jsou významně ovlivňovány přítomností celé řady tzv. ko-chaperonů, tedy proteinů asociovaných s těmito molekulárními chaperony [24].

Druhou zde popisovanou skupinou molekulárních chaperonů jsou tzv. malé HSP proteiny. Na rozdíl od HSP70/HSP90 představují malé HSP proteiny molekulární chaperony se značně odlišnou aminokyselinovou sekvencí, strukturou i velikostí. Jejich společným rysem je přítomnost asi stoaminokyselinové domény homologní s doménou kanonického člena malých HSP proteinů αB-krystalinu [25]. Tyto proteiny se nezávisle na ATP vážou na denaturované nebo nestrukturované oblasti proteinů a zabraňují jejich agregaci, čímž je udržují ve stavu kompetentním pro jejich zpracovaní ATP závislými chaperonovými systémy HSP70/HSP90 [26]. Mechanizmus transferu substrátu mezi těmito skupinami chaperonových systémů je neznámý. Tyto HSP proteiny jsou nazývány malými, jelikož jejich molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 10–40 kDa. Monomery o této velikosti se však organizují do rozsáhlých oligomerů čítajících až desítky podjednotek v reakci na tepelný šok [27]. Mezi nejznámější stresem indukované malé HSP chaperony patří proteiny HSP27  a αB-krystalin [28].

HSP proteiny a nádory

Proces maligní transformace buňky a vývoj metastazující nádorové tkáně je provázen řadou patologických změn v molekulárních mechanizmech regulace buněčné proliferace, apoptózy, senescence, migrace a genomové stability označovaných souhrnně jako Hallmarks of cancer [29]. Proteostatické mechanizmy řízené HSP proteiny sehrávají v těchto procesech důležitou roli.

Kontrola průchodu buněčným cyklem je u nádorových buněk porušena. Mezi klíčové molekuly řídící proliferační soběstačnost transformovaných buněk patří zejména komponenty mitogenní signální kaskády spouštěné vazbou růstových faktorů k receptorovým tyrozinkinázám [30]. Deregulace některé ze složek mitogenní kaskády (zvýšená míra exprese, zvýšená aktivita, amplifikace genů, aktivační/inaktivační mutace) může mít onkogenní charakter [31,32]. Chaperon HSP90 se podílí na udržování aktivního stavu nukleárních receptorů steroidních hormonů [33,34] a řady signalizačních molekul účastnících se mitogenní signalizace. Aktivační mutace onkogenních kináz EGFR a BRAF vedou k jejich strukturní nestabilitě a činí je výrazně závislými na přítomnosti HSP90 [35–38]. Další onkogenní kinázou stabilizovanou HSP90 je fúzní kináza BCR-ABL [39]. Rovněž virové kinázy v-Src, Fes, Fps a Yes vyžadují asistenci HSP90 [40,41]. Chaperon HSP90 zároveň stabilizuje buněčné kinázy CDK4, HCK a ERBB2 [42–44]. Obdobnou úlohu při regulaci proliferace nádorových buněk pravděpodobně hraje také protein HSP70, jehož inaktivace vede k inhibici proliferace myších nádorových buněk prsní žlázy [45,46]. Stabilizace onkogenních kináz chaperonem HSP90 a proteostatická aktivita HSP70 tak přispívají ke stimulaci mitogenní signalizace v nádorových buňkách.

Dalším znakem maligně transformované buňky je její schopnost nepodléhat programované buněčné smrti – apoptóze [47]. Ukazuje se, že stresem indukované chaperony HSP27 a HSP70 výrazně inhibují apoptotické signální dráhy svou interakcí s jejich proteinovými komponentami [48]. Protein HSP27 ovlivňuje apoptózu na více úrovních – inhibuje uvolňování cytochromu c a proteinu SMAC-Diablo z mitochondrií, tlumí aktivitu kaspázy 3 a 9 a také signalizaci zprostředkovanou ligandy Fas, TNF a TRAIL [49–52]. Chaperon HSP70 inhibuje apoptózu svou vazbou na protein Apaf-1, čímž zabraňuje tvorbě apoptozómu [53]. V nenádorové buňce tak chaperony HSP27 a HSP70 slouží jako homeostatický mechanizmus tolerance určitého stupně proteotoxického stresu dříve, než je nenávratně aktivována programovaná buněčná smrt. Nádorová buňka naopak nadměrnou produkcí HSP27 a HSP70 zvyšuje svou rezistenci k cytotoxickým látkám inaktivací apoptotické dráhy.

Nádorové buňky obcházejí přirozený proces replikativní senescence aktivací telomerázy [54]. Účinnost telomerázy je podmíněna její asociací s HSP90 [55]. Farmakologická inhibice HSP90 vede k inaktivaci telomerázové funkce v nádorových buňkách [56]. HSP90 se v nádorových buňkách podílí také na regu- laci exprese genu kódujícího telomerázu [57]. Těmito mechanizmy přispívá HSP90 v nádorových buňkách k inhibici senescence.

Metastazování nádorových buněk z primárního ložiska je mnohastupňovým procesem zahrnujícím remodelaci nádorové tkáně, extravazaci nádorových buněk do krevního řečiště a jejich usazení v cílové tkáni [29]. Ačkoli spektrum mutací podmiňujících metastatický potenciál nádorových buněk je heterogenní [58,59], zvýšená aktivita molekulárních chaperonů představuje nutnou podmínku metastatické kaskády [60,61]. Stabilizace kináz podílejících se na regulaci signalizace z extracelulární matrix (focal adhesion kinase – FAK, integrin-linked kinase – ILK) a receptorových tyrozinkináz ERBB2 a MET chaperonem HSP90 výrazně přispívá k metastatickému potenciálu nádorových buněk [60]. Inaktivace HSP70 vede ke snížení exprese a aktivity MET kinázy u myších prsních nádorů [46]. Bylo zjištěno, že proces epiteliálně-mezenchymální tranzice, který provází metastazování, je značně závislý na expresi chaperonu HSP27 [61–63].

Hypotéza vysvětlující význam regulátorů proteostázy a zejména pak proteinu HSP90 pro fenotypovou plasticitu nádorové tkáně pokládá HSP90 za „pufr“ genetické nestability [64]. Tato hypotéza vychází z předpokladu, že vzrůstající genetická nestabilita v nádorové tkáni (především mutace strukturních genů) je na úrovni proteinů „pufrována“ chaperonovým systémem HSP90. Limitní hodnoty proteotoxického stresu v buňkách lokalizovaných v centru nádoru vystavených hypoxickému acidifikovanému prostředí [64] mohou vést k inaktivaci chaperonu HSP90 a fenotypové manifestaci nahromaděných genetických změn. Tato „exploze“ fenotypových variant v pokročilejších nádorech by mohla vysvětlovat vznik buněčných klonů vykazujících rezistenci k použité léčbě [65,66].

HSF1 – transkripční regulace HSR

HSP proteiny představují „vykonavatelskou“ složku proteostatického aparátu. Na systémové úrovni je reakce na proteotoxický stres spouštěna robustním transkripčním programem řízeným transkripčním faktorem HSF1. Transkripční faktor HSF1 je v nestresovaných buňkách přítomen v monomerním stavu, který je udržován jeho asociací s chaperony HSP70 a HSP90 (obr. 2) [67,68]. V buňkách vystavených nepříznivým vnitřním či vnějším podmínkám dochází k disociaci HSP70/HSP90 od monomeru HSF1, který následně trimerizuje za vzniku transkripčně aktivní formy lokalizované v jádře, kde se váže ke konsenzuálním sekvenčním motivům označovaným jako heat-shock elements (HSE, sekvence nTTCnnGAAnnTTCn) v promotorových oblastech regulovaných genů [69]. Aktivace HSF1 je provázena rozsáhlým spektrem jeho posttranslačních modifikací. Patří k nim zejména fosforylace [3], acetylace [70] a sumoylace [71]. Tyto modifikace jsou součástí komplexního mechanizmu „vylaďování“ transaktivační aktivity proteinu  HSF1.

HSF1 – regulace aktivity fosforylací

Účinná aktivace HSF1 při proteotoxickém stresu je závislá na fosforylaci tohoto faktoru. Modifikaci podléhají zbytky serinu a threoninu v pozicích S230, S320, S419 a T142 katalyzované kinázami CaMKII (calcium/calmodulin-dependent protein kinase II), PKA (protein kinase A), CK2 (casein kinase 2) a PLK1 (polo-like kinase 1) [72–75]. Za klíčovou fosforylaci nutnou pro stresem indukovanou aktivaci HSF1 je považována modifikace serinu S326 [76]. Na modifikaci serinu S326 se podílí kináza mTOR [77] a také kinázy RAS/MAPK kaskády [3].

RAS/MAPK kaskáda (RAS-RAF-MEK-ERK) je centrální signální drahou řídící buněčnou proliferaci a diferenciaci, ale také metabolickou aktivitu [78]. Bylo pozorováno, že zatímco inhibice kinázy MEK vede ke snížení stresem indukované fosforylace HSF1 v pozici S326, inhibice aktivity kinázy ERK naopak tuto fosforylaci zvyšuje [3]. Jelikož je kináza ERK považována za výlučný substrát kinázy MEK a za konečný efektor RAS/MAPK kaskády, bylo toto zjištění překvapující. Navíc byla prokázána existence stresem indukovaného komplexu proteinů HSF1, MEK a ERK, ve kterém dochází k inhibici MEK regulované fosforylace serinu S326 proteinu HSF1 prostřednictvím ERK katalyzovaných inhibičních fosforylací threoninů T292 a T386 kinázy MEK. Tato pozorování dokládají regulační úlohu RAS aktivované kinázy MEK jak v dráze vedoucí ke kináze ERK, tak k transkripčnímu faktoru HSF1 a odhalují vzájemně protikladné efekty kináz MEK a ERK při regulaci aktivity HSF1. Jelikož aktivační mutace komponent RAS/MAPK signalizační dráhy jsou přítomny až u 30 % nádorů, představuje aberantní konstitutivní aktivace transkripčního faktoru HSF1 inherentní proces maligní transformace [79].

Cílená fosforylace se také podílí na inhibici aktivace HSF1. Mezi inhibiční fosforylace HSF1 náleží modifikace serinu S121, která je katalyzována kinázou AMPK (AMP-activated protein kinase) v podmínkách snížené dostupnosti živin vyvolávajících metabolický stres [80]. Tato kináza reaguje na nerovnováhu buněčného metabolizmu projevující se zvýšenou intracelulární koncentrací AMP oproti ATP a fosforyluje řadu buněčných efektorů, které se podílejí na aktivaci energeticky nákladných anabolických procesů (lipogeneze, glykolýza, beta oxidace, proteinová syntéza) [81]. AMPK indukované snížení spotřeby ATP a zvýšení jeho produkce vede k ustanovení metabolické homeostázy [81].  Aktivace AMPK v průběhu metabolického stresu inhibuje HSF1 řízenou HSR a činí nádorové buňky náchylné k proteotoxickému stresu [80]. Tyto antagonistické vztahy mezi úlohou HSF1 (proteotoxický stres) a AMPK (metabolický stres) mohou také vysvětlovat Warburgův efekt, tedy závislost proteotoxicky stresovaných nádorových buněk na glukóze.

HSF1 – translace proteinů

Aktivita mTOR kinázy je spojena s indukcí syntézy proteinů a lipidů v buňkách stimulovaných růstovými faktory a v prostředí s dostatkem živin a kyslíku [82]. Ve stresových podmínkách (energetická disbalance, nedostatek aminokyselin) je naopak mTOR inhibována a dochází k indukci autofágie [83]. Nádorové buňky jsou závislé na robustní proteinové syntéze [9]. Spolu s proteinem p53 tak patří kináza mTOR a její nadřazené regulační komponenty PI3K, PTEN a AKT k nejčastěji mutovaným signálním drahám v nádorech [82]. Již jsme zmínili, že kináza mTOR se podílí na aktivaci HSF1 jeho fosforylací [77]. Inhibice aktivity kinázy mTOR zabraňuje HSF1 indukované expresi HSP proteinů v přítomnosti proteotoxického stresu [84]. Dále bylo popsáno, že k výrazné inaktivaci transaktivační funkce HSF1 dochází při inhibici mTOR aktivovaného [85] eukaryotického iniciačního translačního faktoru 4A (eIF4A) látkou zvanou roglamid A [11]. Pozoruhodné je také zjištění, že alternativní sestřih transkriptu eukaryotického elongačního faktoru  eEF1Bδ vede ke vzniku mRNA kódující transkripční faktor kooperující s HSF1 při regulaci exprese genů, jejichž promotory obsahují HSE element [86]. Tyto skutečnosti naznačují, že míra proteinové syntézy regulovaná kinázou mTOR a translačními faktory je koordinována s mírou syntézy složek proteostatického aparátu řízenou HSF1.

V současnosti je intenzivně studován tzv. Ribosome quality complex (RQC) [87]. Jedná se o proteinový komplex asociovaný s ribozomy, které vykazují známky aberantního průběhu syntézy. Je tvořen komponentami RQC1, Linsterin 1 (LTN1), CDC48, TEA2 a dalšími. Vazba RQC k aberantnímu ribozomu vede k ubikvitinaci a proteazomální degradaci syntetizovaných polypeptidů a k recyklaci ribozomálních podjednotek [88]. Protein TEA2 je schopen katalyzovat prodlužování C-konce nedosyntetizovaných polypeptidů o zbytky alaninu a threoninu, což vede k aktivaci HSF1 [87,89]. Mechanizmus této aktivace prozatím není znám. Aktivita HSF1 tak není korelována pouze s mírou translace, ale také s její kvalitou monitorovanou RQC.

HSF1 – nádorově specifická funkce

Transkripční faktor HSF1 neaktivuje pouze geny zapojené do proteostatických mechanizmů, ale také řadu dalších funkčně rozmanitých genů [90,91]. V nádorech je aktivován zcela specifický transkripční program řízený HSF1 [91]. Řada promotorů stresem indukovaných genů není v nádorových buňkách obsazena HSF1. Naopak, HSF1 se v transformovaných buňkách váže k promotorovým sekvencím odlišným od těch, které jsou aktivovány při stresových podmínkách [91]. Nádorově specifický transkripční program proteinu HSF1 je pravděpodobně důsledkem odlišností v typech a míře stresů, kterým je vystavena nádorová buňka na rozdíl od buňky vystavené tepelnému šoku. Mezi geny aktivované HSF1 v nádorových buňkách patří geny zapojené v proteosyntéze (EIF4A2, RPL22), regulaci buněčného cyklu (CDC6, KNTC1, POLA2), reparaci DNA a chromatinové remodelaci (MLH1, CBX3), metabolizmu (FASN, PGK1) a úpravách mRNA (HNRNPA3, RBM23) [91]. Unikátní HSF1 transkripční program je také aktivován ve fibroblastech nádorového stromatu [92]. HSF1 ve stromálních fibroblastech řídí expresi secernovaných cytokinů TGF-β a SDF1, které stimulují růst sousedních nádorových buněk. Tyto skutečnosti ukazují, že transkripční faktor HSF1 je svou transaktivační aktivitou schopen na systémové úrovni ovlivňovat nejen fyziologické děje v nádorových buňkách, ale také ve smíšené nádorové tkáni, čímž výrazně přispívá k fenotypové plasticitě, agresivitě a rezistenci nádorů.

Závěr

„Vykonavatelské“ i „systémové“ složky mechanizmů řídících buněčnou odpověď na proteotoxický stres zastoupené molekulárními chaperony a transkripčním faktorem HSF1 reprezentují evolučně konzervovaný biologický princip, jehož původní funkcí byla reakce na nepříznivé podmínky prostředí. Proteiny HSP jsou známy už u prokaryot. Transkripční faktor HSF1 se objevil u jednobuněčných eukaryot, kvasinek. Vznik mnohobuněčných organizmů přenesl nutnost jednotlivých buněk reagovat na změny prostředí na centralizovanou, organizmální úroveň. Zdá se, že u mnohobuněčných organizmů, u člověka, nezastává osa HSF1-HSP pouze úlohu signální dráhy přežití individuálních buněk, ale koordinuje homeostázu celých tkání [92,93]. Heterogenní populace nádorových a nenádorových buněk v komplexní nádorové tkáni vystavené proměnlivým podmínkám prostředí tak pravděpodobně v deregulované podobě využívají transkripčního programu HSF1 pro své vlastní přežití nezávisle na přežití celého organizmu. Ačkoli systém HSF1-HSP představuje pro nádorovou tkáň efektivní ochranu před cytotoxickou protinádorovou léčbou, cílená a efektivní inhibice tohoto systému v nádorových buňkách by mohla inaktivovat jeden z klíčových mechanizmů vzniku progresivního nádorového onemocnění.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Filip Trčka, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: filip.trcka@mou.cz

Obdrženo: 15. 5. 2016

Přijato: 25. 5. 2016