Chaperony endoplazmatického retikula na povrchu nádorové buňky a v extracelulárním prostředí

Souhrn

Východiska:
Chaperony endoplazmatického retikula jsou stresem indukované proteiny, které mohou být translokovány mimo endoplazmatické retikulum do cytozolu, buněčné membrány, případně extracelulárního prostředí. K transportu chaperonů z endoplazmatického retikula dochází především za podmínek stresu endoplazmatického retikula, přičemž konstitutivní extracelulární exprese chaperonů byla zaznamenána u nádorových onemocnění. Chaperony endoplazmatického retikula lokalizované na povrchu buněk nebo v extracelulárním prostředí zastávají odlišné funkce ve srovnání s jejich endoplazmaticko-retikulárně rezidentní variantou, neboť se chovají jako multifunkční receptory a ovlivňují tak buněčnou signalizaci a proliferaci.

Cíl:
Předkládaná přehledová práce se zaměřuje především na expresi chaperonů endoplazmatického retikula na povrchu nádorových buněk a v extracelulárním prostředí. Popisuje možné mechanizmy translokace chaperonů endoplazmatického retikula na povrch nádorových buněk zahrnující KDEL transportní mechanizmus a retrotranslokační dráhu a dále vliv posttranslačních modifikací chaperonů na jejich lokalizaci v buňce. K nejvíce popsaným chaperonům endoplazmatického retikula detekovaným na membráně nádorových buněk patří GRP78, GRP94, kalretikulin a kalnexin, které se různým způsobem podílejí na signalizaci nádorových buněk. Pozornost je dále věnována imunogenním vlastnostem membránově lokalizovaných chaperonů, neboť tyto chaperony se mohou účastnit imunitních reakcí buněk. Prostřednictvím interakcí s toll-like receptory nebo při prezentaci antigenů se tak mohou podílet na vrozené i adaptivní imunitní odpovědi organizmu a také nádorově-specifické imunitě. Exprese chaperonů na povrchu nádorových buněk je potenciálně využitelná ve specificky cílené protinádorové léčbě, stejně tak jako při přípravě léčebných vakcín, proto je závěrečná část práce věnována tomuto tématu.

Klíčová slova:
endoplazmatické retikulum – glukózou regulované proteiny – molekulární chaperony – KDEL sekvence – imunobiologie

Úvod

Endoplazmatické retikulum (ER) a navazující Golgiho komplex je nepostradatelný buněčný aparát, ve kterém probíhá velké množství procesů vč. biosyntézy proteinů, jejich sbalení do stabilního prostorového uspořádání a následné posttranslační modifikace. Globulární proteiny se v buňkách mohou za určitých podmínek vyskytovat v nesbalené nebo jen částečně sbalené formě, a to bezprostředně po vlastní biosyntéze nebo při průchodu buněčnými membránami. K denaturaci proteinu nebo nedokonalému skládání naopak dochází za stresových podmínek, jako je vyšší teplota, změna pH nebo hypoxie. Základní ochranu buňky před  vznikem denaturovaných a agregujících proteinů zajišťují molekulární chaperony. Chaperony lze zařadit do několika vzájemně nepříbuzných rodin proteinů, které se kromě prevence vzniku amorfních proteinových agregátů podílejí i na regulaci vápníkového metabolizmu buňky. Mezi nejvíce abundantní luminální chaperony ER patří glukózou regulované proteiny (GRP), které zahrnují protein GRP78 kódovaný genem HSPA5, dále protein GRP94 kódovaný genem HSP90B1, protein GRP170 kódovaný genem HYOU1 a protein GRP75  kódovaný genem HSPA9 z rodiny proteinů teplotního šoku (heat shock proteins – HSP) a multifunkční protein kalretikulin. Molekulární chaperony se dělí do několika rodin na základě molekulové hmotnosti (pro přehlednost tab. 1). Kromě chaperonů obsahuje lumen ER množství enzymů, které se také účastní formování prostorového uspořádání proteinů. Patří mezi ně enzymy z rodiny protein disulfid izomeráz (PDI) s nejvíce zastoupenými ERP57 a PDI a skupina protein prolyl  izomeráz [1,2].

Vysoká intracelulární hladina chaperonů je typická pro většinu nádorů a je dána zvýšenou proteosyntézou a nároky na kapacitu ER u proliferujících nádorových buněk. Udržováním homeostázy ER přispívají chaperony ER k přežívání nádorových buněk a jejich proliferaci. Proteomickou analýzou bylo zjištěno, že buněčná membrána nádorových buněk obsahuje poměrně velké množství HSP a GRP [3], které jsou preferenčně exprimovány na povrchu nádorových buněk ve srovnání s buňkami zdravé tkáně (např. GRP78) [4–6]. Ukazuje se, že funkce luminálních chaperonů přesahují hranice ER a kromě skládání proteinů zahrnují i další procesy, jako je regulace proliferace, apoptóza a imunitní reakce buněk [7–10].

Lokalizace chaperonů ER

Molekulární chaperony byly dlouhou dobu považovány za typické intracelulární proteiny s charakteristickou subcelulární lokalizací. Později se ukázalo, že se vyskytují i v buněčné membráně a v extracelulárním prostoru. V současnosti je známo, že za normálních podmínek se chaperony vyskytují téměř ve všech buněčných kompartmentech, kde se podílejí na skládání nově vznikajících proteinů, jejich transportu přes membrány a také brání agregaci proteinů [11].

Chaperony ER jsou solubilní proteiny, které se v lumen ER a v organelách podél celé sekreční dráhy (cis-Golgiho aparát) účastní posttranslačních úprav proteinů. Z cis-Golgiho komplexu jsou „recyklovány“ a navraceny zpět do ER tzv. COPI (Coat protein 1) transportním systémem prostřednictvím transportních váčků. Tento mechanizmus rozpoznává ER rezidentní proteiny na základě charakteristické sekvence na C-konci obsahující aminokyseliny Lys-Asp-Glu-Leu (zkracováno KDEL) [12]. Chaperony mohou nést různé alternativy KDEL sekvence, které však mají obdobnou funkci [13]. Proteiny vybavené KDEL sekvencí nebo její alternativou se pak účastní vezikulárního transportu proteinů mezi ER, ER-Golgiho komplexem a trans-Golgiho komplexem, aniž by docházelo k jejich uvolňování ven z buňky a ztrátám. Chaperony nesoucí KDEL sekvenci jsou vychytávány pomocí KDEL receptorů přítomných v organelách sekreční dráhy a následně vraceny zpět do ER [14].  Doposud byly popsány tři typy KDEL receptorů (KDEL1, KDEL2, KDEL3), přičemž každý z nich interaguje s jedinečnými retenčními motivy chaperonů ER [13].

Přestože jsou chaperony ER aktivně zadržovány v ER, vyskytují se i v ostatních organelách, jako je buněčné jádro, mitochondrie a buněčná membrána. Mimo ER se množství chaperonů z rodiny HSP běžně nachází v cytozolu [15]. Některé z nich mohou asociovat s fosfolipidy na luminální straně buněčné membrány a asistovat při exportu proteinů z buňky [16]. V mitochondriích jsou zase nejvíce zastoupeny chaperony z rodin HSP60 a HSP70, které se zde účastní biogeneze mitochondriálních proteinů [17]. Chaperony se dále účastní transportu proteinů z cytozolu do mitochondrií a ER [18]. Jaderné chaperony se naopak podílejí na interakcích DNA s kompletně sbalenými proteiny, a to při vzniku multiproteinových komplexů v průběhu remodelace chromatinu [18]. V extracelulárním prostředí byly chaperony detekovány v extracelulární matrix a tělních tekutinách, jako je krevní sérum a moč (tab. 2) [19].

Mechanizmus translokace chaperonů ER na buněčný povrch a do extracelulárního prostoru

Mechanizmus transportu chaperonů ER nesoucích KDEL sekvenci na povrch živočišných buněk je vysvětlován několika teoriemi. Za normálních podmínek se chaperony ER dostávají do extracelulárního prostředí pomocí KDEL receptorů cestou tzv. anterográdního transportu. Za podmínek buněčného stresu tento systém naopak napomáhá zadržování chaperonů v ER-Golgiho komplexu obráceným, tzv. retrográdním způsobem, kdy jsou nároky buňky na aktivitu chaperonů ER zvýšené [20]. Dále se chaperony ER mohou směrem ven z buňky dostávat jako součást sekrečních váčků, přičemž retence pomocí KDEL receptorů je překonána z důvodu: 1. nasycení kapacity KDEL receptorů např. v důsledku stresu ER v průběhu tumorigeneze,  2. mutace v oblasti KDEL sekvence nebo KDEL receptorů [14,19], nebo 3. maskování KDEL retenčního motivu asociovaným proteinem [21]. Další způsoby, jakými mohou chaperony ER „uniknout“ z prostředí ER, zahrnují uvolňování pomocí extracelulárních váčků (případně exozomů) [22], případně za podmínek buněčného stresu to může být transport prostřednictvím tzv. retrotranslokační dráhy. Tato dráha je součástí ER-asociované degradace proteinů (ERAD), která zbavuje buňku nestabilních proteinů cestou ubikvitinace a degradace proteazomem [23]. Chaperony relokalizované tímto způsobem (např. kalretikulin) se dostávají z ER do cytozolu, avšak není zcela jasné, zdali je tato dráha současně i zdrojem membránových nebo extracelulárních variant chaperonů ER [19].

Lokalizaci chaperonů ER může kromě výše zmiňovaných transportních drah ovlivňovat také jejich posttranslační modifikace, jak je to známo u kalretikulinu. Extracelulárně se vyskytující forma kalretikulinu je glykosylovaná, naopak neglykosylovaná forma je výhradně intracelulární, neboť není schopná projít anterográdní sekreční dráhou ven z buňky [20]. Glykosylace nebo jiná modifikace tak může maskovat signální tetrapeptid KDEL a zabránit tak jeho vazbě s receptorem. U proteinu GRP78 bylo v blízkosti KDEL sekvence identifikováno potenciální glykosylační místo (Thr648) [24,25]. Současně byly popsány další odlišně lokalizované posttranslačně modifikované varianty kalretikulinu v buňce zahrnující arginylovanou formu na buněčné membráně a v cytozolu [26] a citrullinovanou formu související s imunitní aktivitou u revmatoidní artritidy [27,28].

Imunogenní vlastnosti  chaperonů ER

Chaperony ER se mohou díky lokalizaci do buněčné membrány nebo extracelulárního prostředí přímo podílet na modulaci imunitní odpovědi buněk [29]. Imunogenní vlastnosti extracelulárních chaperonů ER jsou spjaté s proteiny, které se na povrchu buňky chovají jako „signál označující nebezpečí“ a jsou schopné interagovat s receptory buněk imunitního systému. Je známo, že extracelulární chaperony, jako jsou HSP27, HSP60, HSP70, GRP94, HSP90 nebo GRP170, se mohou vázat s TLR (toll like receptor) receptory, které jsou obvykle exprimovány dendritickými buňkami a makrofágy, a tudíž se účastní vrozené imunitní odpovědi organizmu [29]. Jako chaperony ER schopné aktivovat imunitní systém na povrchu buňky nebo v extracelulárním prostředí byly popsány kalretikulin, GRP78 a GRP94 [30–34]. Kromě toho je známo, že GRP96 je schopný aktivovat nádorově-specifickou imunitu [35].

GRP94 a GRP170 se podílejí na prezentaci antigenu a jejich sekretované formy jsou schopné vyvolat vrozenou a adaptivní imunitní odpověď [2]. Na základě výše uvedených vlastností se vybrané chaperony ER ukazují jako potenciálně vhodné cíle pro vývoj protinádorových léčebných vakcín.

Chaperony ER na povrchu nádorových buněk

ER je jednou z klíčových organel pro udržení stavu buněčné homeostázy. Pokud jsou funkce ER narušeny v důsledku nedostatku živin, hypoxie, změn v metabolizmu vápníku, změn v oxido-redukční rovnováze nebo změn v hodnotě pH, dochází ke stresu ER a následnému hromadění nesbalených nebo špatně sbalených proteinů.

V mikroprostředí nádoru jsou buňky vystaveny stresu ER v důsledku změn buněčného metabolizmu na mnoha úrovních. Na tyto podmínky pak reagují mimo jiné i extracelulární expresí chaperonů ER.

GRP78/BiP

Jedním z nejlépe popsaných chaperonů ER je GRP78 (BiP). GRP78 patří do rodiny HSP70 a je považován za hlavní chaperon ER, který zprostředkovává skládání proteinů vč. jejich kontroly, účastní se vápníkového metabolizmu udržováním jeho homeostázy a podílí se na signalizaci během stresu ER. V prostředí nádoru nebo za podmínek stresu ER je exprese GRP78 výrazně indukovaná. GRP78 byl kromě ER detekován také na membráně nádorových buněk, přičemž buňky zdravé tkáně povrchový GRP78 normálně neexprimují. Mechanizmus, kterým se GRP78 dostává na povrch, nebyl doposud přesně popsán. K relokalizaci dochází pravděpodobně v důsledku přesycení kapacity retenčního systému ER, nebo je GRP78 transportován společně s klientními proteiny (může se jednat o adaptivní mechanizmus nádorových buněk). Povrchový GRP78 má také zcela jiné funkce než jeho ER varianta, protože se chová jako multifunkční receptor, jehož aktivovaná forma podporuje nádorové bujení. GRP78 je schopný vázat α2-makroglobulin a podporovat tak proliferaci, přežívání a metastazování nádorových buněk [36–38]. Interakce s α2-makroglobulinem dále vede k aktivaci signálních kaskád ERK1/2, p38 MAPK, Akt, PI3K a NF-κB [37,39–42]. Kromě výše uvedeného může GRP78 membránový receptor jako povrchový protein podporovat tvorbu autoprotilátek, které mají vlastnosti agonistické s α2-makroglobulinem a po interakci s receptorem vedou k indukci proliferace nádorových buněk [43,44].

GRP94/Gp96

GRP94 je nejvíce abundantním proteinem ER a podobně jako u GRP78 jeho zvýšená exprese souvisí s nádorovou transformací [45]. Jako chaperon ER nese C-koncový ER retenční peptid KDEL, který však nefunguje absolutně. Z toho důvodu byl GRP94 detekován i na membráně nádorových buněk a v extracelulární tekutině (pankreatické šťávě) [46–48]. Jeho funkce na membráně však není zcela jasná, ale je známo, že GRP94 je schopný aktivovat dendritické buňky a nádorově specifické T buňky [49].

Kalretikulin a kalnexin

Kalretikulin je vysoce konzervovaný chaperon ER, který ačkoliv je majoritně lokalizován do ER, vykazuje množství dalších intra- i extracelulárních lokalizací. V ER je jeho hlavní úlohou asistovat společně se svým homologem kalnexinem při skládání a kontrole nově syntetizovaných glykoproteinů. Povrchově lokalizovaný kalretikulin má různé funkce, které zahrnují podporu rozpadu fokálních adhezí a migrace [50,51], dále zprostředkování fagocytózy umírajících nádorových buněk [52–54]. Kalnexin patří stejně jako kalretikulin mezi proteiny ER detekované na buněčné membráně. Funkcí povrchově lokalizovaného kalnexinu je zřejmě modulace adhezivních vlastností a integrinem řízené buněčné signalizace [55].

Extracelulární HSP70 a HSP90

Přestože HSP70 a HSP90 nejsou chaperony ER, uvádíme je zde z toho důvodu, že jejich extra- i intracelulární funkce jsou poměrně dobře popsány a současně se jedná o homology ER rezidentních chaperonů (GRP78, GRP94), které jsou nádorovými buňkami uvolňovány.

HSP70

Členové rodiny HSP70 asistují při skládání nascentních proteinů a jsou důležitou součástí procesů zajišťujících buněčnou homeostázu. V nádorových buňkách je exprese HSP70 často zvýšena a koreluje s horší prognózou onemocnění [56]. Extracelulární HSP70 se vyskytuje jako solubilní protein, dále potom v komplexu s antigenními peptidy nebo jako součást exozomů. Tyto odlišné varianty interagují s povrchovými receptory nádorových buněk, buněk imunitního systému, endotelovými a epitelovými buňkami.  Extracelulární HSP70 v komplexu s nádorovými peptidy interaguje s receptory na povrchu antigen-prezentujících buněk (CD91, SREC-1) [57,58] a je schopný aktivovat NK buňky [37]. Samotný extracelulární HSP70 spouští nespecifické imunitní reakce (signalizace prostřednictvím aktivace TLR2/4 receptoru) [58], ovlivňuje invazivitu nádorových buněk regulací aktivity matrix-metaloproteázy [59] a aktivací zánětlivého mikroprostředí (produkce reaktivních kyslíkových radikálů) [60].

HSP90

HSP90 je vysoce exprimovaný chaperon, který ovlivňuje funkci a stabilitu velkého množství klientních proteinů. V jaderných buňkách obratlovců se vyskytuje ve dvou cytozolárních variantách – HSP90α a HSP90β. HSP90 se ve zdravých buňkách za fyziologických podmínek vyskytuje nejčastěji v cytoplazmě, malá frakce je přítomna také v jádře.

V klidovém stavu buňky HSP90 extracelulárně neuvolňují, ačkoliv k jeho sekreci dochází v důsledku stresových podmínek, jako je hypoxie, hladovění, virová infekce, γ-záření nebo v přítomnost reaktivních kyslíkových radikálů [61–65]. Naopak nádorové buňky vykazují konstitutivní extracelulární expresi HSP90, obzvlášť v případě nádorů s abnormálně vysokou expresí HIF-1α [66]. Mezi popsané buněčné regulátory sekrece HSP90 patří nádorový supresor p53, HIF-1α a ubikvitin ligáza Hectd1 [65].

HSP90 nenese sekreční signální peptid a je uvolňovaný z buněk prostřednictvím exozomální sekreční dráhy [67]. Jeho hlavní funkcí je podpora motility a nádorové progrese, za což je odpovědný 115 aminokyselin dlouhý peptid (aminokyseliny 236-350) na povrchu proteinu. Mezi extracelulární interakční partnery HSP90 patří HER2 receptor, matrix metaloproteázy, LRP-1 [68].

HSP90 byl podobně jako i další HSP proteiny detekován jako molekula cirkulující v krvi. Zvýšené hladiny plazmatického HSP90α byly popsány u pacientů s karcinomem prsu, plic, pankreatu a jater. Přesto diagnostický význam detekce HSP90 v krvi zatím není zcela jednoznačný [66].

Povrchové a extracelulární chaperony ER a protinádorová léčba

Preferenční exprese GRP78 na povrchu nádorových buněk umožňuje využití specificky cílené protinádorové léčby s minimálním nežádoucím účinkem na zdravé buňky. Potenciálním cílem této léčby jsou současně podpůrné buňky nádorové tkáně, na jejichž povrchu byl GRP78 také identifikován [2]. Léčebné strategie zaměřené na GRP78 využívají např. peptidových ligandů konjugovaných s cytotoxickým agens. Aplikace specifické IgG monoklonální protilátky (Mab159) spouští endocytózu a degradaci povrchového GRP78 a současně apoptózu nádorových buněk (xenograftů karcinomu plic, tlustého střeva, metastáz karcinomu prsu a melanomu) prostřednictvím inhibice PI3K signalizace [39]. Tato protilátka je potenciálně využitelná pro in vivo zobrazování při výběru vhodného pacienta pro léčbu protinádorovou Mab159 protilátkou nebo pro sledování progrese onemocnění a odpovědi na léčbu.

Další léčebnou strategií je protinádorová vakcinace, která umožňuje personalizovanou léčbu pacientů s nádorovým onemocněním. Doposud bylo testováno využití autologního sekrečního fúzního proteinu GRP94 s nádorovými antigenními peptidy. Tato vakcína měla na myších modelech antiproliferativní a antimetastatický efekt, avšak v klinických testech byl její imunogenní účinek velmi variabilní [69–71]. Využití GRP170 fúzního proteinu s plnodélkovými antigeny se ukázalo jako efektivní při léčbě nádorů prostaty na myších modelech [72]. Aktivace dendritických buněk a protinádorová imunitní odpověď byla posílena při syntéze fúzního proteinu GRP170 s NF-κB aktivující doménou bakteriálního proteinu flagelinu u metastazujících nádorů u myší [73].

Závěr

Hlavní složky extracelulárního prostředí zahrnují metaloproteázy a signální molekuly extracelulárního prostředí s jejich receptory. Z pohledu nádorové biologie mohou extracelulární chaperony působit jako na membránu vázané proteiny, které interakcí s povrchovými receptory spouštějí intracelulární signalizaci. Jako extracelulární solubilní proteiny interagují se složkami extracelulární matrix a podporují tak metastazování a invazivitu nádorů. Současně mohou sloužit jako onkogenní proteiny aktivní v mezibuněčné komunikaci. Obecně tedy mohou chaperony ER hrát dvojí biologickou a imunologickou roli, která vychází především z jejich buněčné lokalizace. Intracelulární chaperony ER mají ochrannou funkci podporující přežití nádorových buněk za nepříznivých podmínek, zatímco na membránu vázané a extracelulární chaperony ER usnadňují imunologické rozpoznání nádorových buněk a jejich  likvidaci.

Přes značné množství odborných prací stále zůstávají nezodpovězené otázky ohledně mechanizmu exportu chaperonů ER do extracelulárního prostředí nádoru a jejich přesné extracelulární funkce. Je však zřejmé, že chaperony ovlivňují jak samotné nádorové buňky, tak i nádorové mikroprostředí. Jako stresem indukované proteiny mohou přispívat k tumorigenezi a lékové rezistenci, ale současně díky možnosti své specifické inhibice jsou zároveň i nadějnými cíli protinádorové terapie.

Práce byla podpořena projektem MŠMT – NPU I – LO1413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Veronika Brychtová, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: vebrychtova@mou.cz

Obdrženo: 17. 5. 2016

Přijato: 20. 7. 2016