Biologické účinky oxidu uhelnatého

Souhrn

Oxid uhelnatý (CO) je znám především jako životu nebezpečný produkt nedokonalého spalování organických látek s vysokou afinitou k hemoglobinu. CO je však ve velmi nízkých koncentracích produkován i endogenně, a to při degradaci hemu. Výzkumy z posledních let jasně ukázaly, že CO, podobně jako oxid dusnatý nebo sirovodík, je významnou signální molekulou podílející se na regulaci řady fyziologických i patofyziologických procesů v organismu a lze jej využít terapeuticky. Inhalační podání CO má své limity, proto je snaha vyvinout alternativní způsob jeho doručení do cílových tkání. Jednou z možností jsou molekuly uvolňující oxid uhelnatý, tzv. CORM (carbon monoxide releasing molecules). Tento souhrnný článek se zaměřuje na možnosti využití CO v terapii zánětu a onemocnění jater.

Klíčová slova:

oxid uhelnatý, zánět, CORM, játra.

Metabolismus oxidu uhelnatého

Oxid uhelnatý (CO), bezbarvý plyn bez chuti a zápachu, byl do 90. let minulého století považován pouze za toxický polutant vznikající nedokonalým spalováním sloučenin na bázi uhlíku (dřevo, uhlí, ropa, tabák atd.). Hlavní příčinou jeho toxicity je silná afinita k hemoglobinu, která je 210 – 250x vyšší než u kyslíku. Po inhalaci CO dochází ke vzniku karbonylhemoglobinu (COHb) a následnému snížení arteriálního obsahu a tkáňového parciálního tlaku kyslíku vedoucímu ke tkáňové hypoxii. Otrava CO však působí i přímé buněčné změny řadou dalších mechanismů, mezi které patří například vazba na intracelulární hemoproteiny, tvorba NO a peroxynitritu, lipoperoxidace, mitochondriální oxidační stres, apoptóza a zánětlivé poškození [1]. Průměrné fyziologické koncentrace COHb v krvi jsou dle WHO 0,5-1,5 %, přičemž by neměly překročit 8 % [2]. Toxicita CO však nezáleží pouze na obsahu CO v cirkulaci, ale také na délce expozice, množství hemoglobinu atd. [1].

Ke změně ve vnímání CO došlo v roce 1993, kdy Verma a spol. objevili, že oxid uhelnatý funguje jako neurotransmiter [3]. CO se tak zařadil do skupiny tzv. gasotransmiterů, malých plynných molekul se specifickými signalizačními účinky v organismu, mezi které patří i oxid dusnatý nebo sirovodík. Fakt, že CO by mohl být produkován endogenně, popsal již v roce 1949 Torgny Sjostrand [4]. O necelých dvacet let později Raimo Tenhunenem z laboratoře Rudi Schmida objevil, že CO vzniká během rozkladu hemu v reakci katalyzované mikrozomální hemoxygenasou (HMOX). HMOX je enzym třídy oxidoreduktas, který katalyzuje první a rychlost limitující krok při degradaci hemu. Štěpením hemu na alfa-methinovém můstku dochází k uvolnění CO, železnatého iontu a biliverdinu, který je následně enzymem biliverdinreduktasou přeměňován na bilirubin [5] (obr. 1). Doposud byly popsány dvě katalyticky funkční izoformy HMOX, a to vysoce inducibilní HMOX1 a konstitutivně exprimovaná HMOX2 [6].

Recentní studie prokázaly, že CO ovlivňuje prostřednictvím vazby na hemové proteiny, především rozpustnou guanylát cyklasu (sGC), cytochromy p450, cytochrom c oxidasu nebo inducibilní NO synthasu, některé intracelulární signalizační dráhy, které vykazují protizánětlivé, antiapoptotické, antiproliferační a antikoagulační působení. Jedním z mechanismů je aktivace sGC, jež za normálních podmínek reguluje produkci oxidu dusnatého. Vazba CO na sGC vede k přeměně GTP na cGMP, který funguje jako druhý posel hrající důležitou úlohu v řadě fyziologických procesů, jako jsou agregace trombocytů, fibrinolýza, regulace buněčného cyklu nebo neurotransmise [7]. Podobně jako oxid dusnatý a sirovodík působí vasodilatačně a udržuje bazální průtok krve orgány [8]. CO však může ovlivňovat řadu signálních kaskád i přímo, například mitogeny aktivované proteinkinasy (MAPK) podílející se mimo jiné na buněčném růstu a regulaci zánětlivé odpovědi [7] (obr. 2). Dalším z klíčových cílů působení CO jsou např. mitochondrie, buněčné organely zodpovědné za energetický metabolismus buňky. V závislosti na koncentraci může CO měnit mitochondriální membránový potenciál, tvorbu mitochondriálních kyslíkových reaktivních částic, uvolňování prozánětlivých a proapoptotických mediátorů nebo stejně jako oxid dusnatý a při vyšších koncentracích sirovodík inhibovat buněčnou respiraci vazbou na cytochrom c oxidasu [8, 9].

Protizánětlivé účinky CO

Mechanismy doprovázející zánětlivou odpověď zahrnují celou řadu buněčných typů, signalizačních drah a transkripčních faktorů [10]. Důležitou funkci zde hraje i enzym HMOX1. Poprvé popsal roli HMOX1 v zánětu ve své práci Willis et al., který zjistil, že zvýšení exprese HMOX1 vede k potlačení zánětlivé odpovědi, zatímco její inhibice zánětlivou odpověď potencuje [11]. Protizánětlivé účinky byly popsány u produktů HMOX reakce, a to jak biliverdinu a bilirubinu, tak CO. Jeden z mechanismů, kterým se CO podílí na protizánětlivé odpovědi, popsal ve své práci Leo Otterbein na modelu sepse u myších makrofágů [12]. Exogenní podávání CO vedlo k potlačení exprese prozánětlivých cytokinů (TNFα, IL-1β apod.) a zároveň zvýšení exprese protizánětlivého cytokinu IL-10. Tyto účinky byly zprostředkovány přes MAP kinasovou signalizační dráhu, konkrétně přes MKK/p38 MAPK. Přesný mechanismus, kterým CO moduluje tuto dráhu, však dosud není znám. Mezi MAP kinasami doposud nebyl nalezen žádný protein, který by obsahoval hemovou strukturu, na kterou se běžně CO váže [13].

Nepostradatelnou roli v protizánětlivé funkci CO hraje rovněž Nrf2 (nuclear factor erythroid 2- related factor 2). Jak ukázala čínská studie Qin et al. na Nrf2 deficientních myších, exogenní aplikace CO snížila expresi prozánětlivých cytokinů a mortalitu u LPS-indukované sepse pouze u myší s aktivním Nrf2 faktorem [14].

Výsledky řady studií naznačují, že by CO mohl vykazovat imunomodulační účinky, a to díky schopnosti ovlivňovat funkci CD4⁺CD25⁺ regulačních T buněk (Treg). Treg jsou populací CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ T lymfocytů, hrají významnou roli v regulaci imunitní odpovědi a podílejí se na regulaci imunitní homeostázy a prevenci rozvoje autoimunitních reakcí. Vznik, vývoj a správné fungování Treg jsou závislé na expresi transkripčního faktoru Foxp3 [15]. Indukce HMOX1 je spojována se zvýšenou produkcí CD4⁺CD25⁺ Treg buněk a zároveň s potlačením zánětlivé odpovědi v dýchacím systému u alergiků [16].

HMOX1/CO dráha rovněž prokazatelně mění rovnováhu exprese prozánětlivých a protizánětlivých cytokinů ve střevě. U modelu chronického střevního zánětu u myší dochází vlivem zvýšených hladin interferonu-γ k poškození střevní sliznice a také ke snížení exprese HMOX1 v makrofázích. Aplikace CO inhibuje produkci interferonu-γ, normalizuje expresi HMOX1 a snižuje závažnost poškození střeva [17].

Hepatoprotektivní účinky CO

CO se významným způsobem podílí na funkci jater a jejich ochraně a hraje důležitou roli jak při fyziologickém jaterním metabolismu, tak i patologických procesech. CO funguje jako regulátor kontraktility žlučových kanálků [18], ovlivňuje jaterní perfuzi [19] a je nezastupitelným faktorem pro udržení rovnováhy mezi sinusoidálním a biliárním transportem v hepatocytu [20]. Zároveň stimuluje MRP2-dependentní exkreci bilirubinu do žluče přímým ovlivněním K⁺ kanálů [21].

Jednou z hlavních příčin chronických jaterních onemocnění je alkoholové poškození jater. Jeho hlavními znaky jsou zánět a hepatocelulární poškození. CO díky svým protizánětlivým účinkům redukuje produkci prozánětlivých cytokinů na úrovni Kupfferových buněk a zároveň chrání jaterní buňky před apoptózou. Hepatocyty jsou během expozice ethanolu senzitivní na apoptózu indukovanou TNFα. Díky působení CO jsou následky působení alkoholu zmírněny. Jedním z mechanismů je aktivace NF-κB a následná exprese NF-κB dependentních antiapoptotických genů [22].

CO jsou připisovány rovněž anticholestatické účinky. Naše skupina prokázala protektivní účinek CO u cholestázy indukované lipopolysacharidem u potkanů. Inhalace 250 ppm CO po dobu jedné hodiny před aplikací LPS měla za následek snížení sérových cholestatických markerů, snížení exprese prozánětlivého cytokinu TNFα, zvýšení protizánětlivého IL-10 a zároveň zabránila snížení exprese klíčových jaterních transportérů (Slc10a1, Abcb11 a Abcc2) [23].

Jednou z dalších možných aplikací CO u jaterních onemocnění je terapie nealkoholické steatohepatitidy (NASH). Inhalace 250 ppm CO po dobu dvou hodin denně indukovala expresi sestrinu-2, který zvýšil aktivaci autofágů a snížil intrahepatální akumulaci lipidů a stupeň zánětu u myší s NASH [24]. Recentní studie rovněž poukazují na možnou úlohu CO u metabolického syndromu. Ve studii na myších, kterým byla podávána vysokotuková dieta, zvýšila inhalace CO expresi růstového faktoru fibroblastů (FGF21), významného endogenního hormonu, který se podílí na regulaci glukózové homeostázy. Zároveň bylo pozorováno zlepšení stupně jaterní steatózy, snížení inzulinové rezistence a hladiny triacylglycerolů v séru [25].

Molekuly uvolňující oxid uhelnatý

Biologické účinky oxidu uhelnatého jsou studovány od roku 1993 zejména s využitím inhalačního podání plynného CO. Nicméně po inhalaci je většina CO navázána na hemoglobin, což přináší z hlediska terapie značná rizika a zároveň se do cílových tkání dostane pouze zlomek inhalovaného CO [23]. Proto se hledaly cesty, jak dopravovat CO do tkání takovým způsobem, aby se snížila jeho vazba na hemoglobin, a tak se zabránilo tkáňové hypoxii a dalším vedlejším účinkům. Inspirací pro tento výzkum byla plynná molekula oxidu dusnatého a její aplikace ve formě nitroglycerinu. Alternativou pro využití plynného CO jsou tzv. molekuly uvolňující oxid uhelnatý (CO-releasing molecules, CORM) (Tabulka 1), které jsou v posledních letech vyvíjeny jako experimentální terapeutika. Jejich hlavní výhodou je, že dokáží cíleně dopravit CO přímo do tkání, a tím snížit jeho vazbu na hemoglobin.

Prvním syntetizovaným CORM byl dekakarbonyl manganatý (CORM-1). Jeho nevýhodou byla ale nutnost stimulace světlem a nefyziologické pH pro uvolnění CO. Prvními CORM uvolňujícími CO při fyziologickém pH byly molekuly na bázi ruthenia, a to CORM-2 a CORM-3 [26, 27]. Zatímco CORM-2 má hydrofobní páteř, CORM-3 je ve vodě rozpustný a uvolňuje CO ve tkáních s poločasem rozpadu do 1 minuty. Později byl vyroben ve vodě rozpustný CORM-A1 na bázi bóru, který uvolňuje CO po změně pH s poločasem 21 minut a částečně tak simuluje inhalační podání [28].

Několik let po prvních sloučeninách byly syntetizovány CORM na bázi molybdenu (ALF186 a ALF 062). Vykazovaly nižší toxicitu a delší poločas v aerobních i anaerobních podmínkách. Nevýhodou byla značná produkce COHb, nerozpustnost ve vodě a nestabilita [29]. Jako velice zajímavá se jeví nová generace CORM bez přechodných kovů, které jsou založeny například na bázi bóru, tzv. BODIPY. Tyto molekuly se aktivují světlem v blízké infračervené oblasti procházejícím biologickými tkáněmi. Fluorescenční povaha těchto molekul umožňuje simultánní in vivo zobrazování pro studium lokalizace působení. Hlavní výhodou těchto BODIPY molekul je možnost ovlivnění jejich fyzikálně chemických vlastností pomocí modifikace struktur, a tím dosažení lepších optických vlastností a rozpustnosti ve vodě a zároveň možnost regulace uvolňování CO pomocí světla [30]. Nedávno publikovala skupina ze Spojených států novou verzi CORM na bázi flavonolu uvolňující CO po aktivaci viditelným světlem [31]. Výhodou flavonoidních sloučenin je jejich schopnost ovlivnit metabolismus bilirubinu a antioxidační působení [32]. Výzkum vlastností této molekuly je sice pouze v začátcích, nicméně molekula, která v sobě kombinuje vlastnosti flavonoidních sloučenin a zároveň uvolňuje CO, bude zcela jistě zajímavým nástrojem pro terapii řady onemocnění asociovaných s oxidačním stresem [31, 32].

Terapeutické využití CO

Přesvědčivé výsledky studií poukazujících na důležitou roli CO v regulaci klíčových intracelulárních signalizačních kaskád vedly vědce k úvahám o možném využití této molekuly v klinické praxi. Jak bylo ukázáno výše, CO prokázal své protektivní vlastnosti zejména při studiu terapie systémového zánětu, jaterních a zánětlivých střevních onemocnění, ale například i u nádorového bujení [8] nebo u ischemicko – reperfúzního poškození tkání a transplantací orgánů [33]. Proto je zde snaha posunout terapeutické využití inhalace CO směrem ke klinické praxi. Předchozí klinické studie prokázaly relativní bezpečnost inhalace nízkých koncentrací CO u lidí. V randomizované, dvojitě zaslepené placebem kontrolované studii byla zdravým dobrovolníkům navozena endotoxemie aplikací 2 ng/kg LPS. Následně inhalovali 500 ppm CO po dobu jedné hodiny. Za těchto podmínek nedošlo k modulaci zánětlivé odpovědi pomocí CO, ovšem nebyly zároveň pozorovány žádné nežádoucí účinky spojené s inhalací CO [34]. Další klinická studie fáze IIa zkoumala bezpečnost inhalace CO u pacientů s chronickou obstrukční plicní nemocí. U této skupiny pacientů nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky terapie CO, naopak bylo prokázáno zlepšení odpovědi na léčbu metacholinem a trend redukce eosinofilů ve sputu [35]. Aktuálně probíhá ve Spojených státech studie zaměřená na bezpečnost použití CO pro terapii akutní respirační insuficience (NCT02425579). Obecným výstupem dosud ukončených studií (fáze I a II) je bezpečnost inhalace CO jakožto terapeutického prostředku.

Závěr

CO je významná signální molekula hrající důležitou roli v regulaci řady fyziologických a patofyziologických dějů. Výsledky studií z posledních let ukazují, že nejvyšší potenciál pro využití CO je u terapie zánětu a onemocnění asociovaných s oxidačním stresem. Léčba pomocí CO potlačuje v buňkách prozánětlivou odpověď a zároveň zvyšuje protizánětlivý IL-10. Nezanedbatelná je rovněž jeho hepatoprotektivní úloha. CO se za fyziologických podmínek podílí na regulaci kontraktility žlučových kanálků a jaterní perfuze. Z farmakoterapeu-tického pohledu je aktuálně k dispozici pouze inhalační léčba, ta má ovšem řadu limitací včetně nerovnoměrné distribuce v organismu. Cílené doručení do specifických tkání by signifikantně zvýšilo terapeutický potenciál CO a napomohlo k lepší modulaci patologických stavů. Nové CORM jsou stále ve vývoji a je pouze otázkou času, kdy přijde taková molekula, která bude splňovat přísná kritéria pro možné využití v humánní medicíně.

Střet zájmů: autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

Práce byla podpořena granty Univerzity Karlovy GAUK 337817 a Grantové agentury České republiky GAČR 16-06008S.

Do redakce došlo: 10. 8. 2018

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Lucie Muchová, Ph.D.

Laboratoř pro výzkum nemocí jater a metabolismu hemu

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky

1. LF UK

Na Bojišti 3

121 08 Praha 2

lucie.muchova@lf1.cuni.cz