Abstrakta přednášek

B1-1

Kam směřuje HPLC: klinické pohledy

Vecka M., Staňková B.

IV. interní klinika 1. LF UK a VFN v Praze; CVL ÚLBLD 1. LF UK a VFN v Praze

marek.vecka@lf1.cuni.cz

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) je v analytické praxi zavedena jako citlivá a spolehlivá separační technika, která našla své místo i v rutinní praxi. V 70. letech minulého století první použitelný HPLC systém stanovoval glykovaný hemoglobin, následovaly analýzy např. katecholaminů, karbohydrát-deficientního transferinu (CDT) nebo aplikace pro stanovení ně-kterých vitamínů. Spektrum takto běžně dostupných vyšetření v klinických laboratořích se v poslední době neustále rozšiřuje, navíc jako každá metodika, i klinické HPLC platformy se snaží nezaostávat za posledním vývojem v této oblasti. Potřeba miniaturizace systémů a snižování spotřeby rozpouštědel si postupně vynucují přechod k vysokotlakým UHPLC přístrojům, kterým postačují i menší objemy vzorků. Používané detekční systémy doznaly v posledních desetiletích také výrazných změn. Jednoduchou spektrofotometrickou detekci vystřídaly diode-array detektory a další založené na jiných fyzikálních principech. Spojení HPLC (UHPLC) s MS, MS/MS detektory představuje velmi robustní a mocný nástroj v rukách analytického chemika; omezení implementace této metody do klinické laboratoře se daří v poslední době překonávat stále se rozšiřující komerční dostupností kitů pro stanovení klinicky zajímavých analytů. Další rozvoj v této oblasti, který ještě není předmětem zájmu biochemické praxe, zahrnuje spojení HPLC s nukleární magnetickou rezonancí (NMR), nebo multidimenzionální HPLC. Tyto postupy jsou hlavně výsadou metabonomických přístupů, jež budou zcela určitě tvořit část analytického portfolia klinické laboratoře v nepříliš vzdálené budoucnosti.

Práce byla podpořena projekty RVO-VFN 64165 a PRVOUK P25/LF1/2.

B1-2

Přínos komparativní genomové hybridizace na mikročipu v cytogenetické analýze

Lhotská H., Zemanová Z., Svobodová K., Nováková M., Lizcová L., Michalová K.

Centrum nádorové cytogenetiky,1. LF UK a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze

halka.lhotska@vfn.cz

Cytogenetika je vědecký obor, který se zabývá studiem chromosomů a zejména jejich strukturními a početními změnami. K tomuto účelu se používají různé cytogenetické metody, např. konvenční karyotypování G-pruhovaných chromosomů, fluorescenční in situ hybridizace (FISH) a její různé modifikace. Tyto metody umožňují detekovat strukturní a početní chromosomové aberace a jejich rozlišovací schopnost se pohybuje v rozmezí 5 - 10 Mb pro konvenční karyotypování a 100 Kb u interfázní FISH. Nejsou však schopné mapovat chromosomové změny na úrovni jednotlivých exonů či intronů genů. Tuto možnost přináší metoda komparativní genomové hybridizace na mikročipu (aCGH), která umožňuje odlišit kvantitativní změny genetického materiálu od běžného diploidního uspořádání genomu. Princip metody je založen na hybridizaci celogenomové DNA izolované z testované tkáně a normální referenční DNA k cílovým sekvencím fixovaným na mikročipu. Na základě jejich srovnání lze zjistit, zdali v případě vzorku DNA odebraného z testované tkáně nedošlo ke ztrátám či ziskům genů, celých chromosomů nebo jejich částí a přesně určit zlomová místa na chromosomech a to až na úroveň exonů. Rozlišovací schopnost této metody je závislá na množství cílových sekvencí. Standardně umožnuje detekovat změnu velkou 60 Kb. Analýza chromosomových aberací v nádorových buňkách přispívá ke stanovení diagnózy a upřesnění prognózy různých typů nádorových onemocnění. Na vybraných příkladech nemocných s hematologickými malignitami, vyšetřenými na našem pracovišti, bude demonstrován přínos aCGH v cytogenetické analýze onemocnění, obzvláště v kombinaci s dalšími molekulárně cytogenetickými metodami.

Práce byla podpořena granty RVO-VFN64165/2012, GACR P302/12G157/1 a PRVOUK-P27/LF1/1.

B1-3

Klíčová role hmotnostní spektrometrie v toxikologické analýze

Haklová L., Mžik M., Voříšek V.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky, FN Hradec Králové

LHaklova@seznam.cz

Hmotnostní nebo přesněji hmotová spektrometrie (MS) je fyzikálně chemická metoda k určení poměru hmotnosti a náboje atomů, molekul a jejich částí po jejich převedení na kladně a záporně nabité ionty. Těžištěm organické hmotové spektrometrie je především analýza organických látek s důrazem na zjištění jejich struktury, popřípadě přesné molekulové hmotnosti. Tandemové spojení hmotnostního spektrometru se separačními metodami (zejména s kapalinovou a plynovou chromatografií) výrazně zvyšuje selektivitu a umožňuje analyzovat látky ve složité biologické matrici. Toho se s výhodou využívá v toxikologické analýze, kde hmotnostní spektrometrie navazuje na imunochemické a chromatografické metody a vystupuje jako konfirmační metoda pro jednoznačnou identifikaci a případnou kvantifikaci neznámé noxy. Díky vysoké specifitě lze hmotnostní spektrometrii s výhodou využít i pro samostatný screening často bez nutnosti složité úpravy biologického materiálu. Vysoká citlivost metody umožňuje kvantifikaci i stopových množství látek, což se využívá především v analýze návykových a psychotropních látek nebo vysoce účinných léčiv.

B2-1

Management kvality ve zdravotnických laboratořích

Bartoš V.

FN Ostrava, ÚLD, Oddělení klinické biochemie

vladimir.bartos@fno.cz

Požadavek na poskytování kvalitních výsledků práce je dnes považován za prioritní požadavek provázející jakoukoliv lidskou činnost. V tomto kontextu je Management kvality dnes již neodkladnou součástí práce v klinické laboratoři, samozřejmě vedle odborných činností spojených s měřením různých veličin důležitých pro posuzování zdravotního stavu pacientů. Aby mohl být takovýto způsob managementu účelně uplatňován a především, aby byl funkční, je třeba v laboratoři nastavit celou řadu prvků, uvést je do vzájemných souvislostí a vydefinovat jejich vztahy a zodpovědnosti na výsledné kvalitě. Jinými slovy to znamená zavést systém managementu kvality (SMK), sloužící k reálnému zabezpečování kvality služeb poskytovaných zdravotnickou laboratoří. Nejdůležitějšími prvky SMK v laboratoři jsou především:

• vedení laboratoře, schopné definovat hlavní směry v úsilí o celkovou kvalitu,
• znalosti pracovníků týkající se fungování zavedeného SMK,
• laboratorní prostředí vyhovující specifickým požadavkům na prováděná vyšetření,
• vhodná technické zařízení,
• kvalifikovaný, vyškolený a zkušený personál s plánovaným osobním rozvojem,
• používaní přesně popsaných (dokumentovaných) a validovaných analytických metod se zajištěnou metrologickou návazností,
• stanovené kontrolní postupy aplikované při měření,
• pravidelné prověřování SMK.

Ve sdělení je věnována pozornost také obvyklým způsobům hodnocení a prezentování péče o kvalitu navenek, zejména obecně akceptovaným způsobům poskytování průkazu o odpovídající péči o kvalitu v laboratoři. V souladu s vyjádřeními odborných společností jsou dnes za takovýto průkaz považovány:

• potvrzení způsobilosti laboratoře cestou akreditace Českým institutem pro akreditaci (ČIA);
• absolvování auditů prováděných Národním autorizačním střediskem pro klinické laboratoře (NASKL).

B2-2

Kontrola kvality v hematologické laboratoři

Bílovská M., Bartoš. V

Oddělení klinické hematologie, Ústav laboratorní diagnostiky, Fakultní nemocnice Ostrava; Oddělení klinické biochemie, Ústav laboratorní diagnostiky, Fakultní nemocnice Ostrava

magda.bilovska@fno.cz

Nutnost provádění pravidelné systematické kontroly kvality měření je neoddiskutovatelnou součástí komplexního zabezpečení kvality práce, a tedy i zavedeného systému managementu kvality v každé zdravotnické laboratoři. Základem správně prováděných kontrolních procesů je pak důsledné dodržování nastavených pravidel. Správné nastavení a realizace kontrolních procesů vede ke zvýšení spolehlivosti výsledků laboratorních vyšetření a ve svém důsledku nejen k větší jistotě laboratorních pracovníků při vydávání výsledků, ale také ke zvýšení důvěry ordinujících lékařů v jejich správnost. Provádění kontroly kvality v hematologické laboratoři vychází z doporučení laboratorní sekce České hematologické společnosti. Jelikož řada výkonů odbornosti klinické hematologie je v rámci jejich sdílení realizována běžně i na pracovištích odbornosti klinické biochemie, je třeba, aby i na těchto pracovištích byly dodržovány zásady uvedené v tomto doporučení. Toto sdělení je zaměřeno na jednotlivé oblasti kontroly kvality v hematologické laboratoři, které zahrnuje sledování a eliminaci neanalytických chyb a vlivů, vnitřní a externí kontrolu kvality.

B2-3

Plánování a provádění interních auditů v MZ-BIOCHEM

Vaňková L., Slačálková J.

MZ-Biochem, Poliklinika sv. Alžběty, Uherské Hradiště; MZ-Biochem, Městská nemocnice s poliklinikou, Uherský Brod

laboratormz@mz-biochem.cz

Biochemická a hematologická laboratoř MZ- Biochem je akreditována podle ČSN EN ISO 15 189 již od 28. 4. 2010. Byla první laboratoří akreditovanou podle této normy ve Zlínském kraji, a to na obou svých pracovištích, v Uherském Brodě a v Uherském Hradišti.

Již od roku 2010 zastávají funkci interních auditorek 2 zdravotní laborantky, každá z jiného pracoviště. Cílem interních auditů je prověřit shodu praxe s požadavky specifikovanými v platných postupech a v zákonných normách. Neopominutelným cílem je poskytnutí příležitosti pro zlepšování kvality laboratoře, odhalení chyby, nedostatku či nalezení úspory.

Interní audity jsou základem pro vlastní prohlášení laboratoře o shodě. Laboratoř má specifikovaný postup pro provádění interních auditů. Harmonogram interních auditů zpracovává manažer kvality a audit provádí interní auditorky většinou spolu. Hlavní auditorkou je ta, která je z opačného pracoviště, než je prováděný audit. Mezi typické činnosti, které musí auditorky vykonat, patří příprava auditu, přezkoumání dokumentů a audit na místě. Dále kontrola neshod a doporučení či opatření z auditů minulých a zpracování závěrečné zprávy. Metody, které při tom využívají, jsou postupné prověření všech článků normy ISO 15 189 a 2x ročně provedení vertikálního auditu. Výsledkem je potvrzení kvality laboratoře a odhalení případných nedostatků, které jsou popsány v závěrečné zprávě. K jejich odstranění přijme vedení laboratoře nápravná opatření.

Závěr: Interní audit je mechanismus pro nezávislé přezkoumávání chodu laboratoře z pověření jejího vlastního vedení. Provádění interních auditů vede ke zkvalitňování činností laboratoře. Uvedený příklad je ukázkou možnosti zdravotních laborantů podílet se přímo (nezprostředkovaně) na procesu řízení kvality.

B2-4

Pre-preanalytika a edukace sester ve FN Brno

Horáková H., Černá Š.

Oddělení klinické biochemie FN Brno

hhorak@fnbrno.cz

Cíl: Cílenou edukací ošetřovatelského personálu minimalizovat počet pre-preanalytických chyb.

Metody: Akreditovaná laboratoř pracující podle normy ISO 15189 používá nástroje k minimalizaci laboratorních preanalytických nedostatků. Pre-preanalytická pochybení průběžně sleduje a vyhodnocuje. Na zjištěné nedostatky reaguje a sleduje účinnost realizovaných opatření. Ve FN Brno na Oddělení klinické biochemie jsme vypracovali ve spolupráci s kolegyněmi z OKM a PAÚ dotazník, který byl zaměřen na dodržování pre-preanalytických požadavků. Dotazník byl rozdán účastníkům regionálního semináře v Prostějově a především 165 sestrám FN Brno. Po vyhodnocení dotazníku jsme se zaměřili na kritická místa, která mohou vést k chybám v tomto procesu. Podle dané osnovy jsme sestavili program edukačního semináře pro sestry, který je zaměřen na přípravu pacienta, správnost vlastního odběru a následný transport biologického materiálu do laboratoří. K účasti na edukačním semináři jsme přizvali také zástupce OKH a TO.

Výsledky: Seminář zaměřený na pre-preanalytickou fázi laboratorních vyšetření je nyní zařazen do adaptačního procesu sester jako povinný a je pořádán v pravidelných intervalech. Dosud bylo takto proškoleno více než 250 sester a zájem o tuto problematiku je i mezi sestrami, které pracují ve FN Brno již několik let. Pro tyto sestry pořádáme několikrát do roka obdobné edukační semináře po jednotlivých laboratorních oborech, včetně exkurze do laboratoří.

Závěr: Edukace sester a vzájemná mezioborová spolupráce přispívá ke zvyšování informovanosti a ke snižování chybovosti nejen v pre-preanalytickém procesu vyšetřování biologického materiálu našich pacientů.

Vše řešeno v rámci IGF č.3/11 podporovaného MZ ČR -RVO (FNBr.65269705)

B3-1

Možnosti prenatální diagnostiky genetických onemocnění

Plevová P., Grečmalová D.

Oddělení lékařské genetiky FN Ostrava

pavlina.plevova@fno.cz

Cíl: Principem prenatální diagnostiky je předejít na-rození dítěte se závažným vrozeným onemocněním.

Metody a výsledky: Problematiku lze rozdělit do těchto skupin:

1. Těhotné ženy mají možnost využít neinvazivního skríningu nejčastějších chromozomálních aberací, trizomií 13, 18 a 21. Pokud je výsledkem skríningu vysoké riziko narození plodu s trizomií, lze nabídnout ověření nálezu z invazivního výkonu, tj. odběru choriových klků nebo plodové vody. Alternativně lze využít stanovení trizomií ve volné fetální DNA z krve matky, ale i zde je nutné podezření na trizomii ověřit z invazivního výkonu před případným ukončením těhotenství.
2. V rodině se dědí hereditární onemocnění. Byla-li nalezena kauzální genetická odchylka v rodině, je možné provést přímou prenatální diagnostiku, tj. stanovení, zda plod vlohu nese či nikoli. Tohoto využíváme např. u cystické fibrózy, závažných nervosvalových onemocnění, metabolických vad, teoreticky jakýchkoli dědičných chorob. Pokud v rodině nebyla nalezena kauzální genetická příčina, ale víme, který gen příslušné onemocnění způsobuje, je možné nabídnout nepřímou prenatální diagnostiku založenou na stanovení genetických markerů, se kterými se v rodině onemocnění váže. Toho využíváme např. u neurofibromatózy či polycystických ledvin.
3. V geneticky nezatížené rodině byla zjištěna ultrazvuková anomálie plodu. Zde je cílem upřesnění diagnózy a prognózy pro plod, stanovení rizika a popř. možnosti prenatální diagnostiky pro další těhotenství.

Závěr: Možnosti prenatální diagnostiky se neustále vyvíjejí s vývojem nových diagnostických metod a objevováním nových souvislostí mezi geny a vrozenými chorobami.

B3-2

Současný pohled na screening Downova syndromu

Matura D.

Porodnicko-gynekologická klinika, Fakultní nemocnice Ostrava

d.matura@email.cz

Downův syndrom (trizomie 21. chromozomu) je nejčastější chromozomální vadou v populaci. Její četnost je mimo jiné výrazně závislá na věku těhotné a pohybuje se v průměru okolo 1:450. Děti s Downovým syndromem se vyznačují mongoloidním vzhledem obličeje, výrazně sníženým intelektem i psychomotorickým vývojem, často také vrozenými vadami srdce. Snahou prenatální diagnostiky je včasné odhalení této anomálie. V průběhu let byly vypracovány různé metody screeningu Downova syndromu, ale ani jedna z nich nedokáže tento syndrom odhalit se 100% spolehlivostí. Snaha o nalezení přesnějšího screeningového markeru vedla k zavedení tzv. trojitého testu, kdy stanovením free beta HCG, AFP a E3 v 16. týdnu gravidity ze séra matky bylo spolu s věkem dosaženo 65% záchytu Downova syndromu. I přes tuto velmi nízkou senzitivitu, nízkou specificitu a vysokou falešnou pozitivitu to byl ve své době velký krok kupředu. V 90. letech minulého století byl zaveden tzv. prvotrimestrální screeningový test, založený na kombinaci laboratorní a ultrazvukové komponenty mezi 12. a 14. týdnem těhotenství. Stanovením free beta HCG a PAPP-A a ultrazvukovým měřením šíjového projasnění plodu a detekcí jeho nosní kosti bylo dosaženo až 90% záchytu trizomie 21. Postupným vylepšováním a kombinací testu s dalšími nalezenými ultrazvukovými markery jsme nyní schopni za dodržení přísných podmínek vyšetření detekovat Downův syndrom až v 95 %. Cílem tohoto snažení je snížit invazivní metody prenatální diagnostiky (amiocentézu, kordocentézu, odběr choriových klků) na nejnižší možnou úroveň. V případě vysokého rizika pro trizomii 21 je těhotné nabídnut odběr chória, kdy detekční síla takto provedeného vyšetření se pohybuje okolo 1:5 oproti 1:90 při použití pouze druhotrimestrálního laboratorního testu a následného odběru plodové vody. Budoucnost screeningu aneuploidií je ovšem ve stanovení fetální DNA z periferní krve matky. Již nyní existují v praxi dostupné testy, limitující je však zatím jejich vysoká cena.

B3-3

Praktické využití placentárního růstového faktoru a rozpustné tyrozinkinázy-1 při včasné diagnostice preeklampsie

Beňovská M., Opluštilová A.

Oddělení klinické biochemie FN Brno; Katedra laboratorních metod LF MU

mbenov@fnbrno.cz

Cíl studie: Analyzovat rozpustnou tyrozinkinázu-1 (sFlt-1) a placentární růstový faktor (PlGF) a statisticky vyhodnotit, zda koncentrace těchto markerů a její poměr může odlišit fyziologické těhotenství od preeklampsie dříve, než se projeví klinické symptomy.

Metody: Ke stanovení sFlt-1, PlGF byla použita heterogenní nekompetitivní imunoanalýza na imunochemickém modulu systému cobas 8000 od firmy Roche s elektrochemiluminiscenční detekcí.

Výsledky: Koncentrace sFlt-1 a PlGF byla analyzována u souboru 39 žen s diagnózou preeklamsie a 81 žen s fyziologickou graviditou. Výsledky byly statisticky vyhodnoceny pomocí Mann-Whitney testu. U sFlt-1 a poměru sFlt-1/ PlGF byl prokázán statisticky významný rozdíl. Pomocí ROC křivky pro poměr sFlt-1/ PlGF byla zjištěna senzitivita 74,4 % a specificita 86,4 %. Z naměřených výsledků byly dále vypočteny cut off hodnoty pro 16. - 20. týden gravidity.

Závěr: V práci byl prokázán význam stanovení sFlt-1, PlGF a jejich poměru. Parametry jednoznačně odhalí těžkou preeklampsii již v 16. - 20. týdnu těhotenství. Na OKB ve FN Brno v současnosti nabízíme stanovení těchto markerů jako placené vyšetření vhodné zejména pro těhotné se zvýšeným rizikem preeklampsie.

B3-4

RHD a RHCE genotypizace fetální DNA izolované z plazmy těhotných žen

Malušková A., Kovářová P., Pannová J., Čermáková Z.

Krevní centrum Fakultní nemocnice Ostrava; Porodnicko - gynekologická klinika Fakultní nemocnice Ostrava

alena.maluskova@fno.cz

Cíl studie: Zkušenosti se zavedením RHD a RHCE genotypizace fetální DNA izolované z plazmy těhotných žen v riziku hemolytického onemocnění plodu a novorozence (HON).

Metody: V poslední době dochází v rámci prenatální diagnostiky k vývoji nových neinvazivních metod využívajících volnou cirkulující fetální DNA izolovanou z periferní krve matky. V DNA laboratoři Krevního centra FN Ostrava byla zavedena neinvazivní RH genotypizace plodu z mateřské plazmy metodou polymerázové řetězové reakce v reálném čase s fluorescenčně značenými TaqMan sondami. K vyšetření byly zasílány vzorky aloimunizovaných žen sledované pro riziko HON ze specializovaného ambulantního pracoviště Porodnicko - gynekologické kliniky FNO. Prenatální RHD a RHCE genotypizace umožňuje identifikaci plodů v riziku HON, u nichž by měl být v pravidelných intervalech sledován titr aloprotilátek a ultrazvukem stav plodu.

Výsledky: Neinvazivní RHD a RHCE genotypizace plodu byla zavedena v roce 2009. Během uplynulých 5 let bylo provedeno 23 vyšetření u 18 gravidních žen většinou na začátku druhého trimestru. Celkem bylo provedeno 12 RHD, 5 RHC, 2 RHc a 4 RHE genotypizace.

Závěr: Přesnost metody se zjišťuje porovnáním výsledku fetální genotypizace s výsledky imunohematologické analýzy novorozence z pupečníkové krve. Získání konfirmačního výsledku však může být obtížné z různých důvodů, např. konfirmační vyšetření krevní skupiny novorozence nebylo provedeno v systému RhCE, ale pouze v systémech AB0 a RhD, jak je běžná praxe, nebo porod proběhl v jiném nemocničním zařízení a není možné krevní skupinu novorozence zjistit. Dvě ženy jsou stále gravidní a na výsledek imunoanalýzy se čeká. Korelováno bylo pouze 8 výsledků z 21 (38 %): 7 RHD a 1 RHC. Výsledky RHC (100 %) a 6 RHD (86 %) genotypizací se shodovaly s vyšetřením z pupečníku. Jedno vyšetření RHD genotypizace plodu nebylo ve shodě s vyšetřením pupečníkové krve (falešná pozitivita).

B3-5

Prenascan v Gennetu, neinvazivní prenatální test trizomie

Marešová I., Horáčková S., Vávrová J., Zembol F., Stejskal D., Putzová M.

Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny Gennet

ivona.maresova@gennet.cz

Prenascan je projekt, který byl zaveden do ČR ve spolupráci BGI Healthy Europe. Jedná se o neinvazivní prenatální test trizomie chromozomu 13, 18, 21 s možností určení pohlaví, včetně určení vad pohlavních chromozomů. Prenascan patří mezi screeningové metody, které doplňují stávající biochemické analýzy. Vyšetření je možné podstoupit mezi 10. a 21. týdnem těhotenství po genetickém poradenství. V současné době lze tímto testem vyšetřit také vícečetná těhotenství. Metoda je založena na hodnocení relativní četnosti fragmentů volné DNA v maternální plazmě pomocí celogenomového sekvenování s následnou bioinformatickou analýzou dat. Množství volné fetální DNA, pocházející z apoptotických buněk trofoblastu, se pohybuje mezi 5 a 10 % a narůstá se stupněm těhotenství. Od října 2012 do prosince loňského roku činil počet testovaných pacien-tek 1263. Z tohoto množství bylo 22 případů s pozitivním nálezem. Falešná pozitivita byla prokázána ve čtyřech případech, u kterých byla následně provedena amniocentéza či odběr choriových klků s normálním nálezem.

B4-1

Terapeutické monitorování léčiv

Kacířová I., Grundmann M.

Oddělení klinické farmakologie, Ústav laboratorní diagnostiky, Fakultní nemocnice Ostrava; Ústav klinické farmakologie, Lékařská fakulta, Ostravská univerzita

ivana.kacirova@fno.cz

Terapeutické monitorování léčiv (TDM) umožňuje monitorování terapie pomocí měření koncentrace léčiva v biologickém materiálu.

Z hlediska pacienta je vhodné:

1. Potvrzení non-compliance,
2. Změny kinetiky při fyziologických stavech (dětství, stáří, těhotenství),
3. Změny kinetiky při chorobných stavech (onemocnění ledvin, jater),
4. Objektivizace lékové interakce,
5. Nastavení vhodné dávky.

Z hlediska léčiva je vhodné:

1. Vztah koncentrace a účinku je těsnější než dávky a účinku,
2. Účinek léčiva je obtížně klinicky měřitelný,
3. Léčivo s úzkou terapeutickou šíří,
4. Farmakokinetika 0. řádu,
5. Intoxikace.

Praktické provedení TDM má tři základní části:

1. Analýza léčiva různými metodami,
2. Interpretace koncentrace léčiva klinickým farmakologem, který pošle doporučení pro úpravu dávky klinikovi,
3. Zpětná vazba s klinikem, jehož akceptace doporučení zajistí změnu dávkování, a tím racionální farmakoterapii.

V současnosti je prováděno TDM těchto léčiv:

1. antibiotika - gentamicin, amikacin, vankomycin
2. ovlivňujíci respirační systém - teofylin, kofein
3. antiepileptika - fenytoin, karbamazepin, kys. valproová, atd.
4. cytostatika - metotrexát, mitotan
5. kardiaka - amiodaron, digoxin
6. imunosupresiva - cyklosporin A, takrolimus, sirolimus, atd.
7. psychofarmaka - antidepresiva, antipsychotika.

Někdy je vhodné stanovit i základní metabolit, např. karbamazepin (epoxy-karbamazepin), primidon (fenobarbital). Pro správnou interpretaci je potřebná vyplněná žádanka (www.fno.cz/ustav-klinicke-farmakologie/ustav-klinicke-farmakologie) a software, např. MW - PHARM. Správné užití TDM vede ke zkrácení hospitalizace, snížení morbidity a mortality, snížení pracovní neschopnosti, a tím ke snížení nákladů a zvýšení kvality života pacientů.

B4-2

Radosti a strasti vývoje metod pro terapeutické monitorování léčiv

Šištík P., Uřinovská R., Brozmanová H.

Oddělení klinické farmakologie, Ústav laboratorní diagnostiky, FN Ostrava; Katedra biomedicínských oborů, Lékařská fakulta, Ostravská

pavel.sistik@fno.cz

Oddělení klinické farmakologie se zabývá analýzou hladiny léčiv a jejich metabolitů v biologickém materiálu (především v séru). Pacienti jsou léčeni jak monoterapií, tak polyterapií. Z tohoto důvodu je nutný vývoj analytických metod umožňujících stanovení součastně několika léčiv, popřípadě i stanovení jejich aktivních metabolitů. Ke stanovení léčiv v biologickém materiálu se používají imunonochemické, elektromigrační či elektroforetické a chromatografické metody, které mají požadovanou citlivost detekce. Na našem oddělení jsou nejvíce zastoupeny chromatografické metody. Ze strany pracovišť Fakultní nemocnice Ostrava a z pracovišť ostravské spádové oblasti přicházejí požadavky na monitorování hladin léčiv. Po nastudování problematiky klinickým farmakologem či farmaceutem, dostává analytik za úkol vývoj metody pro jejich stanovení. Prvním krokem je volba vhodného analytického systému pro identifikaci a kvantifikaci léčiva v biologické matrici, která může ovlivnit analýzu daného léčiva. Při použití nespecifické detekce, je nutné testovat vliv dalších interferencí (např. nejčastěji užívaná léčiva). Velký důraz při vývoji metody je kladen na výběr vhodného vnitřního standardu, stabilitu analytů, rychlost analýzy a snadnou přípravu vzorku. Nedílnou součástí je i výběr vhodného odběrového materiálu a volba odběrového času vzorku ve vztahu k farmakokinetice léčiv. Výsledkem vývoje nové analytické metody je její validace a zavedení do rutinní praxe.

B4-3

Stanovení imunosupresiv metodou kapalinové chromatografie s hmotnostní detekcí

Brozmanová H., Uřinovská R, Šištík P., Kacířová I., *Grundmann M.

Odělení klinické farmakologie, Ústav laboratorní diagnostiky, FN Ostrava *Ústav klinické farmakologie, Lékařská fakulta Ostravské University, Ostrava

hana.brozmanova@fno.cz

Kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí (LC-MS) se stále více prosazuje v rutinním terapeutickém monitorování imunosupresiv, kde postupně nahrazuje imunoanalytické metody. Vyrovná se jim v rychlosti analýzy, ale na rozdíl od nich je vysoce specifická a selektivní. Především nadhodnocení koncentrace látek způsobené zkříženou reakcí s metabolity, kterých je u imunosupresiv velké množství (u cyklosporinu A až 30, u takrolimu 6), vede postupně k nahrazení imunoanalytických metod LC-MS technikou. Prezentovanou metodu používáme pro analýzu všech běžně podávaných imunosupresiv: cyklosporinu A (CsA), takrolimu, sirolimu, everolimu a kyseliny mykofenolové (MPA) z 200 µl plné krve, která se precipituje směsí acetonitrilu, metanolu a síranu zinečnatého. Detekce je založena na stanovení molárního iontu nebo amonného aduktu za použití elektrospreje (ESI). Vzhledem k rozdílnému terapeutickému optimu a referenčním koncentracím jednotlivých látek (0,2- 20 mg/l) pro MPA, (2-2000 µg/l) pro CsA a (1-50 µg/l) pro takrolimus, sirolimus a everolimus, se používají dva vnitřní standardy cyklosporin D a ascomycin. Analýza je gradientová, probíhá při teplotě 50 °C a trvá 5 minut. Parametry metody jsou následující: správnost metody je u všech látek v rozmezí 92-105 % a přesnost daná variačním koeficientem 2,3-10,2 %. Během sledovaného období se mění procentové zastoupení analýzy jednotlivých imunosupresiv ve prospěch takrolimu.

B4-4

Terapeutické monitorování psychofarmak.

Uřinovská R., Šištík P., Brozmanová H., Kacířová I., Šilhán P., Grundmann M.

Oddělení klinické farmakologie, Ústav laboratorní diagnostiky, Fakultní nemocnice Ostrava; Oddělení psychiatrické, Fakultní nemocnice Ostrava;Ústav klinické farmakologie, Lékařská fakulta, Ostravská univerzita v Ostravě

romanaurinovska@seznam.cz

Psychofarmaka jsou široce používána jak v psychiatrii, tak v mnoha dalších oblastech medicíny. Prevalence psychických onemocnění dle epidemiologických studií stoupá, a s tím je spojena i zvyšující se preskripce psychofarmak. Ovšem významný počet pacientů léčených psychofarmaky z nejrůznějších důvodů neodpovídá na léčbu nebo se u nich naopak objevují nežádoucí účinky. Dalšími důvody, které hovoří pro terapeutické monitorování těchto léků, je například poměrně vysoký interakční potenciál některých psychofarmak, častá non-compliance, pomalý nástup účinku nebo vliv genetického polymorfizmu biotransformujících enzymů na účinek některých látek. Důležité je nejen stanovení hladiny mateřské látky, ale také i hladin více či méně aktivních metabolitů. Pro stanovení psychofarmak se nejčastěji využívají chromatografické metody ve spojení s hmotnostní detekcí, především LC/MS nebo LC/MS/MS kvůli své flexibilitě, rychlosti, citlivosti a selektivitě. Byla vyvinuta chromatografická metoda s hmotnostní detekcí pro stanovení vybrané skupiny antidepresiv a antipsychotik. Analýza se provádí na Waters Acquity UPLC system (Waters, Milford Ma, USA) ve spojení s Quattro Micro API triple quadrupole (Micromass, Manchester, UK). Separace látek probíhá na koloně RP column BEH C18 (2,1x50 mm, 1,7 µm) za použití gradientu mobilní fáze (voda:acetonitril:octan amonný) s dobou analýzy 5 minut. Koncentrace jednotlivých psychofarmak je stanovována v séru. Úprava vzorku zahrnuje precipitaci proteinů pomocí směsi acetonitril:metanol (2:3 v/v). Vyšetření sérových hladin psychofarmak s erudovanou interpretací je cestou k optimalizaci péče o psychiatricky léčené pacienty.

B5-1

Studijní obor Zdravotní laborant – aneb laborantem snadno a rychle?

Šafarčík K., Zavacká I.

Ústav laboratorní diagnostiky FN Ostrava, Katedra biomedicínských oborů LF OU v Ostravě

kristian.safarcik@fno.cz

Práce v laboratoři se na první pohled může zdát velmi atraktivní, čistá a nenáročná, společensky pozitivně vnímána a navíc i finančně poměrně slušně hodnocená. Proto se každoročně na dráhu budoucích laboratorních pracovníků vydává řada absolventů středních (příprava v rámci terciárního vzdělávání), ale i základních škol (vzdělávání v rámci středních odborných škol). V posledních 20 letech doznalo vzdělávání pracovníků v laboratořích řadu změn, což s sebou přineslo i řadu problémů. Vzdělávání pracovníků, zejména ve zdravotnických laboratořích, je dnes celoživotní proces, který má jasná legislativní pravidla (Zákon č. 96/2004 Sb. (novelizace 105/2011), vyhláška č. 39/2005 Sb. (novelizace 129/2010), vyhláška 424/2004 (novelizace 55/2011). Ve zdravotnických laboratořích se tak můžeme setkat s pozicemi laboratorních asistentů (středoškolské vzdělání), zdravotních laborantů (Bc. studium), odborných pracovníků v laboratorních metodách (Mgr. studium), z nichž většina je zapojena do celoživotního specializačního vzdělávání (atestace ve specializačních oborech). V laboratorních provozech může pracovat samozřejmě i řada dalších pracovníků různých profesí, a to převážně z řad biomedicínských inženýrů, informatiků, sanitářů apod. V našem příspěvku se budeme zabývat akreditovaným bakalářským studijním oborem Zdravotní laborant, jež je jedním z nejstarších oborů studovaných na Lékařské fakultě Ostravské univerzity v Ostravě. Rádi k tomuto sdělení připojíme krátké koreferáty nebo příspěvky o pregraduálním studiu bakalářského oboru Zdravotní laborant nebo magisterského oboru Odborný pracovník v laboratorních metodách na jiných vysokých školách v ČR.

B5-2

Postgraduální vzdělávání laborantů

Blažková J., Pavlíková L.

Ústav klinické biochemie a diagnostiky FN Hradec Králové

jana.blazkova@fnhk.cz

Obor zdravotní laborant má v našem zdravotnictví dlouholetou tradici. Se stále se zvyšujícími požadavky na úroveň práce laboratorních pracovníků v oblasti zdravotnických vyšetřovacích metod a pro zajištění kvalitní zdravotní péče je kladen velký důraz nejen na pregraduální, ale i postgraduální vzdělávání laborantů. Celoživotní vzdělávání je v současné době významným tématem, kterým se zabývá celá řada dokumentů celosvětových, dokumentů Evropské unie i dokumentů přijatých v České republice. Jednou z možných forem celoživotního vzdělávání vedoucí k prohloubení kvalifikace zdravotnického laboranta je specializační vzdělávání, které je legislativně ukotveno v zákoně 96/2004 Sb. V informativním sdělení bude podán přehled o možnostech, podmínkách, průběhu a ukončení současného postgraduálního specializačního studia zdravotních laborantů oboru klinická biochemie.

B5-3

Celoživotní vzdělávání laborantů – projekt ENHANCE IT

Šálek T., Jahodová B., Šilhavík J.

Oddělení klinické biochemie, Krajská nemocnice T. Bati a. s., Zlín; Středisko vědeckých informací, Krajská nemocnice T. Bati a. s

tsalek@seznam.cz

Prudký rozvoj nových poznatků a technologií ve zdravotnictví vede k nezbytnosti celoživotního vzdělávání všech zdravotnických pracovníků. V rámci programu celoživotního učení Evropské Unie Leonardo da Vinci byl v roce 2013 schválen také projekt ENHANCE IT. V projektu je 5 partnerů: Oddělení klinické biochemie Krajské nemocnice T. Bati, a. s., Zlín University of Wolverhampton, United Kingdom Pathology department of the Mater Dei Hospital of Malta Horvath and Dubecz Consulting, Ltd (maďarská vzdělávací organizace) a Croatian Metrology Society (Chorvatská metrologická společnost).

Projekt má následující cíle:

• Rozpoznat klíčové prvky dobré praxe celoživotního vzdělávání laborantů
• Definovat standardy Evropské kvality a kritéria hodnocení celoživotního vzdělávání
• Vytvořit rámec pro zahrnutí reflektivní praxe v celoživotním vzdělávání
• Vytvořit doporučení pro evropské nemocnice pro organizaci vzdělávacích aktivit
• Vytvořit vzorovou aktivitu celoživotního vzdělávání

Byla vytvořena internetová stránka zabývající se celoživotním vzděláváním laborantů www.enhanceit.eu.

B5-4

Comparison of Approaches and Measurement of Continuing Professional Development for Specialists in Laboratory Medicine within Five European Countries.

Martin J.¹, Gasljevic V.², Šálek T.³, Horvath A.⁴, Borg Ch.⁵, Meštrić Z.⁶, Jakovcic M.², Silhavik J.³, Adonics A.⁴, Szlamka Z.⁴, Brincat I.⁵, Buttigieg D.⁵, Ciantar N.⁵, Sciortino A.⁵, Adkins A.⁷, Bennett T.⁸, Rice K.⁹, Taylor Y.¹⁰

¹School of Biomedical Science and Physiology, University of Wolverhampton, UK; ²Croatian Metrology Society, Zagreb, Croatia; ³Tomas Bata Regional Hospital, Inc, Zlin, Czech Republic; ⁴Horvath and Dubecz Consulting Ltd, Budapest, Hungary; ⁵Mater Dei Hospital, Msida Malta; ⁶University Hospital Merkur, Zagreb, Croatia, ⁷Clinical Immunology Service, University of Birmingham, UK, ⁸Shrewsbury and Telford Hospital Shrewsbury UK, ⁹New Cross Hospital, Wolverhampton, UK, ¹⁰Birmingham Children’s Hospital, Birmingham, UK

Introduction: Continuing professional development (CPD) is imperative for Specialists in Laboratory Medicine to maintain fitness to practice thus supporting quality service delivery. Understanding of CPD requirements within Europe is needed to underpin mobility of Specialists in Laboratory Medicine (SLM) and to ensure excellence in provision of EU-patient laboratory test results. As a mobile profession there is therefore a need for recognition of Specialists in Laboratory Medicine’s CPD across the EU.

Methods: Partner organizations from five European countries who are participating in a Leonardo Partnership European Lifelong Learning Project took part in this study. The Partnership consortium has received funding of over 100,000 euros to enhance hospital laboratory standards for CPD by developing a Quality Improvement Toolkit and an online CPD providers Community of Practice network. Eighteen participants representing the five partner organizations provided information regarding approaches and measurement of CPD for SLM within their countries.

Results: The partner countries that took part in this study are Croatia, Czech Republic, Hungary, Malta and the United Kingdom. The study illustrated the different staff grades that are employed in hospital laboratories in each partner country, along with their education and qualifications. Although SLM must be registered in all of the participating countries, there is considerable variation with regard to the period of registration which differs from lasting two years (UK), six years (Croatia) to open-ended (Malta). In all partner countries, (except Malta) there is a requirement for re-registration/re-licensing with participation in CPD activities being a mandatory pre-requisite. Results indicated differences in both the amounts of CPD in terms of points which are required in each partner country plus differences in criteria for inclusion of different types of CPD activities.

Conclusion: Partner countries exhibit a spectrum of requirements for CPD ranging from no requirement for CPD for re-registration/re-licensing (Malta) to input-based models with mandatory, precisely specified, numbers of CPD points per year (Croatia, Czech Republic and Hungary) to an outcomes-based approach (United Kingdom).

B6-1

Význam stanovovení iontů v klinické praxi

Hrabovský V.

Metabolická JIP, Interní klinika, Fakultní nemocnice Ostrava

vladimir.hrabovsky@fno.cz

Úvod: Poruchy vodního a minerálního hospodářství představují mezioborový problém. Mohou se vyskytnout jako příznak nebo komplikace prakticky u kterékoliv choroby. Jejich správná klinická a laboratorní diagnostika, interpretace a následná implementace do klinické praxe je přitom zásadním atributem správné léčby.

Metody: U pacientů s poruchami vodního a minerálního hospodářství se stanovují nejčastěji sérové koncentrace sodíku, draslíku a chloridů. Úzké spojení s dalšími metabolickými parametry ale vyžaduje vyšetření také koncentrací magnézia, fosforu a stanovení parametrů acidobazické rovnováhy. Nedílnou součástí správného hodnocení je rovněž zjištění denních odpadů těchto minerálů v moči.

Výsledky: Autor prezentuje charakteristiku jednotlivých minerálů a význam jejich správné interpretace na vybraných patologických stavech. Je také poukazováno na klinické spojení mezi závažnosti minerální poruchy a stavem pacienta, včetně život ohrožujících situací.

Závěr: Správné zhodnocení příčiny minerální poruchy umožňuje rychlou a správnou korekci patologického stavu. Tím také příznivé ovlivnění průběhu onemocnění, během kterého situace vznikla.

B6-2

Němá forma celiakie - nejčastěji opomíjená diagnóza

Kocna P., Dvořák M.

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky 1. LF UK a Všeobecné fakultní nemocnice, 4. interní klinika 1. LF UK a Všeobecné fakultní nemocnice, Praha

kocna@lf1.cuni.cz

Celiakie je hereditární autoimunitní onemocnění způsobené celoživotní nesnášenlivosti lepku a jeho jedinou současnou kauzální terapii je bezlepková dieta. Prevalence celiakie odpovídá přibližně 1 % populace a v současné době je diagnostikováno jen asi 15 % nemocných. Hlavní příčinou tohoto stavu je fenotyp nemoci - střevní příznaky chybějí nebo jsou nevýrazné a diagnóza celiakie je velmi často opomíjena. V České republice je proto doporučen “Cílený screening celiakie“, publikovaný ve Věstníku MZ-ČR 2011, částka 3, strana 51-54. Diagnostický algoritmus tohoto screeningu zahrnuje laboratorní testy IgA protilátek ke tkáňové transglutamináze (IgA-atTG) a celkové hladiny IgA, variantou je kombinace s IgG protilátkami k deamidovaným gliadinovým peptidům (IgG-DGP) s následující biopsií sliznice tenkého střeva, v případě pozitivity protilátek. Téměř vzorovou ukázkou je prezentovaná kazuistika mladé ženy ve věku 33 let s indikovanou kolonoskopií pro hypochromní anémii, ženy s klinicky němou - tichou formou celiakie. Neléčená nebo pozdě diagnostikovaná celiakie (věk nad 50 let) je považována za závažnou prekancerózu, a statistiky uvádějí 8 – 10 % prevalenci výskytu malignit. Toto riziko lze významně ovlivnit striktně dodržovanou bezlepkovou dietou, a po 5letém dodržování diety se riziko již neliší od zdravé populace. Riziko malignity pravděpodobně souvisí s dysregulací slizniční imunity při dlouhodobé stimulaci lepkem a zvýšené propustnosti střevní sliznice pro karcinogeny.

Cílený screening celiakie a vyhledávání dosud nedia-gnostikovaných celiaků, především němé - tiché formy, vyžaduje úzkou spolupráci kliniků a laboratoří.

B6-3

Likvorový nález z pohledu klinika, kazuistiky

Petroušová L.

Klinika infekčního lékařství, Fakultní nemocnice Ostrava

lenka.petrousova@fno.cz

Diagnostiku neuroinfekcí si nelze představit bez provedení likvorového vyšetření. V praxi není problém diagnostikovat jasnou purulentní meningitidu, většinou diagnóze odpovídá klinický stav i likvorové vyšetření a další biochemické parametry. Vzhledem k vakcinacím proti nejčastějším původcům purulentních meningitid jako je pneumokok, hemofilus a meningokok, těchto typických purulentních meningitid ubývá. Problém v diagnostice představují meningitidy u imunosuprimovaných pacien-tů, shuntové meningitidy, listeriové meningitidy, basilární meningitida. Jejich diagnostika je obtížná, v úvodu likvorový nález může odpovídat i nehnisavému zánětu, vzhledem k imunosupresi nemusí být výrazná elevace zánětlivých parametrů. Včasně zahájená cílená terapie je však pro pacienta život zachraňující. Na naší klinice v úvodu onemocnění do potvrzení etiologie onemocnění léčíme pacienta kombinací 4 antimikrobiálních léčiv: cefalosporiny 3. generace, ampicilin, aciklovir a antimykotika. Terapii upravujeme až po upřesnění etiologie onemocnění. Většina aseptických neuroinfekcí nevyžaduje specifickou terapii, ale přesto hlavně enterovirové meningitidy mívají často v úvodu onemocnění likvorový nález, který může odpovídat počínající purulentní meningitidě, s tím často koresponduje i elevace zánětlivých parametrů. Uvedení pacienti jsou na naší klinice také zajištěni antimikrobiální a antivirovou léčbou a až po upřesnění diagnózy terapii deeskalujeme. Diagnostika onemocnění musí být komplexní, zahrnuje klasicky anamnézu, klinický stav pacienta, likvorové vyšetření, zánětlivé parametry, mikrobiální vyšetření a sérologické vyšetření. Vzhledem k závažnosti onemocnění považujeme vhodnější léčbu deeskalovat až po určení původce onemocnění. Součástí sdělení budou i kazuistiky a jejich diferenciální diagnostika. Dobrá spolupráce klinika a laboratorního pracovníka je nutná k zajištění správné diagnostiky onemocnění a tudíž i adekvátní léčby neuroinfekce.

B6-4

Vyšetření likvoru v neurointenzivní péči

Hon P.

Neurologická klinika, FN Ostrava

Akutní příhody mohou postihnout nervový systém na všech jeho etážích – centrální i periferní, v oblasti nervosvalové ploténky. Variabilní jsou struktury takto postižené, ať již jde o neurony samotné, axony, myelinové pochvy, či anatomické struktury s nervovým systémem blízce spojené (meningy, skelet). Příčinou akutní léze může být porucha cévního zásobení (cévní mozkové příhody), záněty infekčního původu či autoimunní, ale také akutní dekompensace nádorového onemocnění.

Vyšetření likvoru u akutních cévních mozkových příhod indikujeme v případě diagnostiky subarachnoidálního krvácení – při klinickém podezření a absenci přítomnosti krve při CT vyšetření mozku. Počet a morfologie elementů významně přispívá k rozlišení příčiny akutních polyradikuloneuritid – infekční či autoimunní. Problematickým se stává hodnocení likvorologických nálezů pacientů s komorovými drény, kdy proteinorhachie a pleocytóza nejsou vždy signifikantním nálezem znamenajícím akutní infekt.

V kazuistikách budeme demonstrovat správně interpretované laboratorní výsledky klinikem.

Laboratorní likvorová diagnostika je významným pomocníkem při stanovení diagnózy příčiny akutního neurologického stavu. Správná indikace vyšetření a současně adekvátní hodnocení klinikem je pro zavedení příčinné terapie zásadní.

Možnost rychlé identifikace známky infekčního původu meningitidy u nemocných zajištěných komorovými drény je jedním z cílů likvorologického výzkumu.