Apoptóza při vývoji kolorektální neoplazie

Souhrn

Úvod:
Česká republika se dlouhodobě řadí ke státům s nejvyšším výskytem kolorektálního karcinomu. Při vývoji kolorektální neoplazie hraje významnou roli proliferace, diferenciace a apoptóza buněk. Cílem naší studie bylo stanovit míru apoptózy u jednotlivých stadií kolorektální neoplazie.

Metodika:
Apoptóza byla stanovena ve slizničních biopsiích kolorektální neoplazie a normální sliznice u 20 pacientů s nepokročilým kolorektálním adenomem, u 20 pacientů s pokročilým kolorektálním adenomem, u 20 pacientů s kolorektálním karcinomem a u 20 jedinců s normálním nálezem v kolorektu. Míra apoptózy byla hodnocena po obarvení hematoxylin-eozinem (ve třech kompartmentech:  povrchový kompartment, horní a dolní část krypt) a imunohistochemickými metodami (detekcí aktivované kaspázy-3).

Výsledky:
Apoptotická aktivita byla vyjádřena pomocí apoptotického indexu. Ve zdravé sliznici kolorekta byla pozorována v dolní části krypt nízká úroveň apoptotické aktivity. V horní části krypt klesla apoptotická aktivita k nulovým hodnotám. Nárůst apoptotické aktivity byl pozorován v povrchovém kompartmentu. Přeměna zdravé sliznice v tkáň nepokročilého kolorektálního adenomu byla doprovázena statisticky signifikantním vzestupem apoptotické aktivity ve všech třech kompartmentech (p ≤ 0,05), přičemž nejvyšší nárůst byl pozorován v horní části krypt. Přeměna nepokročilého adenomu v pokročilý byla spojena s dalším navýšením apoptotické aktivity, a to opět především v horní části krypt. U karcinomů ve srovnání s pokročilým adenomem došlo k významnému poklesu apoptotické aktivity ve všech třech kompartmentech (p ≤ 0,05). Výsledky imunohistochemických hodnocení potvrdily trend pozorovaný u vzorků barvených hematoxylin-eozinem.

Závěry:
Prokázali jsme přítomnost deregulace apoptózy při vývoji kolorektální neoplazie. Ovlivnění míry apoptózy především při přeměně pokročilého adenomu v kolorektální karcinom by mělo v klinické praxi příznivé konsekvence.

Klíčová slova:
kolorektální adenom – kolorektální karcinom – apoptóza

Úvod

Kolorektální karcinom (CRC – colorectal carcinoma) je třetím nejčastějším karcinomem celosvětově, incidence v roce 2012 činila 1,36 mil. Letalita na toto onemocnění zůstává vysoká, v roce 2012 byla 694 000 [1]. ČR se dlouhodobě řadí ke státům s nejvyšším výskytem tohoto onemocnění:  incidence CRC v ČR v roce 2013 byla 77 a letalita 35 na 100 000 [2].

Kolem 70 % CRC vzniká sporadicky [3], obvykle sekvencí „adenom-karcinom“. V roce 1990 byl Fearonem a Vogelsteinem představen model kolorektální karcinogeneze, který předpokládá přítomnost mnohočetných na sebe navazujících genetických změn. Jako první nastává inaktivace APC (adenomatous polyposis coli) tumor supresorového genu, která je ve stadiu nepokročilého adenomu následována aktivací mutace KRAS onkogenu. Na úrovni pokročilého kolorektálního adenomu pak dochází k dalším mutacím, vč. mutace v p53 genu [4,5]. Pokročilý kolorektální adenom je definován jako neoplazie velikosti > 10 mm a/nebo obsahující vilózní komponentu a/ nebo přítomnost vysokého stupně dysplazie [6].

Při vývoji kolorektální neoplazie hraje klíčovou roli úroveň proliferace, diferenciace a apoptózy buněk. Regulace těchto dějů je vysoce komplexní, neboť ke kompletní výměně všech kolonocytů v tlustém střevě člověka dochází v intervalu 3–5 dnů a za den je vyprodukováno 3–10 bilionů kolonocytů, což činí sliznici kolorekta nejrychleji proliferujícím orgánem savců [7–9]. Je zřejmé, že při této enormní obnově kolorektálních epiteliálních buněk je přítomen potenciál akumulace genetických změn [10].

Apoptóza („programovaná smrt buňky“) byla představena Lockshinem v roce 1964 [11]. Definice a mechanizmus apoptózy byl přesně popsán Kerrem v roce 1972 – jde o kontrolovanou smrt buňky, která je komplementárním, ale přitom opačným dějem k mitóze. Zahrnuje změny jádra (kondenzace chromatinu) a cytoplazmy („smrsknutí buňky“) a rezultuje ve vznik apoptotických tělísek, která jsou fagocytována okolními buňkami, což eliminuje vznik zánětlivé reakce. Apoptóza může být iniciována fyziologickými, ale i patologickými ději. Apoptotické děje jsou zodpovědné za eliminaci buněk během normálního embryonálního vývoje. Apoptóza je fyziologicky přítomna ve tkáni dospělého člověka, avšak vyskytuje se i ve tkáních neoplazmatických [12].

Cílem naší práce je stanovit míru apoptózy u jednotlivých stadií kolorektální neoplazie.

Metodika

V rámci našeho projektu jsme při diagnostické a/nebo terapeutické koloskopii odebírali biopsie ze sliznice tlustého střeva – párové biopsie v případě nálezu kolorektální neoplazie (jedna biopsie z oblasti patologie, druhá biopsie ze zdravé sliznice, 10 cm vzdálené od místa neoplazie); u jedince s normálním pankoloskopickým nálezem byla biopsie odebrána pouze ze zdravé sliznice, a to obvykle v rektu (na závěr vyšetření, po vyloučení orálněji lokalizované kolorektální neoplazie). Zařazeno bylo 20 pacientů s nepokročilým kolorektálním adenomem, 20 s pokročilým kolorektálním adenomem, 20 s CRC a 20 jedinců s normálním pankoloskopickým nálezem.

Vzorky byly fixovány v 10% formalinu a dopraveny na Fakultu vojenského zdravotnictví v Hradci Králové. Následně byly odvodněny, zality do parafinu, z každého vzorku byl odkrojen 5 μm silný řez a ten odbarven hematoxylin-eozinem.

Vzhledem k charakteru kinetiky buněčné populace tlustého střeva byla v každém vzorku měřena apoptóza (apoptotický index (%) = počet apoptotických buněk × 100/ celkové množství hodnocených buněk) a mitóza (mitotický index (%) = počet mitotických figur × 100/celkové množství hodnocených buněk) ve třech různých kompartmentech: povrchový (v přímém kontaktu s lumen tlustého střeva), horní část krypt a dolní část krypt. Za apoptotické buňky byly považovány buď jednotlivé apoptotické fragmenty velikosti odpovídající sousedním buňkám, nebo shluk alespoň tří drobných apoptotických tělísek. V každém kompartmentu bylo hodnoceno minimálně 750 buněk.

Dále byla míra apoptotické aktivity u kolorektálních neoplazií hodnocena pomocí imunohistochemických metod, kdy byla prováděna detekce aktivované (štěpené) kaspázy-3, jenž je kritickým elementem regulujícím apoptotický proces, pomocí králičí monoklonální protilátky (1 : 200; Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) za použití standardní peroxidázové techniky na 5 μm silných řezech [13]. Vzorky byly po imunohistochemickém značení dobarveny hematoxylinem (obr. 1).

Získané výsledky byly statisticky zpracovány pomocí Mann-Whitneyova testu (nenormální rozdělení dat) statistickým programem SigmaStat.

Všichni jedinci zařazení do studie byli starší 18 let, se zařazením do studie souhlasili a podepsali souhlas informovaného. Byli srozuměni s použitím získaných výsledků a jejich publikováním v anonymní formě. Projekt byl schválen Etickou komisí (UK v Praze, LF UK a FN Hradec Králové).

Výsledky

Ve zdravé sliznici kolorekta bylo možné pozorovat mitotickou aktivitu pouze v dolní části krypt doprovázenou určitou úrovní apoptotické aktivity. Horní část krypt je kompartment, ve kterém buňky podléhají diferenciaci. Mitotická i apoptotická aktivita zde klesly k nulovým hodnotám (obr. 2). Opětovný nárůst množství apoptotických buněk byl pozorován v povrchovém kompartmentu, ve kterém jsou buňky střevní sliznice přirozeně obměňovány. Přeměna zdravé sliznice v tkáň non-advanced adenomu byla doprovázena statisticky signifikantním vzestupem apoptotické aktivity ve všech třech kompartmentech, (p ≤ 0,05) (graf 1). Největší nárůst byl přitom pozorován v horní části krypt. Přeměna non-advanced adenomu v advanced adenom byla spojena s dalším navýšením apoptotické aktivity (graf 1), a to opět především v horní části krypt (obr. 3). U karcinomů na rozdíl od advanced adenomu dochází k významnému poklesu apoptotické aktivity v povrchovém kompartmentu a horní i dolní části krypt, (p ≤ 0,05) (graf 1).

Apoptotická aktivita byla hodnocena v závislosti na lokalizaci patologie – nebyl pozorován statisticky signifikantní rozdíl v míře apoptózy mezi kolorektálními neoplaziemi lokalizovanými v pravé a levé částí tračníku (a rekta). Hranicí mezi pravou a levou částí tračníku byla flexura lienalis. Ve skupině pokročilého adenomu a karcinomu jde však o malý počet pozorování, proto je nutné toto tvrzení hodnotit rezervovaně.

Výsledky imunohistochemických hodnocení (detekce aktivované kaspázy-3) potvrdily trend pozorovaný u vzorků barvených hematoxylin-eozinem – došlo ke statisticky signifikantnímu nárůstu apoptotické aktivity v horní části krypt při přeměně v non-advanced adenom (p ≤ 0,05); k dalšímu statisticky signifikantnímu nárůstu apoptotické aktivity při přeměně v advanced adenom (p ≤ 0,05) a statisticky signifikantnímu poklesu při vzniku karcinomu z advanced adenomu (p ≤ 0,05).

Diskuze

Přítomnost deregulace apoptózy při iniciaci a progresi maligních onemocnění je zřejmá a nezpochybnitelná. Proto především v posledním desetiletí bylo ve výzkumu vyvinuto mnoho úsilí jak apoptózu kontrolovat a terapeutické strategie zahrnující indukci apoptózy se stávají efektivní součástí léčby maligních onemocnění, vč. léčby CRC [14,15].

Apoptóza může být indukována buď vnitřní (mitochondriální) [16,17] nebo zevní cestou (aktivací buněčných „receptorů smrti“) [18]. Stěžejní roli v samotné realizaci apoptózy mají kaspázy, které jsou produkované ve formě inaktivních zymogenů a podléhají proteolytické přeměně, a tím dochází k jejich aktivaci [17,19].

Apoptóza je regulována dvěma základními mechanizmy – BCL-2 rodinou [20] a inhibitory proteinů apoptózy (IAPs) [21,22]. BCL-2 rodina obsahuje pro- a antiapoptotické proteiny. Obzvlášť významným, antiapoptoticky působícím regulátorem, je protein BCL-2 [23]. Nádorové buňky s vysokou expresí BCL-2 jsou rezistentní k apoptóze, což snižuje jejich senzitivitu k onkologickým terapeutickým modalitám a hraje významnou roli i při vzniku mnohočetné rezistence k léčivům [16,24].

IAPs se vyznačují antiapoptotickými vlastnostmi. Doposud bylo rozpoznáno osm členů rodiny IAPs [21,22]. Nejmenším z rodiny IAPs je survivin; ten se stal díky své selektivní expresi v tumorózních buňkách ideálním tumorózním markerem a vzhledem ke své významné antiapoptotické roli terapeutickým cílem [25,26]. Norská studie označila survivin za nezávislý prediktor vývoje metachronního CRC u pacientů s kolorektálním adenomem [27]. Konturek et al vyšetřovali u pacientů s distálním CRC vliv inhibitoru cyklooxygenázy-2 (celekoxibu) na expresi survivinu ve tkáni nádoru a intaktní sliznici vzdálené 10 cm od nádoru. Po 14denní léčbě celekoxibem došlo ke statisticky významnému snížení exprese survivinu v nádorové tkáni a sliznici rekta. Chemoprevence CRC by proto mohla být mimo jiné realizována supresí antiapoptoticky působících proteinů [28].

V naší studii jsme při porovnání míry apoptózy ve zdravé sliznici pacientů s kolorektální neoplazií s mírou apoptózy ve zdravé sliznici jedinců s normálním nálezem v kolorektu zaznamenali pouze mírně vyšší apoptotický index v povrchové části krypt zdravé sliznice u pacientů s advanced adenomem ve srovnání s jedinci s normálním nálezem v kolorektu. Nešlo však o statisticky signifikantní diferenci.

Apoptóza je u CRC buněk s mutací ve WNT/ β-katenin dráze (která je přítomna u většiny sporadických CRC) indukována inhibitory histon deacetylázy. Známým inhibitorem histon deacetylázy je butyrát [29], který vzniká fermentací vlákniny působením intestinálních mikrobiot v tlustém střevě [30]. Butyrát je hlavním zdrojem energie (70 %) pro normální, zdravé kolonocyty [31,32]. Vzhledem k rozdílné koncentraci butyrátu při bázi krypt a v lumen střeva je jeho efekt na jednotlivé kolonocyty různý – nízké koncentrace butyrátu, přítomné při bázi krypt, jsou ihned metabolizovány v mitochondriích, podléhají β-oxidaci a stimulují proliferaci buněk, přičemž se velmi málo akumulují v jádru buňky [32,33]. Vyšší koncentrace butyrátu, které jsou přítomné v lumen tlustého střeva, výrazně převyšují metabolickou kapacitu kolonocytu. Nemetabolizovaný butyrát vstupuje do jádra kolonocytu a funguje jako inhibitor histon deacetylázy, což má za následek inhibici proliferace buňky a navození apoptózy [33]. Výsledky míry apoptózy ve zdravé sliznici kolorekta v naší studii kopírují tyto teoretické předpoklady –  apoptóza v souvislosti s relativním nadbytkem butyrátu v povrchové části krypt výrazně vzrostla ve srovnání s dolní a horní částí krypt.

Zcela jinak je tomu u buněk kolorektální neoplazie: ty podléhají tzv. Warburgovu efektu – jejich preferovaným zdrojem energie je glukóza (ne butyrát), a energii tak čerpají při aerobní glykolýze. Důsledkem je nižší metabolizace butyrátu a jeho snazší akumulace v jádrech buněk kolorektální neoplazie, kde se uplatňuje jako inhibitor histon deacetylázy, čímž dochází k indukci apoptózy s navozením tumor-supresorového efektu [33,34]. K významnému zvýšení apoptózy ve všech vyšetřovaných kompartmentech došlo u nepokročilého i pokročilého kolorektálního adenomu i v naší studii. Při přeměně pokročilého kolorektálního adenomu v karcinom však došlo k významnému poklesu apoptotického indexu, což bylo sice v souladu se studií provedenou Kikuchi et al [35], avšak nebyl naplněn předpoklad Warburgova efektu a efektu butyrátu. Jedno z mnoha případných vysvětlení poskytuje studie Hernandeze et al – ti zkoumali expresi survivinu ve tkáni kolorektálního adenomu a karcinomu a prokázali, že během sekvence vývoje normální sliznice kolorekta-adenom-karcinom dochází ke zvyšování exprese survivinu [25]. Je tedy možné, že na úrovni přeměny pokročilého adenomu v karcinom převáží účinek antiapoptoticky působících proteinů (survivinu) nad inhibičním histon deacetylázovým efektem butyrátu a dochází k poklesu apoptózy. Dalším vysvětlením je skutečnost, žemíra navozené apoptózy inhibitory histon deacetylázy je vždy v zápětí snižována „aktivací záchranných drah“ (AKT, JAK/ STAT, ERK), k čemuž dochází na podkladě efektu mitogenů secernovaných z apoptotických buněk [36–38].

Efektivním přístupem k terapii CRC by tak mělo být kombinované použití apoptózu indukujících léčiv (inhibitory histon deacetylázy, např. butyrát) spolu s agens, které suprimují všechny kompenzatorní „záchranné dráhy“ aktivované během procesu apoptózy. Aplikace těchto poznatků do klinické praxe by vzhledem k incidenci CRC v ČR byla mimořádně účelná.

Práce vznikla v rámci řešení grantu IGA NT/ 13413.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 7. 6. 2016

Přijato/: 5. 7. 2016

MU Dr. Darina Kohoutová, Ph.D.

II. interní gastroenterologická klinika

LF UK a FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

darina.kohoutova@fnhk.cz