Molekulárně spektroskopická analýza krevní plazmy –  cesta k diagnostice karcinomu pankreatu?

Souhrn

Karcinom pankreatu je nádorové onemocnění s nepříznivou prognózou. Odhaduje se, že se do konce desetiletí stane jednou z hlavních příčin úmrtí na nádorová onemocnění vůbec. Pouze časná dia­gnostika může tento nepříznivý trend změnit. K selekci rizikové skupiny pa­cientů je potřeba efektivního bio­markeru. Cílem pilotní studie je nalezení nových specifických spektrálních markerů karcinomu pankreatu použitím nepolarizovaných metod molekulové spektroskopie (Ramanova spektroskopie) v kombinaci s chiroptickými metodami citlivými ke strukturním změnám chirálních molekul (elektronový cirkulární dichroismus a Ramanova optická aktivita).

Metody:
U 10 pa­cientů s karcinomem pankreatu a 23 zdravých kontrol byl proveden odběr krve s následnou separací a konzervací získaného materiálu. Kombinací metod chiroptické a vibrační spektroskopie byly vyšetřeny vzorky pa­cientů i kontrol.

Výsledky:
V pilotní studii s omezeným počtem vzorků bylo použitím statistického modelu dosaženo po křížové validaci 85– 90% senzitivity, tedy lepší ve srovnání s doposud jediným klinicky dostupným bio­markerem CA 19-9.

Závěr:
Získané výsledky jsou vhodné k dalšímu testování na větším souboru pa­cientů. Spektroskopické vyšetření rizikových pa­cientů by mohlo být součástí screeningového procesu.

Klíčová slova:
nádory slinivky břisní – krevní plazma – biologické markery – spektroskopie – cirkulární dichroismus – Ramanova optická aktivita – chiralita

Úvod

Incidence a mortalita karcinomu pankreatu (KP) v ČR i ve světě narůstá. Podle odhadů se do roku 2020 stane KP druhou nejčastější příčinou úmrtí na nádorová onemocnění [1]. Z důvodu, že až 80 % pacientů s KP je v čase dia­gnózy ve stadiu generalizace, blíží se mortalita KP ke 100 % a je téměř shodná s incidencí [2]. Bez možnosti chirurgické léčby, jediné efektivní terapie KP, je prognóza nepříznivá [3]. Pa­cienti s časným neinvazivním KP dosahují po operaci významně lepšího přežití ve srovnání z pozdním stadiem (85,7 % pro stadium 0; 68,7 % pro stadium Ia; 23,8 % v případě stadia Ib a 2,3 % pro pozdní stadia) (tab. 1) [1,4].

Moderní diagnostické postupy –  zobrazovací metody a bio­markery –  jsou neefektivní, neboť bývají aplikovány pozdě, teprve až po objevení klasických symptomů KP –  ikteru, cholangitidy, kachexie či bolestí břicha a zad [5].

Na druhou stranu jsou známy i časné symptomy KP, které však zatím nenacházejí klinické využití. U většiny pacientů s KP se přitom objevují 2– 3 roky před diagnózou [6– 9]. I přes dostatečně dlouhé diagnostické okno je detekce časného KP nedostatečná a odráží se v malém počtu zachycených časných klinických stadií. V roce 2012 bylo v ČR evidováno pouze 4,7 % pacientů ve stadiu I a 11,3 % ve stadiu II [4]. Diagnostika KP tedy nadále spoléhá pouze na sérové biomarkery s nízkou efektivitou a zobrazovací metody. Protože žádný z biomarkerů nedosahuje dostatečné senzitivity a specificity, nemůže být použit ve screeningovém programu ani u pacientů s vysokým rizikem KP. Např. karbohydrát antigen 19-9 (CA 19-9) ze skupiny glykoproteinových biomarkerů KP (MUC –  mucin core proteins) je dle doporučení European Society for Medical Oncology z roku 2015 vhodný pouze k odhadu prognózy a sledování odpovědi na léčbu a ne k časné diagnostice KP [10]. Hledání biomarkerů ze skupiny MUC, miRNA (inhibitor messengerové ribonukleové kyseliny) a cirkulujících nádorových buněk je předmětem celé řady současných preklinických i klinických studií [11– 14]. Souběžně nacházejí značné uplatnění genomické a proteomické diagnostické metody [15– 18]. Nedávné proteomické studie se zaměřily na hledání sérového biomarkeru časného stadia KP. Od zdravé populace je možné nemocné s časným karcinomem odlišit např. na základě sledování rozdílů signálů a změn 3D struktury plazmatických biomolekul [19,20]. Analýza krevní plazmy jako celku (všech obsažených biomolekul, ne pouze jednoho biomarkeru) je metoda s velkým potenciálem pro diagnózu KP na molekulární úrovni. Cílem naší pilotní studie je nalezení nových specifických spektrálních markerů KP použitím nepolarizovaných metod molekulové spektroskopie (Ramanova spektroskopie) v kombinaci s chiroptickými metodami citlivými ke strukturním změnám chirálních molekul (elektronový cirkulární dichroismus a Ramanova optická aktivita) [17]. Kombinací těchto metod lze pozorovat stereochemické a konformační změny nejen plazmatických, ale i jiných cirkulujících bio­molekul a jejich metabolitů [20].

Materiál a metody

Pacienti

Do této pilotní studie bylo zařazeno 10 pa­cientů s KP a 23 kontrolních jedinců, jejichž výběr byl proveden na Interní klinice 1. LF UK a ÚVN –  VFN v Praze. Průměrný věk pa­cientů s KP a kontrol byl 66 ± 7 let, resp. 61 ± 8 let. Pa­cienti s KP byli vyšetřeni dle doporučených postupů, vč. cytologické verifikace karcinomu [21]. V rámci stagingu bylo doplněno CT břicha s intravenózní a perorální kontrastní látkou s použitím třífázového pankreatického protokolu [22]. Hodnocení bylo prováděno zkušeným cytopatologem a radiologem. Ve všech případech se jednalo o pokročilá stadia III a IV dle TNM klasifikace. V rámci odběru krve bylo provedeno základní bio­chemické vyšetření, vč. stanovení hladiny sérového albuminu, celkové bílkoviny, glykemie a hladiny CA 19-9. Kontrolní skupinu tvořili zdraví dárci, s vyrovnanou distribucí obou pohlaví. Všem kontrolním jedincům byla rovněž provedena základní klinická vyšetření vč. podrobné anamnézy a laboratorní analýzy krve. Na základě výsledků těchto vyšetření nebylo shledáno podezření na KP ani diabetes. Studie byla provedena v souladu se zásadami uvedenými v Helsinské deklaraci a schválena Etickou komisí ÚVN –  VFN v Praze. Všichni jedinci zařazení do studie podepsali informovaný souhlas.

Krevní plazma

Po endosonografickém vyšetření byla všem pacientům odebrána žilní krev do sterilních, antikoagulantem ošetřených odběrových zkumavek (BD Vacutainer Systems, Velká Británie). Po odběru byla provedena centrifugace vzorků při 1 500 g po dobu 10 min; následně byly získané frakce krevní plazmy zamrazeny, transportovány v termoboxu při teplotě suchého ledu (– 78 °C) na Ústav analytické chemie, VŠCHT v Praze, kde byly nadále skladovány v hlubokomrazicím boxu při teplotě – 80 °C. Před kaž­dou analýzou byly vzorky plazmy volně rozmrazeny při pokojové teplotě a pro odstranění reziduálních částic filtrovány přes PVDF membránový filtr s porozitou 0,45 µm (Grace, USA) při 13 000 g po dobu 10 min.

Ramanova optická aktivita a Ramanova spektroskopie

Ramanova spektra a spektra Ramanovy optické aktivity byla zaznamenávána simultán­ně na spektrometru ChiralRAMAN-2X^TM (BioTools, Inc., USA), který je vybaven systémem Opus 2W/ mpc6000 (Laser Quantum, Velká Británie) s excitační vlnovou délkou 532 nm. Zfiltrované vzorky krevní plazmy (100 µl) byly měřeny v kyvetě o rozměrech 4 × 4 × 10 mm ošetřené antireflexní vrstvou (BioTools, Inc., USA). Teplota analyzovaného vzorku (15 °C) byla kontrolována pomocí Peltierova článku vlastní výroby. Pro získání kvalitních spekter s rozlišením ~ 7 cm^– 1 ve spektrálním rozsahu 2 500– 90 cm^– 1 jsme vyvinuli metodiku měření [19] sestávající z přídavku zhášedla fluorescence, vysvěcování vzorku laserem pro urychlení zhášení fluorescence a záznamu spekter. Pro eliminaci zbytkové distorze pozadí bylo využito Fourierova filtru.

Elektronový cirkulární dichroismus

Analýzy elektronového cirkulárního dichroismu (ECD) byly provedeny na spektrometru J-815 (Jasco, Japonsko), který umožňuje kontrolu teploty vzorků. Pro měření při kratších vlnových délkách byly zfiltrované vzorky naředěny v poměru 1 : 3 v/ v sterilním fosfátovým pufrem o pH = 7,4. Zředěné vzorky (20 µl) byly analyzovány v křemenné kyvetě s délkou optické dráhy 0,01 mm (Hellma, Německo) v oblasti 185– 260 nm. Pro každý vzorek bylo zaznamenáno šest spekter s rozlišením 0,1 nm; spektra byla následně zprůměrována v modulu Spectra Analysis programu Spectra Manager, verze 2.6.0.1 (Jasco, Japonsko).

Před spektrálním měřením a po něm byly všechny použité kyvety vyčištěny roztokem Starna CellClean (Starna Scientific Ltd., Velká Británie), opakovaně propláchnuty demineralizovanou vodou a metanolem a následně vysušeny.

Statistické zpracování

Pro odlišení pacientů s KP a kontrolní skupiny byla získaná spektrální data vyhodnocena s použitím lineární diskriminační analýzy v programu XLSTAT (Addinsoft, Francie). Pro vybrané oblasti spekter, ve kterých jsou obsaženy informace o struktuře plazmatických biomolekul a jejich možné změny, byl vytvořen statistický model. Zároveň byla stanovena senzitivita a specificita použitého klasifikačního modelu. K ověření jeho platnosti a vypovídací schopnosti byla rovněž provedena křížová validace typu leave-one-out a výpočet hodnot pro křivku ROC (receiver operating characteristics).

Výsledky

Ramanova spektroskopie

V průměrných Ramanových spektrech pacientů s KP a kontrolních jedinců (obr. 1) jsou patrné tři intenzivní pásy náležící především vibracím karotenoidů (1 006, 1 156 a 1 517 cm^– 1), které jsou přítomny v plazmě v nízkých koncentracích. Vysoká intenzita těchto pásů v Ramanově spektru je zapříčiněna rezonančním zesílením po excitaci ve viditelné oblasti [23,24]. U skupiny kontrolních jedinců byla pozorována několikanásobně vyšší intenzita těchto pásů v porovnání s pacienty, což naznačuje možnou roli karotenoidů v procesu kancerogeneze. Ve spektrech je zároveň možné pozorovat změnu intenzity pásů typických pro proteiny s vysokým obsahem α-helikální struktury, a to především u 1 270 cm^– 1 v oblasti rozšířeného amidu III, který odpovídá vibracím peptidové vazby [20,25]. V krvi rovněž přítomné sacharidy a lipidy jsou zastoupeny pásy 960 a 1 450 cm^– 1 [20], jejichž intenzita byla nižší v případě pacientů s KP.

Ramanova optická aktivita

Ve spektrech Ramanovy optické aktivity (obr. 2) byla zaznamenána skupina pásů proteinů v oblastech amidu I (1 645, 1 674 cm^– 1) a amidu III (1 248, 1 311, 1 345 cm^– 1). Spektrální průběh v těchto oblastech je opět typický pro proteiny s vysokým obsahem α-helikálních struktur [15,16,20]. Výrazné pozitivní pásy 1 156 a 1 517 cm^– 1 vyskytující se ve spektrech kontrolních jedinců mohou být přiřazeny karotenoidům, přičemž některé z nich se překrývají s pásy aromatických aminokyselin [20].

Elektronový cirkulární dichroismus

Ve spektrech ECD (obr. 3) dominují tři pásy charakteristické pro sekundární strukturu proteinů [17,23]. Pozitivní pás 192 nm a dva částečně se překrývající negativní pásy 209 a 222 nm jsou výsledkem elektronových přechodů v rámci peptidové vazby. Intenzita a tvar těchto pásů se mění v závislosti na konformaci peptidového řetězce [20,26]. Průběh spekter odpovídá proteinům s vysokým obsahem α-helikální struktury [17,27], které jsou v krvi zastoupeny převážně lidským sérovým albuminem. Je patrné, že v případě pa­cientů s KP mají všechny tři uvedené pásy nižší intenzitu než ve spektrech kontrolních jedinců.

Lineární diskriminační analýza

Jelikož byly některé změny ve spektrech pacientů s KP a kontrolních jedinců obtížně pozorovatelné, byla získaná spektrální data vyhodnocena vícerozměrnými statistickými metodami. Cílem bylo odlišit pacienty od kontrolních jedinců na základě rozpoznání charakteristických spektrálních vzorů, určit senzitivitu a specificitu využitých spektroskopických metod a zároveň prokázat spolehlivost klasifikačního modelu vytvořeného pro kombinaci všech tří použitých metod.

Byla pozorována úplná separace skupiny pacientů s KP a kontrolních jedinců (obr. 4), přičemž celková správnost přiřazení jednotlivých vzorků do příslušných skupin činila 100 %. Specificita a senzitivita vytvořeného modelu dosahovaly vysokých hodnot i po provedení křížové validace, a to 90 %, resp. 87 % (tab. 2). Zároveň byly z křížové validace vypočteny hodnoty pro křivku ROC, kde plocha pod křivkou dosahovala hodnoty 0,907 (obr. 5).

Diskuze

V naší pilotní studii byl pomocí kombinace pokročilých spektroskopických metod vytvořen klasifikační model, který dosahuje hodnot senzitivity a specificity ~ 90 %.

U symptomatických pacientů s KP je senzitivita CA 19-9 79– 81 % a specificita 82– 90 % [28]. Výzkumem časného KP bez typických symptomů bylo potvrzeno, že CA 19-9 není vhodný detekční nástroj časného KP, zejména pro jeho nízkou pozitivní prediktivní hodnotu (PPV) 0,5– 0,9 % [29,30]. V rozsáhlém retrospektivním hodnocení 37 studií s 1 882 případů KP a kontrolní skupiny byla specificita CA 19-9 na úrovni 82,8 % [9]. Bohužel se v praxi také často setkáváme s falešně negativní hodnotou CA 19-9. Jedním z důvodů časté chybovosti je, že protilátka je vázána na oligosacharid –  krevní antigen Lewis A. U 5– 10 % pacientů s krevní skupinou A a antigenem Lewis A^– / B^–  je hladina CA 19-9 u KP nižší než 1,0 U/ ml [31]. Příčinou falešné negativity CA 19-9 mohou být i jiné patologické stavy, např. jaterní cirhóza, cholangitida, chronická pankreatitida a další gastrointestinální tumory [32]. Ve fázi pilotního projektu byl sledovaný soubor pacientů malý a zároveň naměřené hodnoty CA 19-9 vykazovaly značný rozptyl (28,5– 14 250 kU/ l) bez korelace se stadiem onemocnění. Kromě toho platí, že CA 19-9 není doporučen jako diagnostický biomarker [10]. Při předběžném hodnocení se však zdá, že naproti tomu spektrální biomarkery sledované v našem pilotním projektu nejsou zatíženy chybovostí, a to bez ohledu na hladinu bilirubinu, CRP či krevní skupinu, a je tedy možné je k diagnostice použít.

V současnosti bylo publikováno několik studií zabývajících se detekcí prekurzorů a premaligního stadia KP. Ze skupiny glykoproteinových mucinů dosáhl vysoké senzitivity a specificity MUC5AC u prekurzorových Pan-IN-1 lézí na myších modelech [12]. MUC je v séru pacientů s KP jen v omezeném množství a snaha o jejich detekci pomocí klasické immunoassay nepostačuje. Proto jsou testovány další techniky vhodné pro úpravy a měření vzorků (např. povrchem zesílená Ramanova spektroskopie), které jsou 100– 1 000× citlivější než konvenční metody [11,33]. Mezi další aberantně exprimované muciny patří CA 50, CA 19-5, CA 125/ MUC16, CA 242, CAM 17.1, MUC4, MUC5AC, DUPAN 2, PAM4 a SPan-1. Pro sporné výsledky však zatím nejsou v klinické praxi využívány [13,14].

Další práce zabývající se časnou detekcí KP studovaly efektivitu miRNA. Rodinu miRNA tvoří asi 2 000 molekul, jejichž hlavní funkce spočívá v inhibici translace mes­sengerové RNA (mRNA) a degradaci transkriptu. Byla prokázána exprese různých forem miRNA v plazmě jedinců s KP [18]. Kombinace některých miRNA s CA 19-9 dosahuje vyšší senzitivity než pro CA 19-9 samotné [34].

Zajímavé je zjištění, že již v časných fázích nádorové onkogeneze jsou v cirkulaci přítomné pankreatické buňky. Diseminace pankreatických buněk v prostředí časného KP je označována jako cirkulující pankreatické buňky (CPCs). Cirkulující přednádorové buňky se objevují u PanIN-1 a PanIN-2 a dokonce i u BRCA mutace. Rhim et al [35] ověřili sledované změny klinicky a prokázali CPCs asi u 30 % pacientů s intraduktální papilární mucinózní neoplazií (IPMN) zatím bez morfologických změn typických pro KP. Detekce CPCs v séru je také jedním z potenciálních biomarkerů časného stadia KP [36].

V našem pilotním projektu byly potvrzeny předpokládané rozdíly v signálech charakterizujících odlišnosti 3D struktury plazmatických bílkovin a dalších plazmatických biomolekul. Hlavní rozdíly byly zjištěny nejen v sekundární struktuře proteinů krevní plazmy, ale i dalších molekul jako lipidů, sacharidů, aromatických aminokyselin a karotenoidů. Zejména poslední zmiňovaná molekula byla v různých intenzitách zachycena v Ramanových spektrech i pomocí ROA. V plazmě pacientů s KP byla pozorována nízká intenzita karotenoidů. Účast karotenoidů v procesu onkogeneze zřejmě souvisí se změnou mikroprostředí a navozením dezmoplastické reakce aktivací stellate cells [37]. Tyto buňky jsou schopné se transformovat z klidového stadia do stadia aktivního, kdy se podílejí na fibroprodukci. Retinoidy na modelech KP u transgenních myší indukovaly vznik klidového stadia stellate cells, a tím navodily inhibici růstu KP [38]. Karotenoidy jsou těsně propojeny s nádorovou progresí KP a jak se ve fázi pilotního projektu zdá, jsou dobře definovatelné pomocí citlivých spektroskopických metod. Zjištění rozdílů v intenzitách spektrálních pásů karotenoidů mezi pacienty s KP a kontrolami má v tuto chvíli informativní charakter. Tento nález a jeho případnou korelaci s KP bude třeba řádně prozkoumat.

Hlavním limitem většiny studií zabývajících se bio­markery KP je samotné testování využívaných metod a postupů na detekci časného karcinomu u pokročilých stadií nádorů. I v této studii byl spektroskopický biomarker testován pouze u pozdních stadií KP, protože časná stadia se v diagnostické praxi vyskytují extrémně vzácně a do této pilotní studie nebylo možno takové pacienty zahrnout. Příslibem do budoucna by jistě mohl být navazující projekt testování pacientů s IPMN, které jsou pokládány za prekurzory KP.

Závěr

Časná diagnostika KP s cílem detekce operabilního stadia vyžaduje identifikaci efektivního biomarkeru. Je testováno několik kandidátů ze skupiny biomarkerů časného KP, ale zatím nejsou dostupné pro běžnou klinickou praxi. CA 19-9 je sice klinicky dostupný, ale jako marker časného karcinomu není vyhovující. V této studii byla testována specificita a senzitivita nového spektrálního biomarkeru charakterizovaného vybranými změnami všech bio­molekul krevní plazmy. Pro obě sledované charakteristiky bylo dosaženo hodnot ~ 90 %, což je více než doposud publikované výsledky pro CA 19-9. Jedním z dalších úkolů je spektroskopické vyšetření rizikových pa­cientů s recentně diagnostikovanou poruchou glukózové tolerance, s premaligním stadiem karcinomu a familiárními rizikovými syndromy.

Tato studie byla realizována v rámci projektů Interní grantové agentury Ministerstva zdravotnictví ČR (NT 13638, NT 14254-3 a NT 13259-3), Grantové agentury Ministerstva obrany ČR (MO 1012) a Grantové agentury ČR (P208/ 11/ 0105). Práce byla dále podpořena Operačními programy Praha –  Konkurenceschopnost (CZ.2.16/ 3.1.00/ 22197 a CZ.2.16/ 3.1.00/ 21537), Národním programem udržitelnosti (NPU MŠMT –  LO1215; 34807/ 2013) a Účelovou podporou na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT 20/ 2015).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 5. 11. 2015

Přijato: 30. 11. 2015

MU Dr. Bohuš Bunganič

Interní klinika 1. LF UK a ÚVN –  VFN

U Vojenské nemocnice 1200

169 02 Praha 6

bohus.bunganic@uvn.cz