Nový cytokin IL-40 v patogenezi revmatických onemocnění

Souhrn

IL-40 je recentně popsaný cytokin asociovaný s malignitami a revmatickými autoimunitními onemocněními. Jeho produkce je vázána především na imunitní buňky, zejména na aktivované B-lymfocyty a neutrofily. U revmatických onemocnění se IL-40 hojně vyskytuje lokálně v místě postižení i systémově. Hladiny IL-40 v synoviální tekutině a v séru jsou zvýšené u pacientů s revmatoidní artritidou (RA) a korelují s aktivací neutrofilních leukocytů a s hladinami autoprotilátek. Sérové hladiny IL-40 u pacientů s RA klesají vlivem podání různých léčivých přípravků. IL-40 se účastní regulace zánětlivého procesu a destrukce tkáně u RA prostřednictvím aktivace neutrofilů a synoviálních fibroblastů. Zvýšená exprese IL-40 byla demonstrována v séru a ve slinných žlázách u pacientů se Sjögrenovým syndromem. Na základě současných znalostí se IL-40 jeví jako multifunkční cytokin účastnící se patogeneze chronických autoimunitních zánětlivých onemocnění.

Klíčová slova:

revmatoidní artritida – systémový lupus erythematodes – IL-40 – Sjögrenův syndrom

ÚVOD

Cytokiny jsou nízkomolekulární proteiny uvolňované aktivovanými imunitními nebo tkáňovými buňkami. Udržují homeostázu organismu a hrají roli v buněčné komunikaci a interakci. V patogenezi autoimunitních revmatických onemocnění představují cytokiny klíčové efektory a dysregulace jejich hladin přispívá k rozvoji a progresi onemocnění (1). Intenzivní výzkum v oblasti revmatických onemocnění během posledních 20 let přispěl k rozšíření obzorů v oblasti autoimunitního zánětu a tím i k dramatickým změnám v léčbě. Vývoj biologických léků cílených na cytokiny (IL-1α, IL-1β, IL-6, TNF, IL-18, IL-33 atd.) umožnil jejich blokování pomocí monoklonálních protilátek, solubilních receptorů nebo rekombinantních vazebných proteinů (2). U revmatoidní artritidy (RA) přispělo zacílení léčebných možností na jednotlivé cytokiny k navození remise u většího počtu pacientů než v minulosti, ale i přesto asi u jedné třetiny z nich nedochází ke klinicky významnému zlepšení (3). To je jedním z důvodů, proč jsou zkoumány další nové perspektivní molekuly, které by se mohly stát ukazatelem vývoje nemoci anebo novým cílem léčby. Jedním z nově popsaných a velmi málo prozkoumaných cytokinů je interleukin 40 (IL-40), malý sekretovaný protein, jehož zvýšená exprese u nádorových a autoimunitních onemocnění a funkční biologické vlastnosti naznačují možnou spojitost s regulací chronického zánětu. Cílem této přehledné práce je shrnout a diskutovat současné poznatky o IL-40.

INTERLEUKINY

Interleukiny představují významnou podskupinu extracelulárních signálních molekul v rámci rozsáhlé skupiny cytokinů. Pojem interleukin byl poprvé použit v roce 1979 při popisu dvou molekul podobné molekulové hmotnosti uvolňovaných a regulující leukocyty a následně označených jako IL-1 a IL-2 (4). Do současnosti bylo identifikováno dalších 38 interleukinů, které jsou tříděné na základě biologických funkcí a strukturních odlišností.

Klasifikace cytokinů je značně složitá a byla v průběhu let několikrát přepracovávána. Jejich jednoznačné třídění komplikuje fakt, že většina cytokinů je pleiotropních, každý cytokin má více překrývajících se funkcí a každá funkce může být potenciálně zprostředkovaná více než jedním cytokinem. Navíc některé cytokiny mohou působit jak patologicky, tak i protektivně, v závislosti na prostředí, kontextu choroby, ale také na samotném množství cytokinu (5).

V literatuře se proto setkáváme s různými způsoby třídění. Základní klasifikace rozlišuje mezi cytokiny prozánětlivými a protizánětlivými. Ze skupiny cytokinů tlumících zánět jsou nejznámější zejména IL-10 a transformující růstový faktor β (TGF-β ), naopak prozánětlivé vlastnosti se přisuzují např. cytokinům IL-1, IL-6, tumor nekrotizujícímu faktoru (TNF), IL-12 a dalším (5). Cytokiny se dále rozřazují do skupin tzv. pomocných T-buněk (Th, z angl. T helper), z nichž každá je charakterizována jiným cytokinovým profilem, který často určuje název skupiny. Takto můžeme rozdělit cytokiny např. na skupiny Th1 (INFγ, TNF), Th2 (IL-4, IL-5, IL-13), Th9 (IL-9), Th17 (IL-17, IL-22, IL-21, IL-25 a IL-25), Th22 (IL-22) nebo na skupinu regulačních T-buněk (Treg) (IL-10, TGF-β ) (6). Jednotlivé Th skupiny se zapojují v průběhu různých fyziologických i patologických procesů, mohou spolu kooperovat, účinkovat ve vzájemném protikladu, a některé skupiny mezi sebou i regulovaně přecházet (6). Dle strukturní podobnosti samotného cytokinu a jeho receptoru je zavedeno třídění např. u cytokinů skupiny IL-1 (IL-1, IL-18 a IL-33, IL-36, IL-37 a IL-38), jejíž interleukiny silně regulují zánět (7), nebo IL-12 (IL-12, IL-23, IL-27 a IL-35, IL-39), ve které nacházíme podobnost samotných cytokinů i jejich receptorů (8). Podobně je tomu u skupiny interleukinů IL-2 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21), jejichž receptory sdílí jednu z podjednotek (γc) (9). Funkční třídění umožňuje shrnout do skupin různorodé molekuly, které mají podobný účinek nebo se uplatňují při stejném procesu. Takovou skupinou je např. IL-10. Pomineme-li ostatní růstové a regulační faktory, tuto skupinu charakterizují interleukiny IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26 a někdy také IL-28, IL-29, které se uplatňují převážně při tlumení imunitní odpovědi, reparaci a v pozdějších fázích zánětu (10). V roce 2018 navrhli autoři Catalan-Dibene et al. novou skupinu cytokinů označenou jako tzv. „orphan“ cytokiny, kam spadá několik relativně nově popsaných interleukinů, které jsou jedinečné svou strukturou a nelze je zařadit do žádné z dosud známých skupin (11). Do této malé skupiny zahrnující pouze IL-32 a IL-34 byl prozatím zařazen i nový cytokin IL-40.

OBECNÁ CHARAKTERISTIKA

IL-40 Interleukin 40 (IL-40) je nově identifikovaný cytokin, který se účastní regulace humorální imunity, homeostáze B-lymfocytů a imunitní odpovědi (12–13, 16). Byl popsán v roce 2017 jako malý (27 kDa) sekretovaný protein kódovaný genem C17orf99 (chromosome 17 open reading frame 99) (12). Gen C17orf99 se vyskytuje pouze u savců a byl výzkumným týmem Catalan-Dibene et al. cíleně vyselektován k podrobnému studiu z databáze exprese lidských genů (BIGE – body index of gene expression) na základě jeho zvýšené exprese v orgánech a buňkách asociovaných s imunitním systémem (12, 14, 15). Zajímavé je, že IL-40 nesdílí žádnou strukturní doménu, motiv nebo sekvenční podobnost s jakýmkoliv jiným cytokinem, a proto byl zařazen do kategorie tzv. „orphan cytokinů“, kam spolu s ním patří i další dva cytokiny IL-32 a IL-34 (11). Pomocí genových studií byla nejprve detekována zvýšená exprese IL-40 v hematopoetických tkáních, jako jsou kostní dřeň, fetální játra a v aktivovaných B-lymfocytech (12, 14, 15). Novější práce odhalily expresi IL-40 na proteinové úrovni u širšího spektra imunitních buněk a také v synoviálních fibroblastech (13, 16).

Na myším modelu byla demonstrována zvýšená produkce IL-40 v mléčné žláze po zahájení laktace (12). U myší s inaktivovaným genem pro IL-40 byly pozorovány snížené hladiny IgA v séru, střevě a mléčné žláze (12). Tato zvířata dále vykazovala změny na úrovni mikrobiomu, pravděpodobně vlivem nízkých hladin IgA ve střevě způsobených sníženým počtem buněk produkujících IgA (12). U myší s inaktivovaným genem pro IL-40 byly také pozorovány anomálie v populacích B-lymfocytů a diskutován vliv IL-40 na vývoj B-lymfocytů (12). V in vitro podmínkách je IL-40 zvýšeně exprimován B-lymfocyty po ovlivnění různými molekulami, jako jsou anti-CD40 monoklonální protilátka, anti-IgM a IL-4, a tato exprese je dále umocněna transformujícím růstovým faktorem (TGF)-β1 (12).

Nové genové studie poukázaly na možné zapojení C17orf99/IL-40 do patogeneze lidských lymfomů (12, 17, 18). Konstitutivní exprese IL-40 byla zjištěna u několika buněčných linií non-hodgkinského lymfomu (OCI-Ly 1, HL-2, a Val) (17). Rozdílná exprese genu C17orf99 byla demonstrována u jednotlivých podtypů difuzního velkobuněčného B-lymfomu (18). Z těchto dostupných studií je zřejmá spojitost mezi IL-40 a B-lymfocyty u nádorových onemocnění. Navíc je obecně známo, že B-lymfocyty hrají významnou roli v patogenezi autoimunitních revmatických onemocnění (19), kde má i aplikace anti-CD20 protilátek prokazatelný terapeutický benefit (20). První studie poukazující na možnou asociaci IL-40 s autoimunitním procesem pochází již z roku 2012 a týkala se genu C17orf99 kódujícího IL-40. Práce autorů Zingaretti et al. identifikovala gen C17orf99 jako jeden ze čtyř autoantigenů rozlišujících autoimunitní hepatitidu od zdravých kontrol (21). Studie skupiny Gao et al. z roku 2021 zaměřená na protizánětlivý cytokin IL-38 ukázala, že v kultuře buněk respiračního epitelu s makrofágy dochází k významnému snížení exprese C17orf99 vlivem IL-38 (22), což indikuje možnou roli IL-40 v zánětlivém procesu.

VÝZNAM IL-40 U REVMATICKÝCH ONEMOCNĚNÍ

Revmatoidní artritida (RA)

RA je autoimunitní onemocnění charakterizované chronickým zánětem synoviální tkáně, tvorbou autoprotilátek a následným rozvojem erozivního poškození kloubů. Klíčovou roli v patogenezi RA zaujímají imunitní buňky a aktivované fibroblasty, které jsou zdrojem prozánětlivých cytokinů a molekul účastnících se destrukce kloubních tkání (23).

V naší recentní studii jsme prokázali zvýšenou expresi cytokinu IL-40 v synoviální tkáni pacientů s RA v porovnání s kontrolní tkání jedinců s osteoartrózou (OA) (13). IL-40 byl hojně exprimován většinou buněk synoviální tkáně. Pomocí imunohistochemického barvení synoviální tkáně jsme detekovali IL-40 v synoviálních fibroblastech intimy a v imunitních buňkách zánětlivého infiltrátu (B- a T-lymfocyty, makrofágy a neutrofily) (13). Současně byly zjištěny až 30násobně zvýšené hladiny IL-40 v synoviální tekutině pacientů s RA oproti OA. Hladiny IL-40 byly zhruba trojnásobně zvýšené i v séru pacientů s RA oproti OA a zdravým jedincům a významně korelovaly s hladinami IL-40 v synoviální tekutině (13). U pacientů s RA léčených terapií založené na depleci B-buněk (rituximabem) jsme pozorovali pokles systémových hladin IL-40 současně se snížením počtu B-lymfocytů a poklesem aktivity onemocnění. Naopak jsme u pacientů s RA nepozorovali vliv TNF blokující léčby na hladiny IL-40 (13). V séru i v synoviální tekutině byly koncentrace IL-40 významně vyšší u séropozitivní oproti séronegativní RA. S tím souvisí i významný vztah IL-40 s autoprotilátkami revmatoidním faktorem (RF) -IgM a s protilátkami proti citrulinovaným peptidům (anti-CCP) v séru i v synoviální tekutině (13). Navíc vysoké koncentrace IL-40 v synoviální tekutině korelovaly s aktivitou RA (DAS28-ESR) a počtem oteklých kloubů. Zjistili jsme i přímý vztah IL-40 k počtu neutrofilů v synoviální tekutině a k chemokinům IL-8 a MIP-1α, které přímo souvisejí s aktivací neutrofilů (13). V neposlední řadě jsme prokázali asociaci IL-40 s molekulami proteinázy 3 (PR3) a neutrofilové elastázy (NE), které jsou externalizovány neutrofily během NETózy – procesu uvolňování neutrofilových sítí (13), který ve zvýšené míře probíhá u autoimunitních onemocnění včetně RA (23). V in vitro podmínkách indukuje IL-40 u RA synoviálních fibroblastů sekreci chemokinů IL-8, MCP-1 a matrix degradující metalloproteinázy 13 (MMP-13) (13).

Na souboru pacientů s časnou RA jsme odhalili, že systémové hladiny IL-40 jsou zvýšené již v počáteční fázi rozvoje nemoci a normalizují se po 3 měsících konvenční léčby (dosud nepublikovaná data). Hladiny IL-40 korelují s hladinami NETózových markerů (PR3 a NE) před léčbou a s klesajícími hladinami IL-40 během léčby dochází i k významnému poklesu PR3 a NE. Změny hladin IL-40 v čase pozitivně korelují se změnami koncentrací výše zmíněných parametrů NETózy (dosud nepublikovaná data). V in vitro podmínkách byla zjištěna zvýšená sekrece IL-40 neutrofily od pacientů s časnou RA ovlivněnými různými prozánětlivými faktory (IL-1β, IL-8, TNF, LPS). Kromě toho jsme ukázali, že IL-40 je také uvolňován neutrofily, u nichž byla indukována NETóza pomocí forbol myristát acetátu (PMA) – látky běžně používané k umělé stimulaci NETózy v laboratorních podmínkách. Neutrofily ovlivněné IL-40 proteinem vykazují zvýšenou sekreci cytokinů IL-1β a TNF (dosud nepublikovaná data).

Ze současných poznatků vyplývá, že aktivované neutrofily představují významný zdroj IL-40 u pacientů s RA. V synoviální tekutině postiženého kloubu pacientů s RA zřejmě dochází vlivem prozánětlivých cytokinů nebo faktorů spouštějících NETózu k aktivaci neutrofilů a následkem toho k aktivní nebo pasivní sekreci IL-40. Extracelulární IL-40 stimuluje neutrofily k produkci prozánětlivých cytokinů, které pozitivní zpětnovazebnou smyčkou stimulují další sekreci IL-40. Je také pravděpodobné, že IL-40 aktivuje fibroblasty přilehlé synoviální tkáně k produkci cytokinů a matrix degradujících enzymů a tím se významně podílí na patogenezi RA (obr. 1).

Systémový lupus erythematodes

Systémový lupus erythematodes (SLE) je autoimunitní onemocnění charakterizované multisystémovým postižením, především kůže a kloubů, často také ledvin, kardiovaskulárního systému, krvetvorby, plic a centrálního nervového systému (25). Typická je hyperaktivita B-lymfocytů, která vede k tvorbě autoprotilátek zaměřených proti orgánově nespecifickým antigenům (26). Vzhledem k prokázané asociaci IL-40 s aktivovanými B-lymfocyty (13), byla v rámci studie IL-40 u RA provedena analýza sérových hladin IL-40 i u kohorty pacientů se SLE (13). Překvapivě jsme zjistili, že koncentrace IL-40 v séru pacientů se SLE jsou srovnatelné s hladinami u zdravých jedinců a pacientů s OA (13). Navíc hladiny IL-40 nekorelovaly s aktivitou onemocnění (SLEDAI), zánětem ani s postižením kloubů, plic, ledvin nebo centrálního nervového systému (předběžná data). V kontextu s výsledky u RA, kde lokální hladiny IL-40 až desetinásobně převyšují systémové, by tyto negativní výsledky u SLE mohly signalizovat, že exprese IL-40 není pravděpodobně vázána na systémovou povahu onemocnění a ani přímo nesouvisí s hyperaktivitou B-lymfocytů u SLE.

Sjögrenův syndrom (SS)

SS je chronické zánětlivé autoimunitní onemocnění postihující exokrinní žlázy, zejména slzné a slinné. V důsledku narušení funkcí T-lymfocytárního systému dochází k infiltraci lymfocytů do žláz, destrukci žlázového parenchymu a tím ke ztrátě funkcí postižených žláz (27). Charakteristická je také přítomnost antinukleárních protilátek, anti-Ro (anti-SS-A) a anti-La (anti-SS-B) či revmatoidních faktorů. SS je spojený se zvýšeným rizikem non-hodgkinských lymfomů. Rizzo et al. ve své studii prokázali zvýšené množství IL-40 ve slinných žlázách pacientů s primárním SS oproti kontrolním vzorkům od pacientů s nespecifickou sialodenitidou, a to jak na genové, tak i proteinové úrovni (16). Byla pozorována významná pozitivní korelace mezi IL-40 mRNA a fokusovým skóre u pacientů s primárním SS. Exprese IL-40 korelovala se zvýšenou expresí IL-4 a TGF-β u pacientů s primárním SS na úrovni mRNA i proteinu (16). Podrobnější imunohistochemické a cytometrické analýzy ukázaly, že IL-40 je tvořen především B-lymfocyty, ale také T-lymfocyty a makrofágy. Signifikantně zvýšené byly i sérové hladiny IL-40 u pacientů s primárním SS oproti kontrolní skupině. Vysoká exprese IL-40 asociovaná s vysokým fokus skóre byla zjištěna v příušních žlázách pacientů s primárním SS asociovaným s non-hodgkinským lymfomem (16).

ZÁVĚR

IL-40 představuje recentně identifikovaný a velmi málo probádaný cytokin. Z několika dosud publikovaných prací je ale již nyní zřejmé, že se jedná o multifunkční protein asociovaný s maligními, autoimunitními a zánětlivými pochody. V současnosti je možné konstatovat, že IL-40 se účastní patogeneze autoimunitních revmatických onemocnění, jako jsou RA a SS. IL-40 je ve zvýšené míře akumulován lokálně v místě zánětu i systémově, a za jeho produkci jsou zodpovědné jak imunitní buňky, zejména B-lymfocyty a neutrofilní leukocyty, tak buňky pojivové tkáně. Korelace IL-40 s autoprotilátkami, cytokiny, chemokiny a s parametry odrážejícími aktivaci neutrofilů naznačuje jeho možnou roli v iniciaci zánětu v časné fázi rozvoje imunitně podmíněných onemocnění, konkrétně RA. Současná exprese IL-40 s profibrotickými faktory u SS ukazuje na spojitost s procesy tkáňové remodelace. V souladu s výše zmíněným jsou i poznatky získané in vitro studiemi demonstrující vliv extracelulárního IL-40 na imunitní odpověď a na molekuly zapojené do procesu tkáňového poškození. Navíc se ukázalo, že systémové hladiny IL-40 významně klesají po aplikaci různých léčebných přístupů. Na základě zjištěných poznatků lze předpokládat zvýšené množství IL-40 i u dalších revmatických autoimunitních onemocnění a jeho možné využití jako markeru pro monitorování průběhu onemocnění nebo možného terapeutického cíle.

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Lucie Andrés Cerezo, PhD.

Revmatologický ústav

Na Slupi 4

128 50 Praha 2

e-mail: andres-cerezo@revma.cz

Autoři prohlašují, že nejsou v konfliktu zájmů.

Do redakce doručeno: 26. 4. 2022

Práce byla podpořena MHCR023728, SVV260523 a AZV-NU21-05-00276.