Využívanie súčasných poznatkov tkanivového inžinierstva pri príprave kožných náhrad

Souhrn

Náhrada kožných defektov, najmä pri rozsiahlych popáleninách, je kľúčovým krokom pri znížení mortality pacientov. Od autológnych a alogénnnych kožných náhrad dnes smeruje vývoj v oblasti tkanivového inžinierstva k biosyntetickým a kombinovaným kožným náhradám, pripomínajúcím štruktru normálnej kože. V súčasnosti existuje viacero typov takýchto náhrad: kultivované alogénne a autológne keratinocyty, alo/autológne kompozity, acelulárne matrice, matrice na princípe biologických substancií typu kolagén/kyselina hyalurónová a matrice kombinované s rôznymi typmi buniek (keratinocyty, dermálne fibroblasty, kmeňové bunky). Vývoj v oblasti kožných náhrad smeruje postupne k vytvoreniu plne funkčnej kožnej náhrady, ktorá by nelen pripomínala kožu svojou štruktúrou, ale zabezpečila by aj cievne zásobovanie konštruktu, inerváciu, obsahovala by štruktúry, ktoré sa v koži nachádzajú (vlasové folikuly, potné žľazy). Vytvorenie takejto kožnej náhrady si bude vyžadovať spoluprácu širokého spektra odvetví: molekulárnej biológie, vied o materiáloch, genetického a tkanivového inžinierstva, počítačových odborníkov a samozrejme lekárov, špecialistov v odbore popáleninovej medicíny a plastickej chirurgie. Pokrok na tomto poli v posledných rokoch dáva nádej, že v budúcnosti sa skutočne podarí vytvoriť plne funkčnú náhradu kože. V tejto práci sme sa snažili podať stručný prehľad toho, čo je k dispozícii v súčasnosti v oblasti kožných náhrad.

Kľúčové slová:
tkanivové inžinierstvo, alotransplantáty, autotransplantáty, amniová membrána, somatické bunky, kmeňové bunky, biomateriály, kožné náhrady.

ÚVOD

Tkanivové inžinierstvo je nová oblasť biotechnológie, ktorá kombinuje rozličné aspekty medicíny, bunkovej a molekulárnej biológie, materiálových vied a inžinierstva na účely regenerácie alebo náhrady ľudských tkanív. Dnes rozlišujeme dve oblasti: tkanivové inžinierstvo a regeneračnú (reparatívnu) medicínu podľa toho, kde dochádza k vytvoreniu daného konštruktu.

Tkanivové inžinierstvo (TI): V tomto prípade sa jedná o rekonštrukciu in vitro. Znamená to, že bunky kultivujeme na vhodnom materiáli (matrici) in vitro – teda v laboratóriu v presne definovaných podmienkach, a hotový konštrukt vložíme do organizmu.

V prípade produktov reparatívnej medicíny (RM) implantujeme biomateriál do organizmu a môžeme pridať bunky.

Regenerácia teda prebieha in vivo.

Oba spôsoby majú svoje výhody i nevýhody. U produktov tkanivového inžinierstva pripravujeme produkt v presne definovaných podmienkach, implantujeme v podstate hotový konštrukt. Nedokážeme ale vytvoriť tkanivo pod záťažou, ktorá je v organizme, a veľkou nevýhodou je aj absencia kompletného spektra potrebných rastových faktorov. Nie vždy dokážeme kultivovať alebo naprogramovať všetky typy buniek, ktoré sú pre funkčný konštrukt nevyhnutné.

Reparatívna medicína využíva reparáciu v organizme. Výhodou je inkorporácia buniek priamo v organizme a to pod vplyvom prítomných endogénnych regulátorov i faktorov záťaže. Veľmi často ale dochádza k degenerácii konštruktu.

Cieľom obidvoch disciplín je:

1. substitučná liečba – ide o náhradu celého orgánu,
2. histokonduktívna liečba – nahrádzame časť konštruktom ex vivo,
3. histoinduktívna liečba – uľahčuje hojenie. Pri tomto type liečby využívame i rastové faktory a produkty génovej terapie (napr. vektory).

Na to, aby sme vytvorili funkčný konštrukt, je potrebná vždy spolupráca viacerých odvetví: medicíny, biológie, biochémie, genetiky, technických vied, najmä vedy o materiáloch, informatiky atď.

Kombináciou najvhodnejšieho nosiča, najvhodnejšieho druhu buniek, a to za najvhodnejších podmienok by mal vzniknúť konštrukt, ktorý povedie k vytvoreniu želaného druhu tkaniva.

Koža je atraktívnym modelovým orgánom na testovanie nových konceptov v regeneratívnej medicíne a tkanivovom inžinierstve. Modely vytvorené metódami TI a RM predstavujú inovatívne postupy pri liečbe akútnych a chronických poškodení kože. Základné požiadavky na vlastnosti konštruktu podľa definície Mac Neila (1) sú:

• náhrada fyziologických funkcií kože,
• schopnosť rýchlo a spoľahlivo pokryť kožný defekt,
• jednoduchá aplikácia,
• redukcia bolesti,
• redukcia mikrobiologickej kontaminácie,
• schopnosť naštartovať regeneráciu rany bez toho, aby sa vyvinul zápalový proces alebo došlo k odvrhnutiu transplantátu,
• minimalizovať vytvorenie jaziev,
• pigmentácia by mala pripomínať normálnu pokožku,
• prijateľná cena.

Aké náhrady kože môže v súčasnosti moderná medicína poskytnúť?

Aký kožný kryt môžeme transplantovať pacientovi?

1. podľa trvania ich pôsobenia:
   
   • dočasné,
   • trvalé.
2. podľa anatomickej štruktúry:
   
   • epidermálne,
   • dermálne,
   • dermo-epidermálne.
3. podľa obsahu bunkových komponentov:
   
   • bunkové (celulárne),
   • nebunkové (acelulárne).
4. podľa typu použitých materiálov:
   
   • biologické,
   • syntetické (degradovateľné aj nedegradovateľné).

Jednotlivé kožné náhrady často spĺňajú kritériá viacerých kategórií súčasne (napr. syntetická náhrada môže obsahovať aj bunky a môže byť dočasná a dermo- epidermálna).

V tomto prehľade sme zvolili delenie kožných náhrad na náhrady bunkového typu, bunky a náhrady na báze biomateriálov.

TYPY KOŽNÝCH NÁHRAD

Kožné náhrady bunkového typu

Do tejto kategórie zahrňujeme xentransplantáty, autotransplantáty, alotransplantáty a amniové membrány. Sú to v súčasnosti najčastejšie používané náhrady v popáleninovej medicíne.

Xenotransplantáty

Sú to tkanivá iného, ako humánneho pôvodu. Ich použitie je známe už od roku 1500 pred Kristom. Koža za vodnej jašterice sa používala už v roku 1692, koža žaby sa používa v Brazílii (3) a dodnes sa používa v tradičnej medicíne (Vietnam). V USA bol prvým priekopníkom použitia zvieracích xenotransplantátov Sneve (4). Navrhoval použitie kože morčaťa, kurčiat a králikov. Bromberg v roku 1965 (5) navrhoval použitie kožných xenotransplantátov z prasiat a Switzer (6) zo psov.

Xenoštepy môžeme rozdeliť do dvoch kategórií: konkordantné, t.j. transplantácia medzi primátmi a človekom, a diskordantné – z iných zvierat na človeka (7, 8). Nie je zatiaľ možné úplne vylúčiť imunologickú reakciu u človeka, ktorému boli transplantované orgány xenogénneho pôvodu, ale veľký pokrok nastal vtedy, keď sa podarilo zvládnuť prvú hyperakútnu rejekciu (9).

Na rozdiel od transplantácií orgánov, xenotransplantácia buniek alebo prasačích Langerhansových ostrovčekov vyvoláva minimálnu, alebo žiadnu imunitnú odpoveď. Z rôznych dôvodov je pre potreby transplantácií pre človeka najvhodnejším zvieraťom prasa (10). Prasačie orgány sú podobnej veľkosti ako ľudské, prasatá sa reprodukujú rýchlo, nie je problém s krížením, môžu byť pomerne jednoducho geneticky manipulované a tak sa môže znížiť riziko rejekcie u človeka (transgénne prasiatka).

Porcínne xenotransplantáty sa s výhodou používajú na dočasné prekrývanie popálenín, ktoré nedosahujú plnú hrúbku kože ako biologický obväz, alebo u hlbokých popálenín na excidované plochy ako dočasná kožná náhrada.

Metodiku prípravy a použitia porcínnych xenotransplantátov rozpracovali na popáleninovom oddelní v Prahe (11, 12) a v podstate sa v tejto podobe používa v niektorých krajinách vrátane Slovenska dodnes (13).

Pripravujú sa v kožných bankách a uskladňujú sa v rôznych formách ako hlbokomrazené, lyofilizované, deepidermizované a pod. (14). Donedávna bolo možné používať xenotransplantáty aj v čerstvom stave (skladované na +4 ⁰C). V súčasnosti sa v EÚ čerstvé kožné xenotransplantáty nepoužívajú vzhľadom na sprísnené testy sterility podľa Európskej farmakopey. Vykonanie testov certifikovaným laboratóriom je stanovené na 14 dní a táto doba sa prekrýva s expiračnou dobou čerstvého xenotransplantátu. Test sterility je nevyhnutnou podmienkou pre aplikáciu.

V roku 1970 niekoľko skupín vedcov oznámilo, že dve línie prasačích obličkových buniek PK 15 a MPK môžu produkovať častice retrovírusu typu C (15, 16). V roku 1997 bolo zistené, že vírusové častice, ktoré produkovala línia buniek PK 15, môžu infikovať bunky širokého spektra – vrátane buniek ľudskej obličky 293 (17). Vírus bol nazvaný porcínny endogénny retrovírus PERV (18). Objavením PERVov sa rozvírila debata ohľadne rizika prenosu na človeka. Existuje riziko, že porcínne retrovírusy môžu infikovať pacienta počas transplantácie a môžu sa rozšíriť v populácii. Aj keď dodnes nie je známa miera tohto rizika, bol vypracovaný návrh na moratórium pre užívanie xenotransplantátov (19). Existuje niekoľko štúdií zameraných na dôkaz prítomnosti PERV u pacientov po transplantáci, ale doteraz nebol podaný žiadny relevantný dôkaz o infekcii PERV u transplantovaných pacientov (20–24). Výsledky štúdií sú povzbudzujúce, ale na definitívne potvrdenie bezpečnosti porcínych xenotransplantátov by boli potrebné ďalšie rozsiahlejšie štúdie, zamerané na čo najširší okruh transplantovaných tkanív a čo najväčší súbor pacientov.

Autotransplantáty

Od roku 1871, kedy Reverdin (25) popísal prvýkrát použitie autológnej kože na transplantáciu, ide o doposiaľ neprekonanú formu transplantátov pre pacienta. Jedine autotransplantácia dokáže zaistiť definitívnu náhradu stratenej kože. Najčastejšie používané sú dermoepidermálne transplantáty, ktoré predstavujú epidermu a časť dermy bez kožných adnex.

Nevýhodou je obmedzené množstvo transplantátov, najmä u pacientov s rozsiahlymi popáleninami.

Alotransplantáty

Ide o tkanivo prenesené medzi geneticky odlišnými jedincami toho istého druhu. Transplantácia medzi jednovaječnými dvojčatami sa označuje ako izotransplantácia a nepovažuje za alotransplantáciu, ale za druh autotransplantácie. Sú najčastejšie používaným a najhodnotnejším druhom dočasných kožných náhrad pri nedostatku vlastnej kože (26) a predstavujú štandard pri porovnávaní účinkov iných kožných náhrad (27). Najväčšou prednosťou alotransplantátov je, že poskytujú dočasnú bariéru proti prenikaniu mikroorganizmov, zabraňujú pokračujúcim stratám tekutín a bielkovín cez otvorenú ranu a chránia ranu pred vysychaním (28–31). Majú schopnosť stimulovať epitelizáciu z okrajov rany a zo zbytkov epidermálnych elementov pri neexcidovaných popáleninách II. stupňa (32–34). Prekrytie rany alotransplantátmi výrazne znižuje jej bolestivosť, znižuje energetické straty organizmu a pripravuje ranu na definitívne prekrytie (35).

Alotransplantáty majú aj svoje nevýhody. Ich najväčšou nevýhodou je antigenicita s pomerne krátkym prežívaním po transplantácii, možnosť prenosu infekčných ochorení (36) a nedostatok vhodných darcov. Alotransplantáty obvykle pripravujú tkanivové zariadenia.

Amniová membrána

Prvé klinické použitie sa datuje z roku 1910 a 1913 (37).

Amniová membrána (AM) sa s výhodou využíva ako biologický obväz a priaznivo ovplyvňuje hojenie rán. Medzi priaznivé účinky amnia zaraďujeme výraznú redukciu bolestivosti, mierne zníženie evaporačných strát cez ranu, stimuláciu procesu hojenia, stimuláciu angiogenézy a stimuláciu epitelizácie. Aj keď amnion nemá priame antibakterálne účinky, svojou adherenciou na povrch rany znižuje možnosti proliferácie mikroorganizmov v rane (38). Amniové membrány sa ako biologický kryt začali u nás používať v 50-tych rokoch (39–41) a v určitých indikáciách sa s výhodou používajú dodnes (42–45).

V súčasnosti sa amnion používa v širšej miere aj v oftalmológii, najmä pri poraneniach a defektoch rohovky (46, 47). Amniová membrána sa používa aj ako nosič na bunky – keratinocyty, limbálne kmeňové bunky a bunky mukozálneho epitélia. AM sa používa nielen ako podklad pre suspenziu vykultivovaných limbálnych buniek, ale bunky je možné kultivovať aj priamo na AM (48–50).

Amnion obsahuje rad rastových faktorov (bázický rastový faktor fibroblastov, angiogénny rastový faktor, rastový faktor hepatocytov a pod.) (51). Tieto jednak stimulujú proces hojenia, jednak ovplyvňujú vitalitu buniek a schopnosť ich proliferácie na amniovej membráne. V prípade limbálnych kmeňových buniek tieto rastové faktory podporujú rast limbálnych buniek, ale aj zamedzujú ich diferenciácii na rohovkové bunky (52). V súčasnosti sa amniová membrána považuje za sľubný zdroj kmeňových buniek mezenchymálneho typu (53).

Bunky

Izolované bunky

Z kožnej biopsie môžeme izolovať heterogénnu populáciu buniek, ktorá zahŕňa všetky bunky, ktoré sa v koži vyskytujú: keratinocyty, melanocyty, dermálne fibroblasty, Merklovej bunky, Langerhansove bunky. Suspenziu buniek získanú enzymatickou metódou môžeme aplikovať vo forme spreja (metóda firmy Recell- ReCell^® Spray-On Skin). Podobnou metódou je metóda Cell Spray austrálskej autorky F. Wood, kedy sa aplikujú semikonfluentné keratinocyty z kultivácie. Suspenziu buniek môžeme aplikovať aj na nosiči (amniová membrána, mastný tyl, alebo vo fibrínovom lepidle – Tissucol).

Výhody: Jedná sa o autológne bunky pacienta, ide o heterorogénnu populáciu, metóda je veľmi rýchla (príprava trvá zhruba 1 hodinu, a preto v rámci jednej operácie môžeme bunky aj odobrať, aj aplikovať). Ak použijeme subkonfluentnú kultúru na prípravu spreja príprava buniek trvá iba niekoľko dní.

Nevýhody: Obmedzená plocha aplikácie a nejde o náhradu plnej hrúbky kože (nenahrádzame aj štruktúrne zložky, ide iba o bunkové elementy).

Kultivované bunky

Čo v súčasnosti vieme a môžeme kultivovať?

Somatické bunky

Najčastejšie kultivovanými bunkami pre liečbu popálenín sú keratinocyty.

Môžeme kultivovať a aplikovať alogénne keratinocyty (obvykle sa kultivujú keratinocyty predkožky novorodenca, ale môžeme použiť aj keratinocyty dospelého darcu) za predpokladu, že dodržíme všetky zákonom stanovené podmienky, ako informovaný súhlas darcu a sérologické vyšetrenie.

Najčastejšie kultivovanými a používanými keratinocytmi sú autológne keratinocyty. Môžeme ich kultivovať dvomi základnými metódami: kultiváciou v bezsérovom médiu (54) a kultiváciou s použitím podporných (feedrových) myších 3T3 fibroblastov (metóda podľa Rheinwalda a Greena ) (55–57).

Nevýhodou kultivácie je dlhý čas kultivácie (od izolácie po vytvorenie dostatočného množstva plátov -sheets- keratinocytov obvykle uplynie 3–5 týždňov) a vysoká cena (cca 10 € za 1 cm²).

Je možné kultivovať aj xenogénne keratinocyty, ale v klinickej praxi sa nepoužívajú.

Okrem toho je možné kultivovať i iné druhy kožných buniek – melanocyty, dermálne fibroblasty (58). U alogénnych fibroblastov a keratinocytov bola pozorovaná rôzna imunitná odpoveď. Zatiaľ čo alogénne fibroblasty prežívajú v organizme viac ako dva mesiace bez príznakov imunitnej rejekcie (59), alogénne keratinocyty neprežívajú v rane viac ako niekoľko týždňov (60). Je to pravdepodovne spôsobené tým, že u oboch typov buniek je rôzna expresia ľudského leukocytárneho antigénu HLA (61). Z uvedených výsledkov vyplýva, že na prípravu trvalých náhrad akéhokoľvek typu by mali byť používané autológne bunky, pretože iba tie sú schopné trvalého prihojenia.

Kultiváciou keratinocytov a ostatných typov buniek sa zaoberajú špecializované tkanivové zariadenia vrátane Centrálnej tkanivovej banky v Bratislave. Na trhu je dostupný komerčný prípravok Epicel (Genzyme Biosurgery Cambridge, UK), ktorý obsahuje autológne keratinocyty.

Kmeňové bunky

Kmeňové bunky sú nediferencované bunky, schopné jednak diferenciácie na viacero typov buniek, jednak majú schopnosť obnovy seba samej (self-renewal). Termín kmeňová bunka zaviedol v roku 1909 ruský histológ Alexander Maximov (62). Existujú tri typy kmeňových buniek: embryonálne, fetálne (tieto dva typy označujeme ako prenatálne) a dospelé – postnatálne kmeňové bunky. Kmeňové bunky boli popísané aj u rastlín, tu sa nachádzajú v meristéme. Na rozdiel od živočíšnych buniek, kde sú totipotentné iba bunky zygoty a včasných štádií embryonálneho vývoja, u rastlín sa totipotencia zachováva po celý život rastliny (63).

Embryonálne kmeňové bunky: Kultiváciu týchto buniek legislatíva SR nedovoľuje.

Dospelé kmeňové bunky: V súčasnosti sa kultivujú niektoré typy dospelých kmeňových buniek:

• kmeňové bunky kože: Boli izolované jednak z interfolikulárneho epitélia a jednak z bulge region (miešok) vlasového folikulu. Tieto môžu regenerovať vlasový korienok, ale aj tukové žľazy a epidermu (64, 65). Exeprimentálne sa podarilo z kmeňových buniek vlasového folikulu myši diferencovať neuróny, keratinocyty, gliové bunky, melanocyty a bunky hladkého svalstva (66). To nasvedčuje, že ide o kmeňové bunky neuroektodermálneho a mezodermálneho pôvodu. Kmeňové bunky izolované z vlasového folikulu boli použité aj na tvorbu epiteliálnych sheetov (67). Hoci boli dosiahnuté pozitívne výsledky pri epitelizácii rany, nezaznamenali autori ani čiastočnú obnovu folikulov, ani potných žliaz (68).
• mezenchymálne kmeňové bunky (MSC): Pôvodným zdrojom MSC bola kostná dreň (69, 70, 71). Izolácia je jednoduchá, ale predstavuje traumatizáciu pacieta a výťažok je malý (0,001–0,1% z celkovej populácie jadrových buniek kostnej drene) (72). Z kostnej drene môžeme izolovať heterogénnu skupinu multipotentných progenitorových buniek schopných diferenciácie na mezodermálne, ektodermálne aj endodermálne bunky. Sú schopné opustiť kostnú dreň, cirkulovať v krvi a dostávať sa k poškodeným tkanivám. Pokusy s aplikáciou MSC dokázali, že výrazne uľahčujú hojenie kože, a to aj pri akútnych aj pri chronických poškodeniach. Badiavas ukázal, že aplikované MSC aplikované v spreji s fibrínom výrazne zvýšili hojenie kožných rán. Nevýhody izolácie MSC z kostnej drene: bolestivý odber a pomerne malé množstvo získaných MSC.
• kmeňové bunky z lipoaspirátu: Posledné objavy ukázali, že najlepším zdrojom ľudských mezenchymálnych buniek je podkožné tukové tkanivo (73). Enzymatickou izoláciou pomocou kolagenázy získame heterogénnu populáciu stromálnych a vaskulárnych buniek, vo frakcii stromálnych buniek bola identifikovaná populácia kmeňových buniek, ktoré majú podobné charakteristiky ako MSC (74). Majú stabilnú kinetiku proliferácie a môžu sa diferenciovať rôznymi smermi (osteogénny, chondrogénny, adipogénny, myogénny alebo neurogénny smer) (75).
  Samotný lipoaspirát je populáciou buniek rôzneho typu (endoteliálne bunky, fibroblasty, leukocyty, hematopoietické bunky), ale LSC sú schopné rásť na kultivačnej nádobe. Sú schopné urýchliť hojenie rany reepitelizáciou a angiogenézou.
  Výhody: Ľahká izolácia, veľké množstvo, môže sa aplikovať aj ako suspenzia a to v rámci jednej operácie.
• kmeňové bunky pupočníkovej krvi: Pupočníková krv obsahuje niekoľko typov kmeňových buniek, z ktorých niektoré pochádzajú ešte z obdobia embryonálneho vývoja a už nikdy sa počas života v krvi nevyskytujú. Najčastejšie sa z nich používajú krvotvorné kmeňové bunky. Okrem nich pupočníková krv obsahuje aj mezenchymálne kmeňové bunky a bunky veľmi podobné embryonálnym kmeňovým bunkám, ktoré sa vyznačujú pluripotenciou (76, 77). Hrajú úlohu pri liečbe leukémie, lymfómov, ochoreniach krvotvorby, imunity a metabolických ochoreniach. Sú schopné diferenciovať sa na rôzne typy buniek (použitie pri regenerácii srdcového svalu, ciev, pečene a testujú sa pri liečbe detského diabetu (78). Nevýhodou je ich pomerne malé množstvo, dajú sa však kultivovať (79).

Reprogramované somatické bunky

Ide o somatické bunky (dermálne fibroblasty), ktoré boli transfekované pomocou vírusového vektora, a tým nadobudli charakter pluripotentných kmeňových buniek. Zatiaľ otázne najmä z hľadiska možnosti navodenia tumorigenicity. Kinarm Ko et al. (80) zistili, že u buniek, získaných zo semeníkov dospelých myší dochádza za určitých podmienok kultivácie k spontánnemu reprogramovaniu buniek na kmeňové pluripotentné bunky, a to bez transfekcie. To isté sa podarilo i s bunkami semeníka človeka (81). Ďalším smerom je štúdium regenerácie u axolotla. Vedci zistili, že v embryonálnom štádiu sa na tvorbu svalového tkaniva používajú gény, ktoré sa v neskoršom vývojovom štádiu vypnú. Na regeneráciu v dospelosti je používaná iná skupina génov. U axolotla tieto gény pracujú po celý život. Porozumenie systému regenerácie tkaniva by možno v budúcnosti umožnilo regenerovať poškodené tkanivá z „vlastných“ zdrojov (82).

NÁHRADY NA BÁZE BIOMATERIÁLOV

Trojrozmerné náhrady na báze biomateriálov musia umožňovať infiltráciu buniek – či už priamo v organizme, alebo v laboratórnych podmienkach (polypeptidy, hyaluronany, glykozaminoglykány, fibronektín, kolagén, chitosan, algináty). Nakoľko tieto látky sa prirodzene vyskytujú v koži, majú malú toxicitu a mininálnu imunitnú odpoveď. Ich problémom je však xenogénny pôvod a s ním spojené riziko prenosu patogénov.

V súčasnosti je dostupných na trhu viac ako 20 produktov, mnohé z nich sú klinicky odskúšané a zároveň vzniká veľa nových experimentálnych modelov. Niektoré z produktov neobsahujú živé bunky, ale majú rôznu schopnosť vyvolať regeneráciu tkaniva, iné živé bunky obsahujú. Tieto bývajú označované ako produkty bunkovej terapie alebo TI konštrukty.

Biomateriály

Základom pre prípravu náhrad sú biomateriály. Všeky biomateriály sa vyberajú tak, aby bola rovnováha medzi mechanickými vlastnosťami nahradzovaných tkanív a medzi účinkami materiálu na tkanivá. Vyžaduje sa od nich celý rad vlastností: biologická aktivita, mechanická pevnosť, chemická stálosť, nesmú byť toxické pre organizmus a nesmú vyvolať zápalový proces. V prípade kožných defektov biomateriály slúžia ako dočasné obväzy, ako stimulátory bunkovej proliferácie, ako permanentná náhrada kože. Musia byť pripravené tak, aby umožnili osídlenie bunkami, a to jedným, alebo viacerými druhmi buniek (nesmú byť pre bunky toxické a musia mať povrch, ktorý umožňuje bunkám prichytiť a množiť sa) (83–85).

Môžu byť prírodné alebo syntetické.

Prírodné: polypeptidy, hydroxyapatity, hyaluronan, glykozaminoglykány, fibronektín, kolagén, chitosan, algináty, acelulárne dermy (porcínne: Permacol, Xederma, OASIS pripravená z prasačieho jejuna, alebo alogénne: ALLODERM).

Syntetické: Sú buď degradabilné (polyglykolidy, polyactidy, polytetrafluoroetylén, polykaprolaktón, polyetyléntereftalát), alebo negradabilné. (polyuretán). Sú buď bez bunkových elementov, alebo osídlené bunkami a podľa množstva vrstiev rozlišujeme monolaminárne, alebo bilaminárne systémy.

Jednomembránové systémy

Zaraďujeme sem syntetické filmy, peny, hydrogély a spreje a syntetické polyméry.

Prvý sprej bol vyvinutý už v roku 1954 v USA. Syntetický kryt na báze polyuretánu bol vyvinutý v Českej republike (Synkryt, Rico Veverská Bitýška) (86). V súčasnosti sú dostupné komerčné tenké membrány ako napríklad Op-Site spray (etoxyetylmetakrylát a metoxyetylmetakrylátový kopolymér), Op-Site film (polyuretán so samolepiacou vrstvou), Tegaderm (3M) tvorený jednou vrstvou syntetického polyméru, Opraflex (Lohmann) a pod. na báze polyuretánu s akrylamidom.

Z materiálov na báze hydrogélov možno spomenúť hydrogély objavené akademikom Wichterlem v roku 1960, ktorých základ tvoria presieťované polyglykolmetakryláty schopné na seba viazať značné množstvá vody. Na trhu u nás sú dostupné poľské výrobky Aqua-Gel a Skingel. Medzi jednomembránové systémy zaraďujeme aj Suprathel a Matriderm.

Matriderm obsahuje hovädzí kolagén typov I, II a V s pridaním hovädzieho hydrolyzátu elastínu. Po 2 týždňoch matrica degraduje a je nahradená vlastným kolagénom príjemcu. Je určený na excidované popáleniny plnej aj čiastočnej hrúbky kože.

Suprathel DL obsahuje laktridetrimetylénkarbonát, trimetylénkarbonát a etakaprolaktón. Je určený na popáleniny 2. stupňa a odberové miesta (87).

Dvojmembránové systémy

Integra je najstaršou biosyntetickou náhradou kože. Prvými, ktorým sa podarilo vytvoriť túto skutočnú funkčne zdatnú náhradu kože, boli Yannas a Burke v roku 1980 (88–90). Integra je tvorená matricou z troch vrstviev bovínneho kolagénu I s pridaním 10–15 % chondroitín 6 sulfátu izolovaného zo žraločej chrupavky a vonkajšej silikónovej membrány. Veľkosť pórov a ostatné vlastnosti tejto matrice boli navrhované tak, aby umožňovali vrastanie kapilár a novotvorbu väziva. Aplikácia vyžaduje odstránenie silikónovej vrstvy a prekrytie rany autograftom. Indikuje sa pri popáleninách rozsahu pĺnej hrúbky kože.

Dvojmembránové syntetické náhrady epidermy majú vonkajšiu silikónovú membránu a nylonovú sieťku (Biobrane). Obe vrstvy u Biobrane obsahujú porcínny kolagén typu I, ktorý tvorí 3D štruktúru. Táto trojrozmerná štruktúra umožňuje rýchle priľnutie na povrch rany a aktivuje proces hojenia. Biobrane je určená pre popáleniny druhého stupňa a veľké defekty.

V Československu sa problematike syntetických bilaminárnych náhrad venovali vo Výskumnom ústave textilnom vo Veverskej Bitýške (91), kde bola vyvinutá bilaminárna syntetická náhrada s názvom Skintex. Dermálna časť bola tvorená netkanou polyesterovou textíliou, ku ktorej bola fixovaná polopriepustná perforovaná membrána z polyetylénu. Jej konštrukcia a vlastnosti ju však priraďovali skôr ku kožným krytom, aj keď mala dvojvrstvovú štruktúru. V klinickej praxi nenašla väčšie rozšírenie.

Kombinované náhrady s bunkami

Epidermálne ekvivalenty

Pozostávajú z kultivovaných buniek kombinovaných s biokompatibilným nosičom (bovínny kolagén, kyselina hyalurónová, acelulárny ľudský materiál, nylón alebo polyglaktínová sieť).

Epicell je prvým komerčne pripraveným epidermálnym ekvivalentom. Ide o autológne keratinocyty kultivované s pomocnými bunkami 3T3 aplikované na mastnom tyle. Používa sa v Európe aj USA, a to na liečbu popálenín plnej aj čiastočnej hrúbky a na ulcusy (92). Podobným prípravkom je EPIBASE (Laboratoires Genevrier, France), kde sa tiež sa jedná o kultivované autológne keratinocyty.

Laserskin (Vivoderm) tvoria subkonfluentné keratinocyty na matrixe obsahujúcom kyselinu hyalurónovú, perforovanú laserom. Použitie je rovnaké ako v prípade Epicellu (93).

BioSeed tvoria autológne bunky ústnej sliznice (oral mucosa) – keratinocyty – na fibrínovej matrici, určené na liečbu popálenín čiastočnej hrúbky a ulkusy (vredy). Fibrín fixuje keratinocyty a uľahčuje ich prienik na ranu a rast (94, 95).

Myskin pozostáva zo subkonfluentných autológnych keratinocytov na silikónovej membráne, použitie je podobné ako u BioSeed.

Cryoskin obsahuje hlbokomrazené konfluentné alogénne keratinocyty na gél-like povrchu.

Dermálne ekvivalenty

Dermagraft – kultúra alogénnych dermálnych fibroblastov novorodenca na biodegradovateľnej matrici z kyseliny polyglykolovej v zmrazenom stave. Ide o jeden z najúspešnejších produktov. Produkuje rastové faktory a urýchľuje angiogenézu, a reepitelizáciu a to aj po rozmrazení (96). Používa sa pri liečení nerozsiahlych defektov (napr. diabetická noha), ale nie je vhodný na liečbu rozsiahlych popálenín.

Hyalograft 3D – autológne fibroblasty na matrici z esterifikovanej kyseliny hyalurónovej.

PolyActive – tento bilaminárny produkt obsahuje autológne kultivované keratinocyty a fibroblasty nasadené na poréznej matrici pozostávajúcej z mäkkej zložky (tereftalátu oxidu polyetylénu) a tvrdej zložky – polybutylén tereftalátu, ktorý bráni kontrakcii polyméru (97, 98). Je určený primárne pre rekonštrukciu kostí, u popálenín nie je jeho použitie vhodné. Jeho výhodou je autológny pôvod buniek, toto však zvyšuje cenu produktu. Ide o dermálny nebiodegradovateľný produkt.

Dermo-epidermálne ekvivalenty

Apligraf – je alogénny produkt. Obsahuje alogénne neonatálne fibroblasty, ktoré rastú na matrici z bovínneho kolagénu I a sú kombinované s alogénnymi keratinocytmi. Keratinocyty tvoria vrchnú vrstvu konštruktu. Svojou štruktúrou Apligraf najlepšie napodobňuje štruktúru kože. Aj keď produkt nespôsobuje imunitnú reakciu, predsa bunky, ktoré sú alogénneho pôvodu, nedokážu prežívať viac ako dva mesiace (99, 100). Materiál je určený predovšetkým pre liečbu vredov predkolenia. Existujú práce popisujúce použitie Apligrafu pri popáleninách (101, 102), avšak Apligraf nemôže byť používaný ako definitívny kryt pri popáleninách plnej hrúbky kože. K negatívnym vlastnostiam produktu patrí aj vysoká cena (28 £ za cm²), krátka životnosť a alogénny pôvod buniek. Preto Apligraf nenašiel široké uplatnenie v popáleninovej praxi.

OrCell – táto náhrada obsahuje ako dermálny komponent alogénne fibroblasty získané z predkožky novorodenca. Fibroblasty sú nasadené na matrici z bovínneho kolagénu I. Kolagén je potiahnutý neporóznym kolagénovým gélom a na jeho povrchu ako epidermálny komponent sú nasadené alogénne keratinocyty toho istého pôvodu ako fibroblasty. Používa sa na krytie odberových miest, liečbu vredov predkolenia a najmä pri terapii Epidermolysis bullosa. Konštrukt produkuje spektrum cytokínov a rastových faktorov, ktoré urýchľujú migráciu buniek a hojenie (103). Vzhľadom na to, že obsahuje alogénne bunky, býva resorbovaný v priebehu 7–14 dní.

PermaDerm – ide o autológnu dermo-epidermálnu náhradu. Na matricu z bovínneho kolagénu typu I sú nasadené dermálne fibroblasty a na epidermálne strane konštruktu kultivované keratinocyty. Začal sa predávať v roku 2007, doteraz nie je dostatočný súbor údajov o jeho použití a účinkoch. Používa sa podobne, ako OrCell (104).

VÝHODY A NEVÝHODY BIOMATERIÁLOV

Prečo je vytvorenie a používanie náhrad ešte nevyriešený problém?

Keď sa pred 30 rokmi začalo s vývojom kožných náhrad, predpokladalo sa, že čoskoro bude k dispozícii dokonalá kožná náhrada. Toto očakávanie sa ukázalo ako nereálne. Aj keď súčasné produkty vykazujú vysoký stupeň komplexicity, sú osídlené autológnymi bunkami a spĺňajú podmienky bezpečnosti (GMP produkty), ani jeden produkt nezaznamenal masívne všeobecné používanie. Žiadna náhrada nebola doteraz schopná nahradiť plnohodnotne kožu celej hrúbky.

Doteraz platí, že v súčasnosti je najlepšou náhradou autológny kožný štep.

Ďalšími dôvodmi pre obmedzené použitie jestvujúcich náhrad sú:

• vysoká cena (to znižuje šance zdravotných poisťovní tento produkt preplatiť),
• neúmerne dlhá cesta od vytvorenia náhrady cez predklinické a klinické skúšanie, schvaľovacie procesy až k pacientovi,
• živočíšny pôvod niektorých produktov alebo ich komponentov (najmä v súvislosti s možným prenosom patogénov),
• možná alergická reakcia na xenogénne komponenty (Integra),
• malé prihojovanie autológnych štepov,
• problémom je aj cievne zásobovanie konštruktu.

Všetky doteraz známe konštrukty sú len membrány s bunkami, ani jeden model nemá všetky vrstvy kože. Neobsahuje kompletné spektrum buniek a rastových faktorov, kožné adnexy ako napr. vlasové folikuly a neobsahuje ani cievy. Ani jeden konštrukt nie je zatiaľ schopný vytvoriť funkčný model ani po aplikácii do organizmu.

Na druhej strane, ak by bola k dispozícii náhrada s autológnymi bunkami, ktorá by mala dostatočný rozmer, odpovedajúcu farbu (melanocyty) a štruktúru (zásobovanie cievami), znamenalo by to zjednodušenie a zefektívnenie liečby. Nezanedbateľným benefitom by bol aj lepší kozmetický efekt pre pacienta.

Vedci sa neustále snažia o vytvorenie takéhoto plne funkčného konštruktu.

V poslednom období výskum v oblasti tkanivového inžinierstva kože pokročil. Objavenie kmeňových buniek, najmä kmeňové bunky lipoaspirátu a kmeňové bunky vlasových folikulov snáď umožní vytvoriť rôznorodú populáciu buniek, potrebných na regeneráciu. Veľký pokrok znamenalo aj skúmanie rastových faktorov, najmä tzv. „inštruktívnych“ faktorov. Tieto regulujú migráciu buniek, profileráciu, diferenciáciu buniek a ich rozmiestnenie (fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor, insulin-like growth factor, platellet-derived growth factor) (105, 106).

Najnovšie výsledky ukazujú, že pri použití ľudských kožných endoteliálnych buniek, ktoré boli aplikované do fibrínového alebo kolagénového gélu, vznikli 3D kapiláry so skutočným lumenom. To dáva nádej aj na vyriešenie problému cievneho zásobovania konštruktu (107, 108).

Okrem využitia všetkých typov náhrad v plastickej chirurgii a chirurgii popálenín sa kožné náhrady využívajú aj na iné účely. Slúžia ako model na štúdium štruktúry kože, patológie a biológie kože ako aj skúmanie rastových faktorov. Veľkou oblasťou ich využitia je použitie kožných náhrad ako modelov pri štúdiu prieniku rôznych typov látok kožou (testovanie kozmetických výrobkov, prieniky potravinárskych farbív a pod.). V tejto oblasti nahrádzajú pokusy na zvieratách.

PRODUKTY CENTRÁLNEJ TKANIVOVEJ BANKY BRATISLAVA

V CTB Bratislava sa už 25 rokov venujeme produkcii rôznych druhov kožných náhrad bunkového typu. Pripravujeme hlboko mrazené kožné xenotrasplantáty, kožné alotransplantáty ako aj amniové membrány.

V oblasti kultivácie buniek máme viac ako 15 ročnú skúsenosť s kultiváciou keratinocytov, jednak autológnych, ako aj alogénnych odberových plôch.

Začali sme aj s prípravou suspenzie buniek na amniovej membráne, ako aj vo fibrínovom lepidle Tissucol.

Vypracovali sme štandardný pracovný postup pre kultiváciu limbálnych kmeňových buniek a buniek mukozálneho epitélia nasadených na amniovej mebráne pre použitie v oftalmológii. Okrem toho, že aplikácia buniek na amniovej membráne pacientom je pomerne jednoduchá, je táto metóda aj efektívna.

V roku 2010 sme začali s prípravou kmeňových buniek z lipoaspirátu. Jedná sa o veľmi jednoduchú a rýchlu metódu, ktorá možno v budúcnosti umožní aplikovať tieto kmeňové bunky pacientovi, a to aj v rámci jednej operácie.

Máme vypracované štandardné pracovné postupy pre kultiváciu osteoblastov a chondrocytov.

V súčasnosti riešime aj grantovú úlohu „Príprava trojrozmernej náhrady kože“. Na báze matrice Colladerm-H sa pokúšame o vytvorenie konštruktu, kde na dermálneu stranu nasadzujeme dermálne fibroblasty a epidermálnu stranu budú tvoriť autológne keratinocyty.

ZÁVER

Kožné náhrady majú veľmi dôležitú úlohu pri liečbe popálenín a hlbokých rán rôzneho pôvodu. Ich liečba je proces ktorý pozostáva z viacerých krokov a vyžaduje spoluprácu viacerých bunkových typov. Práve pre takúto komplexnosť je veľmi nepravdepodobné, že nahradenie iba jednej súčasti kože, alebo použitie iba jedného typu buniek povedie k vytvoreniu úplnej náhrady strateného tkaniva. Budúci výskum sa preto musí zamerať aj na identifikáciu faktorov a požiadaviek, ktoré by viedli k vytvoreniu celej komplexnej štruktúry, vrátane ciev a nervovej siete. Veľkou nádejou v tomto smere sú kmeňové bunky s ich schopnosťou diferenciácie na rôzne typy buniek. Komplexná štruktúra, ktorá bude plnohodnotnou náhradou kože, musí disponovať aj kapilárami, potnými žľazami, vlasovými folikulmi a nervovými dráhami. Vzhľadom na toto budúcnosťou rekonštrukčnej medicíny i tkanivového inžinierstva je vytvorenie konštruktu, ktorý bude morfologicky i funkčne ekvivalentom ľudskej kože. Pokroky, ktoré na tomto poli boli dosiahnuté, nám dovoľujú dúfať, že plne funkčnú náhradu kože budú vedci schopní vytvoriť.

Skratky

• AM – amniová membrána 
• TI – tkanivové inžinierstvo

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

Mgr. Jana Dragúňová, CSc.

Klinika popálenín a rekonštrukčnej chirurgie LF UK

Ružinovská 6, 826 06 Bratislava,

Slovenská republika

e-mail: dragunova@ru.unb.sk