Průběh cytokinové odezvy u zvířecího modelu nitrobřišní sepse modifikované imunosupresí

Souhrn

Cíl studie:
Diagnostika sepse u imunokompromitovaných pacientů je obtížná pro jejich modifikovanou reakci na infekci. Cílem experimentu bylo porovnání časné klinické a laboratorní odpovědi na sepsi mezi experimentální skupinou septických miniprasat s imunosupresí a bez ní.

Typ studie:
Experimentální, srovnávací.

Materiál a metoda:
Experiment byl prováděn na miniprasatech. Sepse byla vyvolána užitím modelu cekální ligace a punkce (CLP). Miniprasata se shodnými vstupními parametry byla randomizována do 3 skupin, skupiny sepse (n = 10), skupiny imunosuprese (n = 11) s podáváním trojkombinace imunosupresivních léků (cyklosporin, metylprednisolon, mykofenolát mofetil) před operací a kontrolní skupiny (n = 6). Po celou dobu experimentu byly v tříhodinových intervalech monitorovány plazmatické hladiny vybraných cytokinů.

Výsledky:
U všech CLP zvířat došlo k rozvoji septického šoku s teplotou a hemodynamickou odezvou. Kinetika plazmatických koncentrací TNFα, IL-1β,interferonu-γ a CRP byla podobná ve skupině zvířat se sepsí i s imunosupresí. U imunosuprimovaných zvířat byly hodnoty IL-4 signifikantně nižší po celou dobu sledování, naopak u stejné skupiny byly hodnoty IL-8 zvýšené. Deset hodin po operaci byly hodnoty IL-6 významně vyšší ve skupině se sepsí než ve skupině s imunosupresí. Byl nalezen signifikantně vyšší vzestup hladin IL-10 v 19., 22., a 25. hodině po operaci ve skupině imunosuprimovaných zvířat ve srovnání se skupinou bez imunosuprese.

Závěr:
V našem experimentu jsme zjistili signifikantní rozdíly v cytokinové odpovědi na experimentálně navozenou sepsi mezi skupinami imunokompetentních a imunosuprimovaných zvířat.

Klíčová slova:
sepse – imunosuprese – cytokin – cekální ligace a punkce – miniprase

Úvod

Navzdory významným pokrokům v diagnostice, prevenci a terapii infekce zůstává sepse hlavní příčinou morbidity a mortality imunokompromitovaných pacientů [1]. Sepse u imunosuprimovaných však přes svoji závažnost zůstává dosud málo prostudovanou problematikou. Klinický obraz sepse je u těchto pacientů velmi proměnlivý, nemusí odpovídat závažnosti stavu, často se jedná o příznaky nespecifické, nedochází k typické manifestaci systémové zánětlivé reakce jako u imunokompetentních jedinců [2]. Stejně jako v jiných populacích pacientů je i u imunokompromitovaných rozhodující pro přežití včasná diagnostika sepse a včasné zahájení odpovídající terapie [3]. O rozdílu dynamiky markerů sepse mezi imunosuprimovanými a neimunosuprimovanými je známo jen málo. Jsou dostupné výsledky studií na malých zvířatech (myši), které určité rozdíly popisují, nicméně bez souvislosti s klinikou a aplikovatelností na člověka [4, 5].

Ke studiu mechanismů sepse byly vyvinuty různé zvířecí modely, z nichž nejčastěji používaným je model cekální ligace a punkce (CLP) u hlodavců [6]. V tomto modelu je zdrojem sepse polymikrobiální infekční fokus v dutině břišní s následnou bakteriální translokací do krevního kompartmentu, vyvolávající systémovou zánětlivou odpověď.

Cílem experimentu bylo porovnání klinických, laboratorních parametrů mezi skupinou miniprasat se sepsí a zvířat se sepsí a imunosupresí.

Studie byla povolena Komisí na ochranu zvířat proti týrání v IKEM. Experimenty byly prováděny na akreditovaném pracovišti experimentální medicíny IKEM v souladu s platnými evropskými předpisy a předpisy České republiky ohledně chovu a využití pokusných zvířat.

Metody

V experimentu bylo užito celkem 30 dospělých miniprasat o průměrné hmotnosti 37,6 kg (medián 36 kg). Zvířata byla rozdělena do 3 skupin. Ve skupině sepse (n = 10) byla vyvolána sepse užitím modifikovaného modelu CLP. Ve skupině imunosuprese (n = 11) byla vyvolána sepse stejným způsobem. Po dobu 5 dnů před operací byl zvířatům skupiny imunosuprese podáván cyklosporin (Sandimun Neoral, Novartis) 10 mg/kg ve 2 denních dávkách, metylprednisolon (Prednison, Zentiva) 20 mg v jedné denní dávce, mykofenolát mofetil (CellCept, Roche Pharma) 2 gramy ve 2 denních dávkách. V den operace byla provedena kontrola hladiny cyklosporinu. U kontrolní skupiny (n = 6) nebyla sepse vyvolána. U třech prasat byla na počátku pokusu zjištěna již probíhající infekce, a zvířata byla proto z experimentu vyřazena.

Po premedikaci a kanylaci ušní žíly byla zvířata uvedena do celkové anestezie s endotracheální intubací. Následně byla zvířata napojena na ventilátor, řízeně ventilována směsí kyslíku a vzduchu (FiO₂ 0,4, PEEP 5 cm H₂0, dechový objem 10 ml/kg). Dechová frekvence byla nastavena tak, aby se cílové arteriální pCO₂ pohybovalo v rozmezí 4,0–5,0 kPa. Byl zaveden arteriální, centrální žilní a plicnicový katétr k měření hemodynamických parametrů.

V celkové anestezii byla chirurgicky indukována sterkorální peritonitida provedením CLP. Byla provedena střední laparotomie, podvaz céka v jedné čtvrtině délky (5 cm od Bauhinské chlopně). Cévní zásobení bylo přerušeno v rozsahu podvazu céka. Před podvazem céka do něj byl vmasírován střevní obsah z colon ascendens. Na antimezenteriální straně byla provedena perforace céka troakarem. Dutina břišní byla kontaminována střevním obsahem. Byla zavedena gastrostomie a cystostomie. U kontrolní skupiny byla provedena pouze laparotomie, gastrostomie a cystostomie. Po uzavření laparotomie byla všechna zvířata dále řízeně ventilována a analgosedována až do ukončení experimentu (24 hodin po ukončení operace). Byla podávána udržovací infuze balancovaného krystaloidního roztoku 10 ml/kg/hod a bolusy 6% hydroxyetylškrobu 130 kD/0,4. V případě poklesu MAP pod 65 mm Hg nereagujícího na volumoterapii, byl k udržení perfuzního tlaku podáván noradrenalin v kontinuální infuzi. Prostřednictvím katétru v plicní tepně byla u zvířat monitorována teplota jádra, cílem bylo udržet teplotu 37–39 °C pomocí fyzikálních metod (chlazení, ohřívání). Experiment byl u skupiny zvířat se sepsí a skupiny s imunosupresí ukončen po nástupu známek septického šoku, u kontrolní skupiny po 24 hodinách po operaci. Zvířata byla poté utracena podáním bolusu anestetik.

Monitorován byl elektrokardiogram, střední arteriální tlak (MAP), centrální žilní tlak (CVP), tělesná teplota. Tlak v zaklínění (PCWP) a srdeční výdej (CO) byly zaznamenávány v tříhodinových intervalech. Byl počítán srdeční index (CI) a indexovaná systémová vaskulární rezistence (SVRI).

Po úvodu do anestezie (čas T0), po 1 hodině po operaci (čas T1) a dále po 3 hodinách (T2, T3, T4, T5, T6, T7, T8, T9) byly odebírány vzorky arteriální krve k analýze plazmatické koncentrace cytokinů (enzyme immunoassay): interleukin-1β a interleukin-6 (IL-1β, IL-6; DuoSets, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), interleukin-4, interleukin-8, interleukin-10, interferon-γ, tumor necrosis factor-α (IL-4, IL-8, IL-10, IFN-γ, TNF-α – CytoSets, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Ve stejných intervalech byl vyšetřován C-reaktivní protein (CRP; TA 901 (Tridelta Development Ltd.) porcine C – reactive protein assay). Sledovány byly i sérové koncentrace laktátu a počet leukocytů v krvi.

Na konci experimentu byly odebrány vzorky krve za účelem mikrobiologického vyšetření.

Byly vypočteny základní statistické charakteristiky (průměr, medián, směrodatná odchylka) a udány minimální a maximální hodnoty. Ke srovnání skupin byl užit Mannův-Whitneyův test, Kruskalův-Wallisův test. Jako statisticky signifikantní byla určena hodnota p < 0,05.

Výsledky

Mezi 3 skupinami zvířat (skupina sepse, skupina imunosuprese, kontrolní skupina) nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly ve vstupních klinických a laboratorních parametrech. Předoperační hladina cyklosporinu u všech zvířat s imunosupresí přesahovala 200 ng/ml.

Zvířata kontrolní skupiny byla po celou dobu sledování stabilní, nebyla zaznamenána zvýšená teplota, laboratorní parametry se v průběhu experimentu neměnily. U zvířat kontrolní skupiny byla zaznamenána významně nižší spotřeba tekutin než u miniprasat s CLP, žádné zvíře v kontrolní skupině nevyžadovalo k udržení perfuzního tlaku podání noradrenalinu.

U všech zvířat s CLP (skupina sepse, skupina imunosuprese) došlo oproti kontrolní skupině v průměru do 24 hodin (15–36 hodin) k rozvoji septického šoku s febrilní reakcí, tachykardií a hypotenzí, pro udržení MAP v hodnotách nad 65 mm Hg bylo nutno podávat noradrenalin v kontinuální infuzi. Na začátku pokusu byla normotermie ve všech skupinách zvířat. Během experimentu teplota stoupla přes fyzikální chlazení ve skupině sepse na 40,8 ± 0,96, ve skupině imunosuprese na 41,73 ± 0,81 °C, rozdíl mezi skupinami nebyl významný (p = 0,09). Nebyly zaznamenány statisticky významné rozdíly v hemodynamické odpovědi na sepsi mezi skupinou zvířat se sepsí a skupinou s imunosupresí. Průměrná tepová frekvence stoupla z počátečních 70 ± 11,5/min ve skupině sepse a 61 ± 8,3/min ve skupině imunosuprese (p = 0,06) na 143 ± 38/min u septických a na 153 ± 25/min imunosuprimovaných (p = 0,54). Počáteční hodnoty CI a SVRI se mezi skupinou se sepsí (CI: 3,8 ± 1,51 l/min/m², SVRI: 1887 ± 772 dyne . s.cm⁵ . m^-2) a skupinou s imunosupresí (CI: 3,0 ± 0,86 l/min/m², SVRI: 2114 ± 754 dyne.s.cm⁵/m²) nelišily (CI: p = 0,07, SVRI: p = 0,53). Průměrné CI a SVRI byly na konci experimentu u skupiny se sepsí (CI: 3,7 ± 1,55 l/min/m², SVRI: 1737 ± 836 dyn . s.cm⁵ . m^-2) a u skupiny s imunosupresí (CI: 3,89 ± 1,04 l/min/m², SVRI: 1354 ± 482 dyn.s.cm⁵ . m^-2) rovněž podobné (CI: p = 0,56, SVRI: p = 0,23). Spotřeba koloidních roztoků v průběhu experimentu byla u obou skupin s CLP podobná. Ve skupině s imunosupresí byl noradrenalin nasazován v průměru později než u skupiny bez imunosuprese, rozdíl však nedosahoval statistické významnosti. Mezi skupinou se sepsí a skupinou s imunosupresí nebyl zaznamenán statisticky významný rozdíl v průměrné dávce noradrenalinu.

Nelišily se ani hodnoty laktátu v arteriální krvi mezi skupinami na začátku (sepse: 3,6 mmol/l, imunosuprese: 3,1 mmol/l, p = 0,44), ani na konci experimentu (sepse: 2,0 mmol/l, imunosuprese 2,0 mmol/l, p = 0,49). Nebyl prokázán významný rozdíl v počtu leukocytů mezi skupinou se sepsí a skupinou s imunosupresí na začátku (sepse: 8,4 ± 5,1 x 10⁹/l, imunosuprese: 10,3 ± 4,7 x10⁹/l) ani na konci experimentu (sepse: 3,5 ± 3,2 x10⁹/l, imunosuprese: 4,2 ± 3,1 x10⁹/l, p = 0,70).

V případě IL-4 byla nalezena nižší koncentrace plazmatických hladin ve skupině imunosuprimovaných než u septických zvířat i kontrolní skupiny během celé doby trvání experimentu. Tento rozdíl dosahuje statistické významnosti. Naopak u IL-8 byla koncentrace plazmatických hladin u imunosuprimovaných zvířat trvale vyšší než u septických. Rozdíl je statisticky významný. Rozdíl mezi skupinou sepse a skupinou imunosuprese v hodnotách sledovaných cytokinů nedosahoval kromě IL-6 a IL-10 v jednotlivých časech statistické významnosti. Byl nalezen statisticky významný rozdíl v hodnotách IL-6 v časech T0–T4 (10 hodin od operace), k elevaci IL-6 došlo ve skupině s imunosupresí se zpožděním oproti skupině se sepsí. Opožděná elevace IL-6 neměla statisticky významnou souvislost s pozdější dobou nasazení noradrenalinu u imunosuprimovaných zvířat. Koncentrace IL-10 byla v pozdějším odstupu od operace (T7–T9, tedy 19–25 hod) signifikantně zvýšena ve skupině imunosuprimovaných oproti skupině se sepsí. U některých ze sledovaných cytokinů (IL-1β, IFN-γ, TNFα) nebyly nalezeny statisticky významné rozdíly mezi kontrolní skupinou a zvířaty s CLP. V časech T0–T2 byla zaznamenána signifikantně vyšší koncentrace CRP v kontrolní skupině. Výsledky jsou pro přehlednost zobrazeny v grafech (obr. 1).

V hemokulturách septických zvířat byla nalezena směs střevních bakterií (Escherichia coli, Enterococcus species, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Burgholderia cepacia, Acinetobacter species, Enterobacter cloacae, stafylokoky).

Diskuse

Sepse v humánní medicíně je stále velkým problémem s nedostatečně objasněnou patofyziologií. Ve zvířecích studiích je sepse vzhledem k povaze infekčního agens a chybějících komorbidit více homogenní a snáze kontrolovatelná [7]. Náš experiment byl prováděn na dospělých miniprasatech. Prasečí model je pro zkoumání lidské sepse výhodnější v porovnání s hlodavčím modelem díky relativně bližšímu fyziologickému vztahu mezi člověkem a prasetem [8]. Pro účely výzkumu imunopatologických alterací při sepsi u imunosuprimovaných pacientů jsme zvolili letální model peritonitidy (CLP) na prasatech jako model, který se ohledně etiologie nejvíce blíží reálné náhlé příhodě břišní. Vzhledem k tomu, že je cékum endogenním zdrojem bakteriální kontaminace, vede jeho perforace k bakteriální peritonitidě s translokací smíšených enterických bakterií do krevního oddílu. Bakteriémie při nástupu sepse spouští aktivaci systémové zánětlivé odpovědi, následně dochází k rozvoji septického šoku, orgánové dysfunkce a smrti. Při použití CLP modelu vykazovala všechna zvířata v experimentu typické příznaky septického šoku u všech byla zjištěna rozvinutá peritonitida [9]. Mikrobiologické nálezy v hemokulturách septických zvířat potvrdily polymikrobní příčinu sepse.

U lidí jsou sepse i septický šok spojeny s hemodynamickými změnami, které vyžadují tekutinovou terapii [10]. Toto bylo patrné i u septických miniprasat. Nalezené hemodynamické změny odpovídají i dříve publikované studii srovnávající hemodynamiku u septických krys [11]. Střední arteriální tlak byl u septických zvířat během experimentu udržován v hodnotách nad 65 mm Hg podáváním krystaloidních i koloidních roztoků a podáváním noradrenalinu v kontinuální infuzi. Zvířata v kontrolní skupině potřebovala méně tekutin a byla stabilní po celou dobu experimentu bez nutnosti oběhové podpory. Nasazení podpory noradrenalinem bylo sice ve skupině s imunosupresí oproti skupině se sepsí opožděno, ale rozdíl nebyl statisticky významný. Je ovšem možné, že tento výsledek byl ovlivněn relativně malým počtem zvířat ve skupinách.

Imunosupresivní terapie je v různých variantách užívána při terapii nádorových procesů, autoimunitních onemocnění, střevních zánětů, při transplantaci solidních orgánů a transplantaci kostní dřeně, závažnou komplikací této terapie je zvýšené riziko infekčních komplikací. Imunosupresiva podávaná při transplantaci cílí na jedno či několik míst v imunitním systému, což značně zvyšuje jejich účinek v prevenci i léčbě orgánové rejekce [12]. Imunosupresivní protokol po orgánových transplantacích sestává obvykle z trojkombinace kalcineurinového inhibitoru, kortikoidu a antimetabolitu. Tato kombinace byla zvolena i v našem experimentu. Kontrolní hladina cyklosporinu přesahovala u imunosuprimovaných zvířat 200 ng/ml, bylo tedy dosaženo požadované úrovně imunosuprese.

U imunosuprimovaných nedochází ke klasickým klinickým i biochemickým projevům septické reakce, nemusí být přítomna leukocytóza a ani elevace CRP [13]. Prokalcitonin (PCT) je specifickým ukazatelem systémové bakteriální infekce, jeho elevace je přítomna i u pacientů s imunosupresí [14]. Možnosti analýzy biomarkerů sepse jsou omezené v důsledku nižší dostupnosti kitů ke stanovení prasečích biomarkerů. Ačkoliv bylo prokázáno, že PCT je lepším prediktorem infekční etiologie systémového zánětu než CRP a cytokiny, nemohlo být v experimentu jeho stanovení provedeno. Toto vyšetření v současné době bohužel není pro porcinní model k dispozici.

K významným změnám počtu leukocytů nedošlo. Nebyla zaznamenána významná elevace CRP u CLP miniprasat, což pravděpodobně také souvisí s délkou trvání experimentu, která nebyla dostatečná na to, aby došlo k významným změnám. Vyšší hodnoty CRP v kontrolní skupině na začátku pokusu pravděpodobně ukazují na možnost nepoznaného probíhajícího infektu pokusných zvířat. U septických zvířat nedošlo k nárůstu hodnot laktátu v arteriální krvi, nejspíše z důvodu časné a agresivní volumoterapie.

Rozvoj sepse u zvířat s CLP byl spojen s příslušnou odpovědí cytokinů. Cytokiny jsou biomarkery používané při diagnostice sepse, ke zhodnocení aktuální úrovně zánětlivé odpovědi a prognóze pacienta. Nižší koncentrace IL-4 ve skupině s imunosupresí je vysvětlitelná popsaným farmakologickým efektem užité imunosuprese na produkující buňky (TH2-lymfocyty, paměťové CD4+ buňky). Vyšší koncentrace IL-8 ve stejné skupině je pravděpodobně způsobená kompenzatorní aktivací makrofágů vedoucí ke zvýšení fagocytózy u imunosuprimovaných. Významná diference ve skupině se sepsí a skupině s imunosupresí byla prokázána v případě IL-6 a IL-10. IL-6 je prototypem prozánětlivého cytokinu a IL-10 představuje hlavní protizánětlivý cytokin. Bylo prokázáno, že vysoká koncentrace IL-6 a IL-10 predikuje vyšší mortalitu septických pacientů [15, 16]. Nástup elevace IL-6 byl u imunosuprimovaných zvířat opožděn oproti skupině se sepsí. IL-6 je po podání baktérií nebo LPS (lipopolysacharid) uvolňován do krevního oběhu po 4–6 hodinách. Přestože v naší studii je vzestup IL-6 ve skupině s imunosupresí opožděn, stále představuje časný laboratorní marker sepse. Od počátku zvýšené hodnoty IL-6 v kontrolní skupině byly pravděpodobně způsobeny nerozpoznaným respiračním infektem u dvou zvířat. Vyšší hodnoty IL-10 hrají důležitou roli při omezení intenzity zánětlivé odpovědi inhibicí TNFα, IL-1β a produkcí IL-8, interferonu-γ a IL-6. U ostatních zkoumaných mediátorů nedošlo k významnému ovlivnění jejich kinetiky. V již zmiňované studii prováděné na septických krysách byl v souladu s našimi výsledky popsán vzestup plazmatických koncentrací IL-6, koncentrace TNFα zůstala beze změny. Ve stejné studii popsaný signifikantní vzestup IL-1β nebyl v našem experimentu zaznamenán [11].

Naše studie má několik limitací. Počty zvířat v experimentu nejsou velké, statistické hodnocení tak může být zkresleno. Délka sledování (minimálně 24 hodin po operaci) nemusela být dostatečná. U některých zvířat se sepsí však bylo obtížné, a to i přes terapeutické intervence (volumoterapie, noradrenalin), tento interval dodržet, zásadní prodloužení doby sledování tedy nebylo reálné.

Závěr

Prokázali jsme, že CLP model u miniprasat představuje spolehlivý a reprodukovatelný model polymikrobní sepse u miniprasat. Byly zjištěny signifikantní rozdíly v hemodynamické odpovědi mezi skupinou se zvířaty, u nichž byla vyvolaná sepse metodou CLP, a kontrolní skupinou. U všech CLP zvířat došlo k rozvoji septického šoku s febrilní reakcí, tachykardií a hypotenzí s nutností podávání noradrenalinu. Předpoklad pomalejšího rozvoje septické reakce u zvířat s imunosupresí nebyl v experimentu jednoznačně potvrzen. Klinická i hemodynamická odezva na sepsi byla podobná ve skupině s imunosupresí i ve skupině se sepsí. Nasazení noradrenalinu bylo sice u imunosuprimovaných zvířat opožděné oproti skupině se sepsí, tento rozdíl ale nebyl statisticky významný. Kinetika plazmatických koncentrací IL-4 a IL-8 se signifikantně lišila mezi skupinou imunosuprese a skupinou sepse a kontrolou. Elevace IL-6 byla opožděna v čase ve skupině s imunosupresí oproti skupině se sepsí, rozdíl však nebyl statisticky významný. Průměrné hodnoty IL-6 byly 10 hodin po operaci ve skupině se sepsí významně vyšší než ve skupině s imunosupresí. Koncentrace IL-10 je v pozdějším odstupu od operace signifikantně zvýšena ve skupině imunosuprimovaných oproti skupině se sepsí.

Podporováno výzkumným projektem IGA NS10556-3/2009 Ministerstva zdravotnictví ČR.

Do redakce došlo dne 11. 2. 2012.

Do tisku přijato dne 11. 3. 2012.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. Milan Ročeň, Ph.D.

Klinika anesteziologie, resuscitace a intenzivní péče

Transplantcentrum IKEM

Vídeňská 1958/9

140 21 Praha 4

e-mail: milan.rocen@medicon.cz