Glykovaný hemoglobin. Je ohroženo jeho výsostné postavení v diabetologii?

Souhrn

Společným znakem nemocných s diabetes mellitus je hyperglykemie. Trvající hyperglykemie daná absolutním nebo relativním nedostatkem inzulinu je příčinou mikroangiopatie. Glukóza nereaguje jen s proteiny cévní stěny, ale i s plazmatickými bílkovinami a s hemoglobinem erytrocytů. Této vlastnosti glukózy se využívá k monitoraci úrovně kompenzace diabetu. Hladina glykovaného hemoglobinu odráží glykemii za poslední 2-3 měsíce. V diabetologii se používá od 80. let 20. století. V přehledném referátu se dotkneme některých úskalí, se kterými je glykovaný hemoglobin v poslední době spojován. První část bude věnována faktorům ovlivňujícím glykaci hemoglobinu. Druhá, metodologická část, přiblíží faktory ovlivňující jeho stanovení a interpretaci. Ve třetí části přiblížíme možnosti nahrazení glykovaného hemoglobinu jinými markery kompenzace diabetu.

Klíčová slova:
glykovaný hemoglobin - hemoglobinopatie - kompenzace diabetu

Úvod

Glykovaný hemoglobin (HbA_1c) je magické číslo diabetologie. S trochou nadsázky můžeme říci, že se v jeho hodnotě odráží minulost pacientů a lze z něj předpovídat jejich budoucnost. Je obrazem adekvátnosti zvolené léčby, ale také obrazem kompliance pacienta. Je indikátorem pro změnu léčebné taktiky. Hraje hlavní roli ve všech diabetologických studiích, v nichž je měřítkem síly testovaného léku, měřítkem rizika vzniku komplikací diabetu. Podle standardů České diabetologické společnosti v blízké budoucnosti bude patřit i k diagnostickým prostředkům [1]. Jedinečnost tohoto biochemického markeru, který se v diabetologii užívá již od roku 1978, utržila v posledních letech několik trhlin [2-4]. Pro přehlednost jsme problematiku okolo HbA_1c rozdělili do 3 skupin:

1. Faktory ovlivňující glykaci hemoglobinu.
2. Faktory ovlivňující stanovení a interpretaci HbA_1c (metodologické aspekty).
3. Možnosti nahrazení HbA_1c jinými ukazateli kompenzace diabetes mellitus (DM).

Faktory ovlivňující glykaci hemoglobinu

Glykovaný hemoglobin vzniká glykací bílkovinného řetězce hemoglobinu. Aldehydická skupina glukózy se váže na volné aminokyseliny bílkovin, především valin a lyzin. Jde o neenzymový děj, jehož rychlost je dána koncentrací glukózy. Nejprve vzniká tzv. Schiffova baze (aldimin, nestabilní forma) - tato reakce je reverzibilní a po odeznění přechodné hyperglykemie se glukóza z vazby uvolňuje. Trvá-li však hyperglykemie delší dobu, dochází k tzv. Amadoriho přesmyku a vzniká stabilní ketoamin, který představuje frakci HbA_1c. Glykohemoglobin představuje obecné označení pro několik stabilních minoritních variant hemoglobinu tvořených neenzymatickou posttranslační reakcí. In vivo probíhá modifikace globinových řetězců hemoglobinu HbA hexózami, především glukózou. HbA_1c reprezentuje asi 60 % ze sumy glykohemoglobinů.

Hladina glykovaného hemoglobinu záleží na několika faktorech. Jejich změny mohou ovlivnit hodnotu a následně interpretaci HbA_1c. V následující části článku probereme ty nejdůležitější a nejčastější faktory. Patří sem koncentrace glukózy v plazmě, délka trvání hyperglykemie a zkrácené přežívání erytrocytů. Dále zmíníme hemoglobinopatie - genetické odchylky ve struktuře hemoglobinu. Přesto, že jsou většinou klinicky němé, mohou ovlivnit výsledek HbA_1c. V závěru této části se budeme věnovat ev. vlivu hmotnosti, věku, pohlaví, klimatu, ročního období, kouření a oxidačního stresu na glykaci.

Koncentrace glukózy a její variabilita

Hodnota HbA_1c logicky záleží na koncentraci glukózy. Hned několik studií potvrdilo, že s výší HbA_1c nejtěsněji koreluje průměrná glykemie, ale pouze v případě, že se neodvozuje pouze ze 2 nebo 3 hodnot změřených během jednoho dne. Je nutné vycházet minimálně z 5, raději 7 hodnot denního glykemického profilu. Ideální je stanovení průměrné glykemie z hodnot získaných kontinuálním měřením glukózy v intersticiální tekutině pomocí senzoru. Tak tomu bylo v práci Salardiho. Jeho studie u pacientů s diabetes mellitus 1. typu (DM1) prokázala, že HbA_1c těsněji koreloval s celkovou plochou pod křivkou glykemií než s jednotlivými výkyvy glykemií po jídlech [5]. Přínosem do problematiky glykace je víceméně statistická studie informující o matematickém modelu, podle kterého lze analyzovat detailně proces glykace hemoglobinu. I podle tohoto modelu hodnota HbA_1c těsněji koreluje s průměrnou glykemií než s denním kolísáním glykemie. McCarter zpracoval data ze studie DCCT. Sledoval průměrnou glykemii, denní variabilitu glykemií a jejich korelaci s HbA_1c. Variabilita glykemií, vypočítána jako směrodatná odchylka od průměrné glykemie, měla menší vliv na hodnotu HbA_1c než průměrná glykemie [6]. Ve stejném duchu a s obdobnými výsledky skončila i celá řada dalších studií [7-9]. Variabilitě glykemií byla věnována i anglická studie Kilpatricka z roku 2006, která opět použila data z DCCT. Studie neprokázala korelaci mezi variabilitou glykemií a vznikem mikrovaskulárních komplikací. Pre- a post-prandiální glykemie měly na vznik komplikací stejnou prediktivní hodnotu [10]. HbA_1c sice odráží stav kompenzace diabetu v posledních 6-12 týdnech, ale významně záleží, zda se období hyperglykemie vyskytovalo na začátku nebo na konci odpovídajícího období. Na tuto skutečnost poukazuje recentní studie, která prokázala, že pokud se průměrná glykemie zvýší 3krát oproti normě v posledním měsíci před náběrem HbA_1c, zvýší se hodnota glykovaného hemoglobinu (jeho výsledek) až o 120 % proti normě. Pokud ale stejné změny glykemie proběhly 4 měsíce před náběrem, zvýší se HbA_1c jen o 4 % [11].

Přežívání erytrocytů

Dalším faktorem, který vstupuje do hry, je přežívání erytrocytů. Fyziologická délka života erytrocytu je 120 dní s průměrným poločasem 60 dnů. Dobu života erytrocytů lze sledovat izotopovými metodami po označení erytrocytů izotopem chrómu. Pokud se tato doba zkracuje, mohou být výsledky HbA_1c falešně nižší. S tímto jevem se setkáváme u hematoonkologických nemocí, dále při hemolytických anémiích, uremii, při talasemii nebo při srpkovité anémii. Udává se, že přežívání erytrocytů může být zkráceno při trvající dekompenzaci diabetu, po větší tělesné zátěži, při anorexii a jiné proteinové malnutrici. Naopak falešně vysoké hodnoty HbA_1c se popisují při sideropenických anémiích [12].

Hemoglobinopatie

Další velkou skupinou, kdy výsledky HbA_1c mohou být zkreslené, jsou hemoglobinopatie. Jedná se o dědičné odchylky ve struktuře hemoglobinu. Hemoglobinopatie patří k nejčastějším běžným lidským genetickým nemocem. Většina z nich nemá žádný klinický dopad. Je známo asi 700 variant hemoglobinopatií, z toho je polovina klinicky němých. Prevalenci v obecné populaci nelze vystopovat. Symptomatické hemoglobinopatie způsobují nestabilitu hemoglobinu nebo mění jeho afinitu ke kyslíku se všemi následky z hypoxie tkání. Nejčastější varianty hemoglobinopatií jsou HbS a HbC. Uvádí se, že jejich prevalence v USA je až 9 %. To znamená, že musí postihovat také přibližně 150 000 amerických pacientů s diabetem. K ostatním, méně častým variantám hemoglobinopatií, patří HbSS, HbCC, HbAE, HbAS, Hb Graz, Hb Sherwood Forest, HbO Padova, Hb D a hereditárně perzistující HbF [12]. Pokud se HbA_1c stanoví pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC - high performance liquid chromatography), je vliv hemoglobinopatie eliminován [13]. Stejný autor uvádí, že stavy interferující s hemoglobinem, resp. s glykovaným hemoglobinem, se v Rakousku nevyskytují příliš často. Provedl rozbor všech výsledků glykovaných hemoglobinů provedených v laboratoři v Grazu za posledních 5 let. Z 20 000 provedených vzorků u pacientů s diabetem jich bylo jen 9 pod referované rozmezí. Z těchto 9 nemocných měli 2 jaterní cirhózu, 2 anémii při hematoonkologickém onemocnění a u ostatních byly přítomné hemoglobinopatie (typu HbF, HbGraz, HbSherwood Forest a HbS) [14]. Struktura hemoglobinu může být poškozena nejen geneticky, ale rovněž některými zevními látkami. Vznikají tzv. hemoglobinové deriváty („hemoglobin-derivates“). Nejčastěji jde o poškození hemoglobinu karbamylací při uremii doprovázející onemocnění ledvin, nebo acetylací u alkoholizmu a chronickém užívání vysokých dávek kyseliny acetylsalicylové [15].

Ostatní faktory - věk, pohlaví, kouření, klima, sezonnost, těhotenství a etnicita

Lze nalézt řadu studií věnujících se této problematice. Ve většině z nich nebyl vliv zmíněných faktorů klinicky významný [16]. Stejný názor lze nalézt i ve výše citovaných standardech laboratorní diagnostiky v diabetologii [1]. Práce autorů Yates a Laing prokázala pozitivní korelaci mezi věkem, lačnou glykemií a glykovaným hemoglobinem u nemocných bez diabetu. Tuto skutečnost autoři vysvětlili postupným, i když pomalým, poklesem funkce β-buněk. Inzulinová senzitivita se neměnila [17]. Vlivu věku na glykaci u pacientů s diabetem si všímala i studie Pieriho. Vyšší míra glykace byla vysvětlena fyziologicky zvýšeným oxidačním stresem ve vyšším věku [18]. Vliv pohlaví na glykaci není rovněž silný. Lze najít např. experimentální studii, v níž míra glykace byla větší u myších samců [19]. Ani očekávaná studie ADAG, prezentovaná 18. 9. 2007 na evropském diabetologickém kongresu (EASD) v Amsterdamu, neprokázala vliv typu diabetu, věku, hmotnosti, kouření a etnicity na hodnotu glykovaného hemoglobinu. Záleží jen na koncentraci glykemie, době expozice a dále na přežívání erytrocytů [20]. Zajímavé, ale v celku logické výsledky přinesla 2letá studie u 300 000 amerických veteránů, pacientů s diabetem 2. typu. Autoři si všímali vlivu ročního období, klimatu, nadmořské výšky, pohlaví a rasy na hodnotu HbA_1c. V zimních měsících byl HbA_1c vyšší o 22 % než v létě. Sezonní změny byly stejné i v různých subpopulacích nemocných a měly podobný trend jako jiné rizikové faktory kardiovaskulárního onemocnění (krevní tlak, hmotnost apod.). I mortalita byla v zimě vyšší [21].

Oxidační stres

Nejvíce ze všech popsaných faktorů zasahuje do procesu glykace oxidační stres [22]. Neenzymatická glykace, oxidační stres a stárnutí buněk jsou neoddělitelné procesy, které se mezi sebou vzájemně akcelerují a prolínají. Zvýšená míra volných kyslíkových radikálů a nedostatečná scavengerová kapacita plazmy akcelerují glykaci nejen hemoglobinu, ale i ostatních proteinů plazmy se všemi následky, a to i při normoglykemii. U osob s nízkou absorpční (scavengerovou) kapacitou plazmy pro volné kyslíkové radikály je stupeň glykace vyšší než u osob, které mají tuto kapacitu vysokou [23]. Ve studii Martín-Gallána et al se mladí pacienti s diabetem, s komplikacemi i bez nich, ale se stejnou úrovní kompenzace, mezi sebou lišili jen vyšším stupněm oxidačního stresu ve skupině s komplikacemi [24]. Jak již bylo zmíněno, i u nemocných bez diabetu může sám oxidační stres zvýšit stupeň glykace. K nejčastěji zmiňovaným nemocem, u kterých se popisuje vyšší míra oxidačního stresu, patří stavy spojené s uremií. Uremie snižuje neenzymatickou ochranu proti volným radikálům. Dochází k poklesu gluthation-dehydrogenázy a hladiny kyseliny askorbové. U nemocných s diabetickou nefropatií mohou být výsledky HbA_1c zkreslené hned z několika příčin: díky anémii, zkrácenému přežívání erytrocytů a karbamylaci hemoglobinu [25-27]. Striktně se u těchto nemocných doporučuje používat ke stanovení HbA_1c metodu HPLC. Zvýšená míra glykace byla prokázána rovněž u nemocných bez diabetu, ale s astmatem, revmatoidní artritidou a hypertyreózou. U všech těchto nemocí je vyšší míra oxidačního stresu [28,29]. U nemocných s revmatoidní artritidou připadá v úvahu i užívání vysokých dávek kyseliny acetylsalicylové. Přestože antioxidační léčba má teoretické opodstatnění, výsledky studií jsou často kontroverzní. Se současnou úrovní znalostí zatím není doporučována [30,31].

Faktory ovlivňující stanovení a interpretaci HbA_1c (metodologické aspekty)

Od začátku používání HbA_1c jako markeru pro posouzení kompenzace diabetu panují neshody v metodách jeho stanovení a také v interpretaci výsledků. Ke stanovení HbA_1c byla vyvinuta řada metod. Běžně se používá chromatografie iontoměničová (HPLC) a afinitní, imunochemické metody s využitím specifické monoklonální protilátky, méně často elektroforetické dělení v agarózovém gelu v kyselém prostředí a izoelektrická fokuzace [32].

Za referenční metodu je považována vysokoúčinná kapalinová chromatografie s elektrosprayovou ionizační hmotnostní spektrometrií (HPLC/ESI-MS), alternativně vysokoúčinná kapalinová chromatografie s kapilární elektroforézou (HPLC/CE). Jako kalibrátor slouží směs čistých hemoglobinů HbA_1c a HbA₀. Hodnota hemoglobinu je v kalibrátorech stanovena referenční metodou Internation Federation of Clinical Chemistry (IFCC). Kalibrační rozsah bývá do 15 % HbA_1c. Při referenční metodě nebyly zjištěny žádné významné interference karbamylovaného Hb, acetylovaného Hb ani geneticky anomálních izoforem HbS a HbC. Ve studii DCCT se používala tato metoda na přístroji Diamat, Bio-Rad [12]. V době prezentace DCCT studie (v roce 1993) byl velký nedostatek v komparabilitě metod i laboratoří. Za účelem kontroly a sjednocení metod ke stanovení glykovaného hemoglobinu byla ustanovena pracovní skupina NGSP (National Glycohemaglobin Standardization Program), která se touto problematikou zabývá [33].

Český lékař si asi poprvé uvědomil nesrovnalosti v interpretaci výsledků HbA_1c v lednu roku 2004, tedy v době, kdy Česká republika, jako jedna z mála zemí světa, přešla na rekalibraci dříve používané metody (kalibrátor s návazností na novou referenční metodu IFCC - místo dříve DCCT stanovenou iontoměničovou chromatografií). IFCC metoda je zatížená menšími interferencemi, proto použití nových kalibrátorů vedlo ke snížení referenční hodnoty. Umožňuje lepší standardizaci a mezilaboratorní srovnatelnost.

Výsledky jsou i nadále uváděny v procentech, ale referenční interval se změnil. Se situací se můžeme blíže seznámit prostřednictvím již citovaného standardu České diabetologické společnosti „Laboratorní diagnostika a sledování stavu diabetes mellitus“ (www.diab.cz) a na internetových stránkách České biochemické společnosti (www.sekk.cz) [1]. Tento krok přinesl značné problémy mezi lékaři a pacienty. Přesto, že jsou pacientům nová referenční rozmezí opakovaně vysvětlována, dle našich klinických zkušeností část pacientů zhoršila kompenzaci, protože nižší rozmezí výsledků k tomu psychologicky svádí. Nejednota panuje nejen v České republice. Svědčí o tom i řada zahraničních studií na podobné téma [32,34,35]. Vzniklou situaci se snaží řešit skupiny expertů a zástupců světových diabetologických a biochemických zdravotnických organizací. Výsledkem dosavadního jednání je celosvětový konsenzus. O jeho závažnosti svědčí i fakt, že byl současně publikován ve dvou základních diabetologických časopisech, Diabetes Care a Diabetologia [36]. Tento konsenzus doporučuje celosvětové sjednocení a standardizaci nové používané referenční metody IFCC ke stanovení HbA_1c. Výsledky HbA_1c by se měly brzy uvádět v nových jednotkách (mmol/mol). Třetí hodnotou posuzující chronickou kompenzaci diabetu bude tzv. „estimated average glucose“. Tento nový ukazatel je výsledkem mezinárodní studie ADAG (A_1c-Derived-Average-Glucose). Jeho hodnota je matematicky odvozena z glykovaného hemoglobinu. Pro významnost výsledků této studie jí bude věnován samostatný odstavec.

Jiné markery k posouzení chronické kompenzace diabetu

Hemoglobin glycation index

Před třemi lety McCarter et al vyvinuli nový ukazatel kompenzace a hlavně predikce vzniku chronických diabetických komplikací. Jednalo se o tzv. „hemoglobin glycation index” (HGI). K ověření své hypotézy použili opět data studie DCCT. Index HGI byl stanoven výpočtem z rovnice: HGI = změřený HbA_1c - predikovaný HbA_1c. Predikovaný HbA_1c byl odvozen ze vztahu HbA_1c a průměrné glykemie ze studie DCCT. Podle hodnot HGI rozdělili autoři účastníky studie DCCT na 3 skupiny (s vysokým, středním a nízkým HGI) a stanovili riziko vzniku nebo progrese retinopatie a nefropatie. Nemocní ve skupině s vysokým HGI měli 3krát častěji retinopatii a 6krát častěji nefropatii než nemocní ve skupině s nízkým HGI. Studie uzavírá, že HGI je prediktorem komplikací diabetu. Protože v 7 let trvající studii DCCT bylo přes 1 400 pacientů, zdály se výsledky nepochybné [37]. Po necelých 3 letech byla studie kritizována Lachinem. Svůj komentář logicky uzavírá konstatováním, že predikce a riziko HGI vyplývá jen z jeho přímé asociace s HbA_1c [38].

Estimated average glucose

Dalším markerem kompenzace diabetu je již výše zmíněný tzv. „estimated average glucose“ (e-AG). Zatím nemáme český oficiální překlad pro tento marker, ale můžeme použít např. „odhadnutá průměrná glykemie“. Jde rovněž o vypočítanou hodnotu, jejíž jednotky jsou totožné s jednotkami pro glykemii (mmol/l). Tento nový ukazatel vznikl na základě již výše zmíněné mezinárodní studie ADAG (A_1c-Derived-Average-Glucose Study), jejíž výsledky byly poprvé prezentované 18. 9. 2007 na EASD v Amsterdamu [39]. e-AG se odvozuje z HbA_1c na podkladě zjištěné těsné korelace mezi HbA_1c a průměrnou glykemií. Průměrná glykemie byla ve studii ADAG stanovena ze 7bodových glykemických profilů a 48hodinového monitorování glykemií senzorem. Očekává se, že tento nový parametr bude srozumitelnější. Nemocný si lépe uvědomí kvalitu své kompenzace, pokud mu lékař sdělí, že hodnota jeho „odhadnuté průměrné glykemie“ je např. 8,4 mmol/l, než když mu řekne, že jeho HbA_1c je 7 %. Bližší informace o studii a celé přednášce lze zatím nalézt na internetu (www.easd.org; www.ADAG.com). Publikaci lze očekávat záhy.

Průměrná glykemie

Průměrná glykemie odvozená z malého počtu změřených glykemií nemůže nahradit současně používaný ukazatel kompenzace diabetu, HbA_1c. Pouze za předpokladů, že by hodnoty průměrné glykemie byly vypočítány podobně jako ve studii ADAG (průměrná glykemie určená ze 48hodinového senzoru nebo ze 7bodových profilů glykemií po několik dnů), lze průměrné glykemie využít jako ukazatele dlouhodobé kompenzace. Pokud bude tato průměrná glykemie do 10 mmol/l, lze předpokládat, že bude kompenzace diabetu uspokojivá, tzn. že HbA_1c bude do 5,5 % (IFCC) (resp. HbA_1c 7 % dle DCCT). K tomuto vztahu dospěla Ozmenova studie, ale i výše jmenovaná studie ADAG [40]. Těsný vztah mezi HbA_1c a průměrnou glykemií potvrdila i studie Nathana z listopadového čísla Diabetologie [41].

Závěr

Na základě výše uvedených zkušeností uvádíme závěrem návrh postupu pro klinickou praxi pro případ, že stanovená hodnota glykovaného hemoglobinu bude výrazně v rozporu s očekávanou hodnotou.

1. Řiďte se heslem „důvěřuj, ale prověřuj“. Zkontrolujte nemocnému deníček glykemií, lépe však přímo glykemie v glukometru (přenosem dat z glukometru do počítače). Nejlepší informace o glykemiích vám přinese záznam z kontinuálního monitorování glykemií pomocí senzoru.
2. Pokud vám bod 1 neodhalí příčinu nesrovnalostí, zjistěte, jakou metodu stanovení glykovaného hemoglobinu používá vaše laboratoř. V České republice je nejlépe používat automatizované chromatografické systémy a dát jim přednost před ostatními metodami. Je nutné, aby metody odlišily stabilní formu glykovaného hemoglobinu od nestabilních, reverzibilních forem. Dvakrát ročně se doporučuje provést externí kontrolu kvality. Ta je potvrzená certifikátem. Tento postup však není pro laboratoře povinný. Z chromatografického záznamu lze upozornit na nejfrekventovanější hemoglobinopatie, a tím na riziko dezinterpretace.
   Může však dojít i k „lidské“ chybě, jakou je např. záměna vzorku, chybné přepsání výsledků.
3. Důležitou informací, kterou si většina kliniků neuvědomuje, je skutečnost, že jednotlivé laboratorní výsledky mají své povolené diference. Pro HbA_1c je intraindividuální biologická proměnlivost 1,9 %, dlouhodobá přesnost měření jsou 3 % a kritická diference je 10 %. To znamená, že pokud je např. výchozí hodnota HbA_1c 8 %, je interval, kdy s 95% pravděpodobností není změna HbA_1c klinicky významná, mezi 7,2-8,8 %.

Poděkování

Za cenné připomínky při zpracování článku děkujeme kolegům z Ústavu klinické biochemie a hematologie LF UK a FN Plzeň, MUDr. M. Šolcové, MUDr. V. Petříkové a ing. I. Hupákové.

Podporováno výzkumným záměrem MSM 00216 208 14.

MUDr. Silvie Lacigová, Ph.D.

I. interní klinika LF UK a FN Plzeň

www.fnplzen.cz

e-mail: lacigova@fnplzen.cz

Doručeno do redakce: 27. 11. 2007

Přijato po recenzi: 2. 1. 2008