Současné možnosti laboratorní diagnostiky heparinem indukované trombocytopenie v České republice

Souhrn

Heparinem indukovaná trombocytopenie (HIT) je závažná komplikace léčby heparinem. Je způsobena protilátkami třídy IgG namířenými proti komplexu destičkový faktor 4 (PF4) /heparin a dochází zde k silné aktivaci krevních destiček. I přes antikoagulační léčbu a trombocytopenii je zde vysoké riziko rozvoje žilní i arteriální trombózy. Dia­gnostika HIT vyžaduje jak průkaz klinických symptomů, tak laboratorní potvrzení patogenních protilátek. Laboratorní testy k dia­gnostice HIT rozdělujeme do dvou skupin, a to na imunologické a funkční. Imunologické (antigenní) testy slouží k detekci protilátek namířených proti komplexu PF4/heparin. Funkční testy jsou založeny na vlastnosti protilátek aktivovat v přítomnosti heparinu dárcovské krevní destičky. Cílem tohoto článku je vytvořit stručný přehled laboratorních testů k dia­gnostice HIT dostupných v ČR.

Klíčová slova:

Funkční testy – heparinem indukovaná trombocytopenie (HIT) – laboratorní dia­gnostika HIT – imunologické testy

ÚVOD

Heparinem indukovaná trombocytopenie (HIT) je závažná protrombotická imunitní komplikace léčby heparinem. Je způsobena protilátkami třídy IgG namířenými proti komplexu destičkový faktor 4 (PF4) /heparin. Dochází zde k silné aktivaci krevních destiček vazbou HIT protilátek na destičkové receptory FcgRIIa. Komplexy PF4/heparin/HIT protilátky se vážou také na monocyty, což vede k expresi tkáňového faktoru a iniciaci koagulační kaskády s následnou tvorbou trombinu. I přes antikoagulační léčbu a trombocytopenii je zde vysoké riziko rozvoje žilní i arteriální trombózy. K imunizaci dochází podstatně častěji při léčbě nefrakcionovaným heparinem (UFH) než při léčbě nízkomolekulárním heparinem (low-molecular-weight heparin – LMWH), raritně po užívání pentasacharidu [1–6].

Výskyt protilátek proti komplexu PF4/heparin je však mnohem vyšší než výskyt klinické HIT. Zejména imunologické laboratorní testy využívané v dia­gnostice HIT mají vysokou negativní prediktivní hodnotu, ale poměrně nízkou pozitivní prediktivní hodnotu, pokud nejsou interpretovány v kontextu s klinickým obrazem. Proto by měla být dia­gnostika HIT založená jak na klinickém obraze, tak na detekci patogenních protilátek imunologickými i funkčními testy [7].

Typický klinický obraz HIT je charakterizován poklesem krevních destiček o 30–50 % (v ně­kte­rých případech i o více než 50 %) a/nebo novou trombózou, objevující se 5.–14. den po zahájení léčby heparinem [8]. HIT se může objevit při podávání profylaktických i terapeutických dávek léčiva. Tromboembolické komplikace postihují zejména žilní systém, až u 40 % pacientů se vyvine plicní embolie. Trombóza spojená s HIT se vyskytne u přibližně 30 % pacientů stejný den jako pokles krevních destiček, u přibližně 30 % pacientů během 3–4 dnů po tomto poklesu. Až u 33 % pacientů se trombóza projeví 1–2 dny před poklesem trombocytů [9]. U ně­kte­rých pacientů se můžeme setkat s opožděným nástupem HIT, tzn. déle než 3 týdny po zahájení terapie heparinem [8]. V tomto případě reagují protilátky nezávisle na heparinu a HIT se stává autoimunitním onemocněním.

Dia­gnostika HIT vyžaduje jak průkaz klinických symptomů, tak laboratorní potvrzení patogenních protilátek. Laboratorní testy by se měly provádět pouze u pacientů s projevujícími se klinickými symptomy připomínajícími HIT. Pro kvantifikaci klinických příznaků a určení pravděpodobnosti HIT byly vytvořeny různé klinické skórovací systémy, např. skóre „4Ts“ [10]. Algoritmů dia­gnostiky HIT vycházejících ze „4Ts“ je popsáno několik. Postup dle Greinachera [11] je v současné době považován za nejsenzitivnější a nejspecifičtější. U pacientů s nízkým skóre (0–3) je přítomnost HIT protilátek nepravděpodobná, tudíž by ani neměli být laboratorně testováni. Pacienti se středním (4–5) a vysokým (6–8) skóre mají větší pravděpodobnost pozitivity testů k záchytu HIT protilátek, a proto jsou laboratorně testováni. Pozitivní prediktivní hodnota závisí na hodnotě skóre a na zkušenostech lékaře s jeho používáním. Další dia­gnostický postup dle Pouplarda et al. [12] doporučuje kromě určení skóre „4Ts“ také rychlý screeningový imunologický test u všech pacientů s podezřením na HIT, bez ohledu na hodnotu skóre.

HIT protilátky se vyskytují přechodně a vymizí během několika týdnů po akutní HIT. Pozitivita funkčních testů je zpravidla omezená na dobu tzv. akutní HIT, což je doba, kdy trvá trombocytopenie. Ve fázi subakutní HIT, po úpravě trombocytopenie, trvá pozitivita imunologických testů, ale pozitivita funkčních testů mizí. Pozitivita imunologických testů vymizí u většiny pacientů přibližně po 100 dnech od dia­gnostiky HIT [13].

Laboratorní testy k dia­gnostice HIT rozdělujeme do dvou skupin, a to na imunologické a funkční. Imunologické (antigenní) testy slouží k detekci protilátek namířených proti komplexu PF4/heparin a jsou založeny na vazbě protilátek na hlavní HIT antigen, kterým je PF4 vázaný na polyanion. Funkční testy jsou založeny na vlastnosti protilátek aktivovat v přítomnosti heparinu dárcovské krevní destičky. Podle současných doporučení odborných společností by měla laboratorní dia­gnostika začít detekcí HIT protilátek imunologickým testem s vysokou senzitivitou. V případě pozitivity imunologického testu by mělo následovat provedení funkčního testu, který prokáže, že se jedná o protilátky, které v přítomnosti heparinu aktivují zdravé dárcovské krevní destičky [14].

Právě kombinace klinické dia­gnostiky spolu s vysoce senzitivním imunologickým testem a funkčním testem s vysokou specificitou vede ke správné dia­gnostice HIT (obr. 1).

Cílem tohoto článku je vytvořit stručný přehled laboratorních testů k dia­gnostice HIT dostupných v ČR.

IMUNOLOGICKÉ (ANTIGENNÍ) TESTY

Imunologické testy jsou založené na detekci vazby HIT protilátek na komplex PF4/heparin nebo PF4/polyanion. HIT protilátky jsou dostatečně stabilní v séru i plazmě při –70 °C, což umožňuje vyšetřování v sériích např. technikou ELISA. Avšak vzhledem k potřebě co nejrychleji získaných výsledků se v laboratorní dia­gnostice HIT stále častěji využívají rychlé (screeningové) imunologické testy, které umožňují testování „na vyžádání“ po jednom pacientovi a které mohou poskytnout výsledky do 1 hod od odběru krve [15].

Na tomto principu fungují také všechny v současné době dostupné screen­ingové testy. Jejich hlavní výhodou je jednoduché a velice rychlé provedení. Výsledek je znám během několika minut, což je pro dia­gnostiku HIT velmi důležité. Stejně jako všechny ostatní imunologické testy vykazují i screeningové testy poměrně vysoké procento falešně pozitivních výsledků. Měly by však mít co nejvyšší negativní prediktivní hodnotu. Obecně pro všechny imunologické testy platí, že jimi získaný pozitivní výsledek by vždy měl být potvrzen testem funkčním [14].

V ČR se v současné době používají dva typy screeningových testů, které jsou přímo uzpůsobené k vyšetřování pacientů „po jednom“, jejichž provedení nevyžaduje prakticky žádné speciální laboratorní vybavení a jejichž doba analýzy trvá pouhých několik minut. Jedná se o Lateral Flow Immunoassay (LFIA) a o Particle Gel Immunofiltration Assay (PaGIA). Dříve tu byl dostupný ještě test na principu Particle Immunofiltration Assay [16], ten však do ČR není již několik let distribuován.

Lateral Flow Immunoassay (LFIA)

Jedná se o rychlý screeningový test na principu laterálního toku k vyloučení HIT během pouhých 10 min. Slouží k detekci HIT protilátek třídy IgG namířených proti komplexu PF4/polyanion. Součástí soupravy je speciální cartridge, jejímž základem je testovací proužek tvořený nitrocelulózovou membránou, a lahvička s reagencií opatřená kapátkem. Dále už je k provedení potřeba pouze pipeta pro nanesení 5 µl vyšetřované citrátové plazmy nebo séra [17].

Test používá reagenční pufr obsahující komplexy PF4/polyanion vázané na bio­tin, speciální membránu, která obsahuje nanočástice zlata potažené protilátkou proti bio­tinu, a kozí protilátku namířenou proti lidskému IgG, zakotvenou na membráně v místě testovací linie [17].

Po napipetování 5 µl vyšetřované plazmy nebo séra a přidání dvou kapek reagenčního pufru dojde k migraci směsi přes nitrocelulózovou membránu testovací jednotky, přičemž se HIT protilátky vážou na bio­tinylované komplexy PF4/polyanion a na nanočástice zlata nesoucí protilátky proti bio­tinu. Když tekutina projde přes testovací linii (Line-T), imobilizované kozí protilátky specifické pro Fc doménu lidského IgG zachytí komplexy obsahující IgG anti-PF4 protilátky. Tím dojde k vizualizaci pozitivních výsledků (zbarvení proužku T). Protilátky třídy IgA nebo IgM a nevyvázané částice zlata dále migrují přes membránu a jsou specifickými protilátkami zachyceny kontrolním proužkem C (Line-C). Kontrolní proužek C musí být z důvodu ověření migrace vždy viditelný. Výsledek je negativní, pokud čára v místě line-T není viditelná, nebo je světlejší než na papírové referenční kartě. O pozitivní výsledek se jedná v případě, že je proužek T zbarvený stejně nebo intenzivněji než na referenční kartě. Důležité je, aby byl nejasný výsledek vždy považován za pozitivní a byl dále dovyšetřen funkčním testem. Primárním cílem tohoto testu je HIT vyloučit [17].

K hlavním výhodám tohoto testu patří jednoduchost a rychlost provedení, bez potřeby speciálního vybavení laboratoře. Nevýhodou je v ně­kte­rých případech vizuální hodnocení výsledků, zejména porovnávání intenzity zbarvení proužku T s papírovou referenční kartou. Dalším občasným problémem je nehomogenita ve zbarvení proužku T, kdy je jeho část zbarvena podstatně intenzivněji než zbylý kousek. Z našich mnohaletých zkušeností a provedení stovek vyšetření tímto testem můžeme potvrdit senzitivitu 99 %. V odborné literatuře je publikováno několik srovnávacích studií, zabývajících se senzitivitou a specificitou LFIA vůči metodě Heparin-Induced Platelet Activation (HIPA). Senzitivita se pohybuje mezi 97,5–100 % a specificita mezi 82,3–93,1 % [17,19].

V ČR je dostupný STic Expert HIT od firmy Dia­gnostica Stago (obr. 2, 3). Výrobce již několik let avizuje dodání čtečky (reader) k odečtu výsledků, ta však stále není k dispozici.

Particle Gel Immunofitration Assay (PaGIA)

Jedná se o techniku sloupcové aglutinace, která využívá vazby komplexu PF4/heparin na červené polystyrenové kuličky. Po přidání pacientova séra či citrátové plazmy se protilátky proti komplexu PF4/heparin vážou na kuličky potažené antigenem a aglutinují je. Aglutinace je dále zvýrazněna pomocí protilátky proti lidské IgG v gelovém sloupci. Při následné centrifugaci aglutinované červené kuličky (indikující přítomnost protilátek proti komplexu PF4/heparin) neprocházejí sephacrylovým gelem a vytvářejí červené zbarvení v horní části gelu, zatímco neaglutinující kuličky (indikující nepřítomnost protilátek) procházejí skrz gel a tvoří červené zbarvení na dně kolonky [20].

Testovací souprava obsahuje pozitivní a negativní kontrolu. Sériovým ředěním pacientského séra je umožněno semikvantitativní posouzení titru protilátek. Slabá aglutinace nebývá spojována s klinicky relevantní HIT. Test nedokáže rozlišit IgG, IgA a IgM protilátky [21].

Výhodou tohoto screeningového testu je rychlost a jednoduchost provedení a také možnost semikvantitativního stanovení titru protilátek. Jistou nevýhodou je potřeba centrifugy na gelové karty, která je sice běžným vybavením laboratoří na transfuzních odděleních, avšak v čistě hematologických laboratořích využití nemá. Mnohem podstatnějším problémem, popsaným v literatuře, je nízká senzitivita ně­kte­rých šarží, která vede až k falešné negativitě výsledků a nemusí být odhalena ani použitím komerční kontroly. V ně­kte­rých případech je to také nejednoznačný výsledek, kdy je patrná aglutinace v gelu kolony, ale současně také přítomnost nenavázaných červených kuliček na dně kolony [22].

V odborné literatuře je publikováno několik srovnávacích studií, zabývajících se senzitivitou a specificitou PaGIA vůči metodě Serotonin release assay (SRA). Senzitivita se pohybuje mezi 95,5–100 % a specificita mezi 91,4–93,7 % [19,24].

V ČR je dostupný ID-heparin/PF4 PaGIA od firmy Diamed SA (obr. 4) [24]. Výroba však byla v prosinci 2021 ukončena. K dispozici je tak už pouze poslední šarže.

Další imunologické testy již neřadíme mezi tradiční screeningové testy. Doba analýzy je u ně­kte­rých z nich řádově několik minut, jiné trvají hodiny. Všechny však vyžadují speciální laboratorní vybavení, které je pro jejich provedení nezbytné.

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tato skupina antigenních testů opět detekuje protilátky na základě jejich vazby na komplexy PF4/polyanion. Podle způsobu provedení můžeme ELISA techniky rozdělit na tzv. solid-phase ELISA a fluid-phase ELISA. V současné době se využívají nejčastěji ELISA techniky na pevné fázi, zejména tzv. sendvičové, které komerčně vyrábí řada výrobců, např. Dia­gnostica Stago, Hyphen BioMed, Immucor GTI Dia­gnostic, Inc. a další. Soupravy jednotlivých firem se liší použitým polyaniontem (heparin, polyvinylsulfonát, heparin vázaný na protamin), zdrojem PF4 (rekombinantní, krevní destičky, destičkový lyzát) a počtem či typy tříd protilátek, které zachytávají (IgG specifické, polyspecifické IgA, IgM, IgG) [25].

ELISA techniky mají ve srovnání s funkčními testy využívajícími promyté dárcovské destičky relativně nízkou specificitu, stejně jako ostatní imunologické testy [26]. Naopak senzitivita, tzn. schopnost zachytit klinicky relevantní HIT protilátky, se blíží 100 % [1,10]. Z literatury je však patrné, že se senzitivita i specificita komerčně dostupných souprav od různých výrobců značně liší. Z publikovaných srovnávacích studií zabývajících se senzitivitou a specificitou ELISA souprav vůči metodě HIPA je patrné, že se senzitivita pohybuje mezi 97,1–100 % a specificita mezi 80,9–94,4 % [19].

Dosáhnout vyšší specificity bez významného snížení senzitivity je možné použitím IgG specifických technik [27–29]. Zvýšit specificitu lze také provedením testu za podmínek vysoké koncentrace heparinu [30, 31]. Při této „konfirmační proceduře“ je vyšetření zopakováno v prostředí heparinu o koncentraci 100 U/ml, která rozruší antigenní komplexy PF4/heparin, čímž je reaktivita obvykle inhibována. Zvýšení specificity není v tomto případě nějak významné, neboť vysoká koncentrace heparinu obvykle inhibuje patogenní, ale i nepatogenní HIT protilátky. Z praxe je navíc známo poměrně málo případů pozitivních vzorků, které nejsou inhibovány vysokou koncentrací heparinu [32].

Pravděpodobnost, že pozitivní výsledek ELISA testu ukazuje na přítomnost patologických HIT protilátek aktivujících krevní destičky, přímo souvisí s mírou pozitivity výsledku, tzn. s naměřenou hodnotou absorbance [10]. Čím vyšší je hodnota naměřené absorbance, tím vyšší je pravděpodobnost pozitivity funkčních testů, tzn. průkazu HIT protilátek schopných aktivovat krevní destičky. Souvislost mezi hodnotou naměřené absorbace a pozitivitou funkčních testů byla zaznamenána při testování několika souprav ELISA [33]. Vyšší hodnota absorbance ELISA testů koreluje také s vyšším výskytem trombózy [34,35].

Laboratorní vyšetření HIT protilátek pomocí komerčně dostupných souprav ELISA spočívá v zachycení stanovované protilátky na dno mikrotitrační destičky přes komplex PF4/polyanion. Na destičku se aplikuje blank, pozitivní a negativní kontrola a naředěná citrátová plazma či sérum pacienta. Zpravidla se používá několik ředění vyšetřovaného materiálu. Po inkubaci a odmytí balastu následuje vazba konjugátu, protilátky značené enzymem. Po druhé inkubaci a promytí následuje přidání substrátu. Ten je štěpen enzymem za vzniku barevného zbarvení, reakce se zastaví přídavkem minerální kyseliny a poté se měří absorbance (nejčastěji při 450 nm). Naměřená hodnota blanku se odečte od absorbancí naměřených v ostatních jamkách. Získaný výsledek se porovnává s cut-off hodnotou. Soupravy bývají navržené tak, aby se daly použít k vyšetření pouze jednoho pacienta samostatně. Mikrotitrační destička je rozdělena na jednotlivé řady (stripy) po osmi jamkách a jednotlivé reagencie jsou v soupravě v dostatečném počtu lahviček. [36]

K výhodám patří kromě výše zmíněné vysoké citlivosti metody také její dobrá dostupnost (tab. 1). Komerční soupravy mají CE značku a v současné době se běžně prodávají ve variantě s jednou řadou jamek (tzv. monostrip). Mezi nezbytné vybavení laboratoře k provedení testu patří čtečka ELISA (reader), která však bývá běžným vybavením větších hematologických pracovišť. Hlavní nevýhodou je nízká dia­gnostická specificita, zvláště když se získá pouze slabě pozitivní výsledek. Vyšší specificity však lze dosáhnout jednak použitím IgG specifických technik, jednak přidáním vysoké koncentrace heparinu do reakční směsi. Nevýhodou ELISA testů je relativně dlouhá doba analýzy, obvykle 3–4 hod, což je dáno poměrně dlouhými inkubacemi [36].

Latex Immunoturbidimetric Assay (LIA)

Tento automatizovaný test, který se vyšetřuje na automatických koagulometrech imunoturbidimetrickým principem, vyvinula společnost Instrumentation Laboratory (IL). Jedná se o tzv. funkcionalizovaný imunotest, který detekuje HIT protilátky v citrátové plazmě na základě jejich schopnosti inhibovat aglutinaci latexových nanočástic potažených monoklonální protilátkou (podobnou HIT protilátkám) po přidání komplexů PF4/polyvinylsulfonát (PVS). Pokud se jedná o negativní vzorek, kdy nejsou HIT protilátky přítomny, dojde k aglutinaci latexových částic přes komplexy PF4/PVS. Naopak v přítomnosti HIT protilátek dochází na základě jejich koncentrace ve vzorku k vyvazování na komplex PF4/PVS a tím k inhibování aglutinace latexových částic. Test je schopen detekovat protilátky tříd IgG, IgA a/nebo IgM [37].

V odborné literatuře je publikováno několik srovnávacích studií zabývajících se senzitivitou a specificitou LIA vůči metodě HIPA. Senzitivita se pohybuje mezi 97,4–100 % a specificita mezi 84,3–94,0 % [14,19,37].

Velkou výhodou této techniky je rychlost vyšetření – výsledek je dostupný do 20 min od vložení vyšetřované plazmy do přístroje. Díky použití standardizovaných přístrojů a standardizovaných reagencií zaručuje dosažení srovnatelných výsledků v různých laboratořích. Reagencie jsou tekuté a připravené k použití, čímž se výrazně zkracuje doba od přijetí požadavku na vyšetření laboratoří do vydání výsledku a minimalizuje se riziko chyby [37].

Nevýhodou metody je omezená stabilita reagencií po jejich otevření a s tím související prodražení vyšetření z důvodu nespotřebování reagencií do vypršení jejich stability.

Chemiluminiscenční imunoanalýza (CLIA)

Jedná se o rychlý, plně automatizovaný chemiluminiscenční test vyvinutý společností Instrumentation Laboratory (IL) prováděný na přístroji BIO-FLASH®. Princip spočívá v detekci HIT protilátek navázaných na magnetické částice potažené komplexem PF4/polyvinylsulfonát. Po inkubaci, magnetické separaci a následném promývacím kroku je přidán tzv. tracer, obsahující isoluminolem značenou antihumánní IgG protilátku, která se váže na HIT protilátky zachycené na magnetických částicích. Po druhé inkubaci, magnetické separaci a promytí se přidají činidla, která způsobí chemiluminiscenci. Přístroj pak změří emitované světlo, které je přímo úměrné koncentraci stanovovaných HIT protilátek [38].

V odborné literatuře je publikováno několik srovnávacích studií, zabývajících se senzitivitou a specificitou CLIA vůči metodě SRA. Senzitivita se pohybuje mezi 97,0–100 % a specificita mezi 95,2–98,5 % [19,39].

Výhodou této metody je plná automatizace, dlouhá stabilita reagenční cartridge v přístroji a rychlost získání výsledku – doba analýzy je přibližně 30 min od vložení vzorku citrátové plazmy či séra do přístroje. Jedná se tedy o metodu vhodnou pro testování HIT „na vyžádání“ v režimu 24/7 [38].

I přes dlouhou stabilitu reagencií v přístroji se na spoustě pracovišť nepodaří veškerý obsah do konce stability využít, což vyšetření významně prodraží. Další nevýhodou je značně omezené využití přístroje BIO-FLASH® v hematologické laboratoři.

FUNKČNÍ TESTY

Funkční testy detekují HIT protilátkami zprostředkovanou aktivaci krevních destiček zdravých dárců v přítomnosti heparinu. Tato aktivace je zprostředkována destičkovými receptory FcgRIIa, a to pouze protilátkami třídy IgG. Na rozdíl od antigenních testů detekují funkční testy také protilátky proti jiným vzácným antigenním komplexům, jako jsou Interleukin-8 (IL-8) /heparin nebo Neutrophil activating peptide 2 (NAP-2) /heparin. Zvýšení senzitivity lze dosáhnout použitím promytých dárcovských krevních destiček [38].

Optická agregometrie

Citrátová plazma bohatá na destičky (PRP) od zdravých dárců, sérum pacienta a heparin jsou inkubovány za stálého míchání v měřicí kyvetě optického agregometru (nefelometru). HIT protilátky způsobují po časové prodlevě cca 5–10 min od přidání heparinu o koncentraci 0,5–1,0 IU/ml agregaci dárcovských krevních destiček. Agregace destiček se sleduje po dobu 15 min [38].

Zcela zásadním krokem celé analýzy je výběr a příprava vhodných dárcovských krevních destiček. Dárce destiček nesmí v posledních 10 dnech před odběrem užívat žádnou medikaci ovlivňující funkci krevních destiček. Citlivost krevních destiček různých dárců k HIT protilátkám se liší, proto je vhodné používat destičky od dárců s ověřenou citlivostí vůči HIT protilátkám. Zdrojem destiček je PRP, připravená centrifugací plné krve při 120× g po dobu 20 min při laboratorní teplotě bez použití brzdy. Počet destiček v PRP je upraven na hodnoty 3×10⁸/ml pomocí vlastní plazmy chudé na destičky (PPP) [38].

Za účelem zvýšení specificity metody je možné použít tepelnou inaktivaci vyšetřovaného séra při 56 °C po dobu 30 min. Tím dojde k výrazné eliminaci efektu zbytkového trombinu a aktivovaných složek komplementu, které by jinak mohly falešně aktivovat dárcovské krevní destičky [38].

K ověření funkčnosti destiček se jako negativní kontrola testu používá pufr, jako pozitivní kontrola kolagen. Ideální je použít jako pozitivní kontrolu archivované pacientské sérum s již dříve ověřenou pozitivitou HIT protilátek schopných aktivovat krevní destičky. Krevní destičky normálně po přidání heparinu neagregují. Pokud má pacient HIT protilátky, dojde k agregaci destiček během 15 min po přidání heparinu. Zkřížená reaktivita HIT protilátek s heparinoidem je hodnocena s použitím danaparoidu místo heparinu [40].

Velkou nevýhodou této metody pro dia­gnostiku HIT je její relativně nízká senzitivita a obtížná standardizace. Srovnávací studií na 77 pacientských vzorcích vyšetřených metodou optické agregometrie bylo dosaženo senzitivity 39–81 % v závislosti na reaktivitě dárcovských krevních destiček a specificity 90 % vůči SRA [40]. Další studie na 200 vzorcích dosáhla senzitivity 76 % a specificity 96 % vůči SRA [41]. Z těchto důvodů by neměly být agregační testy využívající PRP prováděny za účelem vyloučení přítomnosti HIT protilátek [38].

Heparin‐Induced Multiple Electrode Aggregometry (HIMEA)

Jedná se o metodu impedanční agregometrie, která hodnotí agregaci krevních destiček v plné krvi zdravého dárce v přítomnosti séra nebo citrátové plazmy pacienta a v přítomnosti heparinu ve dvou koncentracích, nízké (0,25–1,0 IU/ml) a vysoké (50–100 IU/ml). Metoda se provádí na přístroji Multiplate® [14].

Stejně jako u optické agregometrie dochází v případě přítomnosti HIT protilátek a heparinu o nízké koncentraci k agregaci dárcovských krevních destiček. Naopak vysoká koncentrace heparinu reakci inhibuje. Hodnotí se plocha pod křivkou (area under the curve – AUC). Doba analýzy je 15 min. Software analyzátoru Multiplate® obsahuje speciální aplikaci pro vyšetření HIT – HIMEA [41].

V porovnání s optickou agregometrií dosahuje impedanční agregometrie dle většiny studií vyšší senzitivity i specificity [42,43]. Srovnávací studií na 200 pacientských vzorcích vyšetřených metodou impedanční agregometrie bylo dosaženo senzitivity 81 % a specificity 99 % vůči SRA [41]. Další studie na 70 vzorcích dosáhla senzitivity 85,7 % a specificity 98,4 % vůči SRA [44].

Velkou výhodou HIMEA je použití plné dárcovské krve, díky čemuž odpadá příprava PRP. Výhodou je také používání hirudinu jako protisrážlivého činidla v odběrových zkumavkách, jenž spolehlivě inhibuje veškerý zbytkový trombin ve vzorku. Výběr vhodných dárcovských destiček je i v případě impedanční agregometrie klíčový. Opět je nutné vyloučit zkříženou reaktivitu a samovolnou agregaci dárcovských destiček v přítomnosti heparinu [43].

Průtoková cytometrie

Pomocí průtokové cytometrie lze sledovat přítomnost markerů aktivace dárcovských krevních destiček (PRP) v přítomnosti pacientova séra a heparinu. Existuje celá řada home-made metod, založených na detekci různých markerů aktivace dárcovských krevních destiček. Jedním z využívaných markerů je destičkový P-Selektin, na jehož stanovení je založena metoda s názvem Platelet P-Selectin Expression Assay (PEA). V rámci provedené klinické studie, která analyzovala 91 pacientských sér, došli autoři k závěru, že je PEA k detekci destičky aktivujících protilátek senzitivnější než SRA [45].

Kromě zmíněných home-made metod je na trhu dostupná komerční souprava HITAlert^TM Kit od firmy IQ Products. Identifikace krevních destiček zde probíhá na základě znaku CD41. Aktivované destičky jsou detekovány pomocí annexinu V, který rozpozná fosfatidylserin na jejich povrchu [46].

Srovnávací studií na 37 pacientských vzorcích vyšetřených metodou průtokové cytometrie s použitím této soupravy bylo dosaženo senzitivity 81 % a specificity 100 % vůči SRA [46].

Jedná se o jednoduchou metodu, která nevyžaduje promyté dárcovské krevní destičky. Doba analýzy je 110 min. Výhodou je snadná standardizovatelnost metody při použití soupravy HITAlert^TM Kit. Souprava také detekuje protilátky namířené proti vzácným komplexům IL-8/heparin a NAP-2/heparin. Jistou nevýhodou je omezená dostupnost průtokové cytometrie v hematologických laboratořích a potřeba vhodných čerstvých dárcovských krevních destiček v době analýzy [46].

Heparin-Induced Platelet Activation Test (HIPA)

Test heparinem vyvolané aktivace krevních destiček (HIPA) patří do skupiny testů využívajících promyté dárcovské krevní destičky resuspendované v Tyrodovém pufru s fyziologickými koncentracemi vápenatých a hořečnatých iontů. Sérum pacienta musí být tepelně inaktivováno, aby se zabránilo aktivaci krevních destiček trombinem a komplementem. Promyté destičky a sérum pacienta jsou následně inkubovány s heparinem o různých koncentracích na mikrotitrační destičce. Sérum obsahující HIT protilátky vyvolá aktivaci krevních destiček při nízké koncentraci heparinu (0,1–0,3 IU/ml), nikoli však při jeho vysoké koncentraci (100 IU/ml). Reakce není blokována hirudinem, naopak je blokována v přítomnosti monoklonální protilátky blokující FcgRIIa receptory krevních destiček. V současné době dosahují HIPA a SRA nejlepšího poměru senzitivity (~ 95 %) a specificity (> 99 %) a jsou považovány za konfirmační testy v dia­gnostice HIT protilátek. Jsou ale technicky i časově velice náročné [47,48].

K dosažení vysoké specificity testu je nezbytné zajistit několik dílčích kroků:

a) použít destičky od 4 dárců;

b) použít slabě a silně HIT pozitivní séra;

c) prokázat, že vysoká koncentrace heparinu (100 IU/ml) inhibuje reaktivitu HIT séra;

d) prokázat, že je reaktivita HIT séra inhibována monoklonální protilátkou blokující FcgRIIa receptor krevních destiček [49,50].

Inkubace dárcovských krevních destiček a séra pacienta se provádí v jamkách mikrotitrační destičky. V každé jamce jsou 2 nerezové kuličky, které jsou rozpohybovány magnetickým míchadlem. Jamky jsou vizuálně odečítány každých 5 min proti nepřímému zdroji světla, přičemž se hodnotí změna vzhledu reakční směsi z kalné (žádná agregace) na průhlednou (došlo k agregaci). Pokud nastala agregace při terapeutické koncentraci heparinu (0,2 IU/ml) a při vysoké koncentraci heparinu (100 IU/ml) došlo k její inhibici, jedná se o pozitivní výsledek. Vzorek je považován za pozitivní, jsou-li získány pozitivní výsledky s destičkami alespoň 2 ze 4 dárců. Čím vyšší je reaktivita protilátek, tím rychleji dojde k agregaci dárcovských destiček. Je nutné vyloučení nespecifických reakcí – tj. situací, kdy dojde k aktivaci destiček od všech 4 dárců v přítomnosti nízké i vysoké koncentrace heparinu. Vysoká koncentrace heparinu inhibuje aktivaci destiček způsobenou protilátkami třídy IgG, ale nikoli aktivaci způsobenou cirkulujícími imunokomplexy. Nespecifické aktivaci destiček způsobené cirkulujícími imunokomplexy je možné zabránit přídavkem monoklonální protilátky blokující Fc receptor krevních destiček, která inhibuje aktivaci trombocytů způsobenou HIT IgG protilátkami. K vyloučení zkřížené reaktivity se místo heparinu používá heparinoid danaparoid [49].

Mezi nejnáročnější a zároveň nejdůležitější kroky HIPA testu patří výběr, příprava a promytí dárcovských krevních destiček a volba vhodných kontrol. Samozřejmě také příprava pacientského séra, které musí být inaktivováno při 56 °C po dobu 30 min. Samotné vyšetření musí být provedeno s destičkami od 4 dárců, vše ideálně v dubletu. Z praxe je bohužel známo, že zdaleka ne všechny dárcovské trombocyty jsou vhodné pro provedení HIPA testu, neboť ně­kte­ré z neznámého důvodu dostatečně nereagují na přítomnost HIT protilátek. Správný výběr dárcovských trombocytů tak je pro provedení testu zásadní. K ověření funkčnosti krevních destiček se jako negativní kontrola používá pufr, jako pozitivní kontrola roztok kolagenu [50].

Vyšetření v ČR provádí pouze Ústav hematologie a krevní transfuze (ÚHKT) Praha, Oddělení bio­chemie, vždy současně s vyšetřením SRA.

Serotonin release assay (SRA)

Test uvolňování serotoninu (SRA) je považován za zlatý standard v dia­gnostice HIT, zejména z důvodu jeho vysoké senzitivity (~ 95 %) i specificity (> 99 %). Jedná se o další funkční test, který využívá promyté krevní destičky. Test detekuje množství serotoninu uvolněného z denzních granulí dárcovských krevních destiček během jejich aktivace HIT protilátkami. Destičky jsou nejprve radioaktivně značeny pomocí ¹⁴C-serotoninu. Po inkubaci je měřeno množství radioaktivity v supernatantu, které je úměrně míře aktivace krevních destiček. Výsledek je vyjádřen jako procento uvolněného serotoninu z celkového množství serotoninu v krevních destičkách. Pozitivní výsledek je takový, kdy se uvolní > 20 % serotoninu při terapeutické koncentraci heparinu (0,1–0,3 IU/ml), zatímco při vysoké koncentraci heparinu (100 IU/ml) je aktivace destiček potlačena kvůli rozpadu imunokomplexů [48,51,52].

SRA se často vyšetřuje spolu s HIPA testem. Příprava dárcovských krevních destiček je totiž stejná. Poté je přidán ¹⁴C-serotonin a probíhá inkubace při 37 °C po dobu 30 min. I další postup je velmi podobný HIPA testu, pouze s drobnými rozdíly, např. jamky mikrotitrační destičky nejsou promíchávány pomocí kovových kuliček, ale pomocí třepačky. Celé zpracování vzorku je velice pracné a časově náročné [53].

V ČR vyšetřuje SRA pouze ÚHKT Praha, Oddělení bio­chemie, a to jako speciální vyšetření s uváděnou dobou odezvy do 2 měsíců. Navíc se jedná o modifikaci původního testu, kdy se ke krevním destičkám nepřidává radioaktivně značený ¹⁴C-serotonin. Serotonin uvolněný z dárcovských krevních destiček je stanoven pomocí HPLC s fluorimetrickou detekcí. Jako negativní kontrola se používá Tyrodový pufr, který se do reakce dává místo séra pacienta a slouží ke kontrole spontánního uvolňování serotoninu z krevních destiček. Jako pozitivní kontrola, která slouží ke zjištění maximálního množství uvolnitelného serotoninu, se používá peptid aktivující destičkový trombinový receptor (TRAP). V případě pozitivity vzorku musí být množství uvolněného serotoninu při nízké koncentraci heparinu > 35 % a současně při vysoké koncentraci heparinu < 15 % [54].

Další funkční testy používané k dia­gnostice HIT

Další techniky umožňující hodnocení aktivace krevních destiček zahrnují kvantifikaci mikropartikulí uvolněných z krevních destiček pomocí průtokové cytometrie [55], či kvantifikaci uvolněného serotoninu pomocí průtokové cytometrie [56]. Tyto metody se však k dia­gnostice HIT v ČR nepoužívají.

Kompletní přehled metod pro laboratorní dia­gnostiku HIT shrnuje tab. 2.

ZÁVĚR

V současné době máme k dispozici poměrně širokou paletu testů pro laboratorní dia­gnostiku HIT. Ně­kte­ré z nich jsou dostupné i v laboratořích malých nemocnic, jiné lze provádět pouze na specializovaných pracovištích. V každém případě je potřeba, aby laboratorní testy byly prováděny pouze u pacientů s projevujícími se klinickými symptomy připomínajícími HIT, tzn. po správné kvantifikaci klinických příznaků lékařem pomocí ně­kte­rého ze skórovacích systémů. U pacientů s nízkým skóre je přítomnost HIT protilátek nepravděpodobná, tudíž by ani neměli být testováni.

Pokud existuje podezření na HIT, měly by se nejdříve vyšetřovat testy imunologické, s vysokou senzitivitou, která se blíží 100 %. Kvůli relativně nízké specificitě mohou poskytovat falešně pozitivní výsledky, nicméně jejich úkolem je zachytit přítomnost HIT protilátek v plazmě či séru pacienta. Za tímto účelem byly speciálně vyvinuty screeningové testy, které ke svému provedení nevyžadují žádné speciální laboratorní vybavení, a proto mohou být dostupné i v laboratořích malých nemocnic. Jsou také uzpůsobeny k vyšetřování vzorků pacientů „po jednom“.

V případě pozitivity imunologických testů je nezbytné přítomnost HIT protilátek potvrdit funkčním testem, který prokáže schopnost protilátek z plazmy či séra pacienta aktivovat zdravé dárcovské krevní destičky za přítomnosti heparinu. Tyto testy mají vysokou specificitu. Dostupné jsou zpravidla pouze na velkých specializovaných pracovištích a k jejich provedení jsou nutné speciální laboratorní vybavení a zkušenosti laboratorního personálu. Ně­kte­ré funkční testy na HIT se vyšetřují pouze v sériích, a mají tedy delší dobu odezvy. Právě doba odezvy je pro správné zvládnutí HIT klíčová, klinik potřebuje výsledek co nejdříve. Záchyt pozitivní HIT je poměrně vzácný, o to důležitější je propracovaný systém laboratorní dia­gnostiky.

PODÍL AUTORŮ NA PŘÍPRAVĚ RUKOPISU

PS – sepsání rukopisu

IF, PD – revize rukopisu

Všichni autoři souhlasí s finální verzí rukopisu.

GRANTOVÁ PODPORA

Práce vznikla za podpory MZ ČR-RVO (FNHK, 00179906).

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Doručeno do redakce dne: 8. 4. 2022.

Přijato po recenzi dne: 20. 5. 2022.

RNDr. Petr Sadílek, Ph.D.

IV. interní hematologická klinika

FN Hradec Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: petr.sadilek@fnhk.cz