Epigenetické změny jako nový nástroj pro prognostickou stratifikaci pacientů s chronickou lymfocytární leukemií

Souhrn

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je klonální B lymfocytární malignita s velmi heterogenním průběhem. Někteří pacienti zůstávají asymptomatičtí řadu let a nevyžadují léčbu, oproti nim pacienti s agresivní formou nemoci podstupují léčbu brzy po diagnóze. V posledních letech je přikládán stále větší význam roli metylací nejen pro přirozený vývoj, ale také při vzniku a vývoji různých onemocnění včetně nádorových. Z výsledků celogenomových metylačních studií vyplývá, že u CLL, podobně jako u jiných malignit, vznikají aberantní změny v metylačním profilu v raných fázích nemoci. Metylační profily CLL pacientů se mezi sebou liší a metylační status některých míst je spojen s agresivnějším průběhem nemoci. V tomto přehledu se zaměřujeme na metylační změny a jejich roli v prognóze CLL.

Klíčová slova:
chronická lymfocytární leukemie – CLL – epigenetika – metylace – prognóza – diferenciace

ÚVOD

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je nejčastější leukemií dospělých v Evropě a Severní Americe. Jedná se o klonální nádorové onemocnění, při kterém dochází ke kumulaci malých zrale vypadajících B lymfocytů s fenotypem CD5+ CD19+ [1, 2]. Pacienti jsou často diagnostikovaní náhodně v asymptomatické fázi nemoci. CLL má však velmi heterogenní průběh od indolentní formy, která dlouhodobě nevyžaduje léčbu, po agresivní formu s nutností časné léčebné intervence. Z toho důvodu je žádoucí stanovení rizika progrese nemoci, aby bylo možné rozpoznat, u kterých pacientů je riziko nepříznivého průběhu nejvyšší. K tomuto účelu u CLL slouží řada prognostických faktorů. Mezi nejvýznamnější a široce přijímané patří mutační status genu kódujícího variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu (IGHV) [3, 4] a chromozomové aberace [5], z nichž největší význam má delece 17p zahrnující nádorový supresorový gen TP53 [6]. Recentní práce však poukazují také na velký potenciál zhodnocení epigenetického stavu maligních buněk pro stanovení prognózy CLL.

EPIGENETIKA A METYLACE DNA

Epigenetika se zabývá studiem změn v genové expresi, při nichž nedochází ke změnám v sekvenci DNA. Nejčastějšími epigenetickými modifikacemi DNA jsou metylace, které se vyskytují především na cytosinu v dinukleotidech s guaninem (cytosin-fosfát-guanin;  CpG) [7]. Většina CpG dinukleotidů je soustředěna v CpG ostrůvcích, které jsou často hypometylované a najdeme je hlavně v promotorech genů [8, 9]. Naopak CpG dinukleotidy nacházející se mimo CpG ostrůvky jsou velmi často metylovány a vyskytují se v promotorech tkáňově specifických genů a v repetitivních oblastech, kde je jejich funkcí umlčet repetitivní oblasti a zachovat integritu genomu.

Metylace umožňují tkáňově specifickou expresi, a tím i diferenciaci a morfogenezi buněk. Také při diferenciaci multipotentní hematopoetické kmenové buňky do B lymfocytu je na základě signálů z okolního prostředí měněn metylační profil buňky a s ním i genová exprese, což umožňuje vývoj B lymfocytu (obr. 1). Metylační profil je dědičný a díky DNA metyltransferázám je zachováván při dělení buňky i mezigeneračně [10]. Během diferenciace a stárnutí narůstá metylace některých CpG ostrůvků, zatímco celková hladina metylace klesá [11]. Podobný, ale výraznější efekt, byl pozorován u nádorových buněk, kde dochází k masivní globální hypometylaci spojené s nestabilitou genomu a zároveň k metylaci promotorů tumor-supresorových genů.

METYLACE DNA U CLL

U nádorů je metylační profil spojovaný nejen s deregulací genové exprese, ale také s buněčným původem a stadiem vývoje, což je u CLL velmi diskutované téma. Metylace výrazně ovlivňují normální vývoj B lymfocytů i jejich funkci [12]. Během zrání B lymfocytu dochází k výrazné celkové demetylaci a naopak k lokálním hypermetylacím. Některé z těchto procesů jsou přímo ovlivněny podněty z okolního prostředí, např. při aktivaci proliferace dochází k demetylaci některých promotorových oblastí a zesilovačů transkripce.

Skupina Martin-Subera identifikovala pomocí metod celogenomového bisulfitového sekvenování a vysokohustotních čipů 1649 CpG míst, jejichž míra metylace souvisí s buněčným původem CLL [13]. CLL buňky se nejvíce podobají dvěma stadiím vývoje lymfocytu: naivním buňkám, které se nepotkaly s antigenem a nedošlo u nich k hypermutacím imunoglobulinů, a paměťovým buňkám, které již prošly germinálním centrem a procesem hypermutace imunoglobulinů a přesmyku tříd. Z těchto 1 649 míst bylo vybráno pět CpG míst, která se nachází v genech B3GNTL1, CTBP2, TNF, v promotoru genu SCARF1 a v intergenové oblasti chromozomu 14. Pomocí těchto pěti CpG míst je možné rozdělit CLL pacienty do tří prognostických skupin [14].

První skupina pacientů „n-CLL“ (naive B-cell-like CLL) má leukemické buňky podobné naivním B lymfocytům, převažuje u ní vysoká míra metylace a prognóza pacientů z této skupiny je nejhorší vzhledem ke krátkému času do první terapie (TTFT) i kratšímu celkovému přežití (OS). Druhá skupina „m-CLL“ (memory B-cell-like CLL) vykazuje podobnosti k paměťovým B lymfocytům s nízkou mírou metylace a nejlepší prognózou. Kromě těchto dvou skupin byla identifikována ještě třetí skupina „i-CLL“ (intermediate CLL) vykazující střední hodnoty metylace i střední prognózu. Tyto tři prognostické skupiny se částečně překrývají s rozdělením podle procenta IGHV identity k nejbližší zárodečné sekvenci, avšak korelují lépe s TTFT než při rozdělení pacientů podle IGHV [14].

Bylo zjištěno, že skupiny pacientů definované na základě metylačních profilů mají také odlišné biologické charakteristiky. V souladu s nerovnoměrným zastoupením IGHV subgenů mezi pacienty s mutovaným a nemutovaným IGHV se liší jejich využití v jednotlivých skupinách podle metylačního profilu: u n-CLL je nejvýraznější IGHV1-69 (27 %) [4, 14]; u m-CLL IGHV4-34 (29 %); a u i-CLL skupiny IGHV3-23 (17 %) a IGHV1-18 (13 %) [1, 15]. O výskytu stereotypních subsetů ve skupinách definovaných na základě metylačních profilů dosud referuje pouze sdělení prezentované na konferenci Evropské hematologické asociace, které mimo jiné ukazuje, že stereotypní subset #2 s přestavbou IGHV3-21 tvoří jasně definovanou jednotku v rámci i-CLL [16]. Z hlediska chromozomových aberací a genových mutací u n-CLL převažují delece 11q, trizomie chromozomu 12 a mutace v genu NOTCH1, i-CLL má významné zastoupení delece 13q a zejména mutací v genu SF3B1 a u m-CLL je nejvýznamnější zastoupení delece 13q. Přes nesporný význam delecí 17p a mutací v genu TP53 dosud publikovaná data neukazují jejich asociaci s metylačními skupinami, což je dáno nízkou čestností defektů TP53 v testovaných kohortách [13, 14], a proto bude nutné tuto souvislost objasnit v budoucích studiích. Na obrázku 2 je schematicky znázorněn vztah jednotlivých skupin k přirozeným vývojovým stadiím B lymfocytu, úrovni celkové metylace, procentu IGHV identity a dalším faktorům.

Existence tří metylačně odlišných prognostických skupin u CLL asociovaných k vývojovým stadiím zrání B lymfocytu byla nezávisle pozorována také dalšími autory [12], kteří analyzovali metylace spojené s procesem zrání B lymfocytu v místech vazby transkripčních faktorů. V průběhu zrání B lymfocytu dochází zejména k hypometylaci vazebných motivů a pouze lokální hypermetylaci CpG v transkripčně elongačních místech. Metylace vazebných míst pro transkripční faktory AP-1, EBF1 a RUNX3 spolu s profily hypermetylovaných CpG v transkripčně elongačních místech umožnily stratifikaci pacientů do tří prognostických skupin odpovídajících n-CLL, i-CLL a m-CLL [12, 14].

Mezi geny, které se významně liší v metylaci a zároveň v genové expresi u pacientů s mutovaným a nemutovaným IGHV, patří k nejvýznamnějším ZAP-70, PAX9 a CRY1 [13, 17, 18]. U těchto genů byla také potvrzena negativní korelace mezi hladinou metylace a genovou expresí.

Přibližně polovina míst aberantně metylovaných u CLL leží v nekódujících oblastech [19]. Subhash et al. detekovali dvě dlouhé nekódující RNA (lncRNA) s odlišně metylovanými promotory ve srovnání s kontrolními vzorky. Exprese těchto dvou lncRNA korelovala s expresí genů GDF7 a IRX5 zapojených do procesů podporujících nádorové bujení. Podobně jako u jiných malignit autoři zjistili výraznou hypometylaci v oblasti repetitivních elementů, která vede k nestabilitě genomu a umožňuje kumulaci genových mutací [11, 19].

Z hlediska stanovení prognózy CLL pacientů je důležité, že se metylační stav CLL při raných fázích nemoci a během jejího dalšího vývoje téměř nemění [12, 14, 20, 21]. Je také celkově stabilní i při srovnání hladin metylací u CLL pacientů před terapií a po ní [14]. Díky své stabilitě v čase a signifikanci, s jakou odlišuje pacienty s indolentní a agresivní formou nemoci, se stává dalším nástrojem umožňujícím stratifikaci CLL pacientů.

ZÁVĚR

Metylace DNA jsou epigenetickou modifikací, která významně ovlivňuje přirozený proces zrání B lymfocytu [12]. Při vývoji z naivního B lymfocytu k paměťové buňce dochází k celkové demetylaci. Při měření metylačního profilu CLL buněk se zjistilo, že metylační status CLL se konzervuje při raných fázích nemoci a během dalšího vývoje CLL se již téměř nemění. Byly publikovány různé studie, které se zaměřují na prognostický význam metylačních změn u CLL pacientů. Na základě postupu založeného na zhodnocení metylačního profilu výše uvedených pěti CpG míst lze CLL pacienty rozdělit do tří skupin s různou prognózou [14]. Dvě z těchto tří skupin vykazují významnou metylační podobnost s přirozenými vývojovými stadii B lymfocytu. Toto rozdělení není ovlivněno terapií a zároveň lépe koreluje s časem do první terapie než mutační status IGHV. Z hlediska klinické aplikace se tento postup do budoucna jeví jako využitelný při určování prognózy pacientů s CLL.

Seznam zkratek

• CLL –  chronická lymfocytární leukemie
• CpG –  cytosin-fosfát-guanin
• i-CLL –  intermediateCLL
• IGHV –  variabilní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu
• lncRNA –  dlouhé nekódující RNA
• m-CLL –  memory B-cell-likeCLL
• n-CLL –  naive B-cell-likeCLL
• OS –  celkové přežití
• TTFT –  čas do první terapie

Podíl autorů na přípravě rukopisu

LP  –  hlavní autor práce

KP  –  spoluautor práce

ŠP  –  korespondující autor, spoluautor práce

Čestné prohlášení autorů

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů, a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Poděkování

Tato práce vznikla v rámci projektu CEITEC 2020 (LQ1601) za finančního přispění Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy české republiky v rámci účelové podpory z prostředků Národního programu udržitelnosti II.

Doručeno do redakce dne 8. 9. 2017.

Přijato po recenzi dne 25. 9. 2017.

prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský technologický institut

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: pospisilova.sarka@fnbrno.cz