Molekulární testování nádorů gastrointestinálního traktu – současný stav a výhled do budoucnosti

Souhrn

U nádorů gastrointestinálního traktu dnes vedle stanovení histologické diagnózy, grade a stage hraje zásadní roli rovněž tzv. prediktivní testování. To slouží zejména k identifikaci molekulárních cílů pro moderní onkologickou terapii. U karcinomů jícnu a žaludku je dnes standardem vyšetření exprese a amplifikace HER2, exprese proteinů mismatch repair (MMR) systému a vyšetření exprese PD-L1. U karcinomu žaludku se v blízké budoucnosti testování rozšíří o další markery, zejména exprese claudinu 18.2 či receptoru FGFR2a. U kolorektálního karcinomu je standardem prediktivního vyšetření stanovení mutací RAS (KRAS a NRAS), BRAF a dále zhodnocení mikrosatelitní instability, jen vzácně lze nalézt rovněž terapeuticky cílitelné genové fúze. U karcinomu pan­kreatu se lze setkat s případy deficience MMR, mutacemi BRCA1/2, zcela raritně lze identifikovat další cílitelné aberace. U nádorů žlučníku a žlučových cest hledáme zejména mutace IDH1 a IDH2, fúze a mutace genu FGFR2, amplifikace či mutace HER2, mutace BRAF či mutace BRCA1/2. Všechny výsledky by měly být projednány v rámci molekulárního tumor boardu.

Klíčová slova:

cílená léčba – imunoterapie – prediktivní biomarkery – gastrointestinální tumory – next generation sequencing – ­řídicí mutace

Úvod

Vedle stanovení histologické diagnózy, morfologické typizace nádoru, stanovení grade a stage metodou TNM začala v poslední dekádě hrát zásadní roli rovněž molekulárně genetická vyšetření nádorové tkáně, která se stala nedílnou součástí komplexního histopatologického reportu u významné části nově diagnostikovaných solidních maligních nádorů [1].

 

Jaké jsou důvody pro provádění molekulární charakterizace nádorů?

Existují přinejmenším tři důvody, proč se snažit o molekulární charakterizaci nádorů. Prvním z nich je lepší pochopení biologie nádorového onemocnění, jeho etiopatogeneze, molekulárních procesů řídících nádorové buňky, kterých lze následně využít pro identifikaci jejich slabých míst, ­využitelných při cílené protinádorové léčbě. Druhým důvodem je využití v oblasti studia epidemiologie některých typů nádorů – typickým příkladem mohou být dlaždicobuněčné karcinomy vznikající v důsledku infekce vysoce rizikovými HPV, nádory vznikající v souvislosti s infekcí virem Epsteina-Barrové (EBV) či některé hereditárně podmíněné nádory, jako např. kolorektální karcinom u Lynchova syndromu. Třetím, a v dnešní době jistě nejdůležitějším důvodem pro molekulární charakterizaci nádorů, je identifikace specifických molekulárních cílů vedoucích k volbě optimální, maximálně individualizované a na míru šité terapie [2–6].

 

Molekulární klasifikace nádorů

V současné době je snaha o vytvoření molekulárních podskupin nádorů jednotlivých orgánových systémů víceméně akademickým cvičením bez jednoznačného klinického dopadu. Příkladem takové molekulární klasifikace mohou být např. molekulární subtypy karcinomu žaludku (MSI, GS, CIN, EBV) nebo konsenzuální molekulární subtypy kolorektálního karcinomu (CMS 1–CMS 4). Přestože v současné době nelze využít toto rozřazení pro volbu optimální terapie pro jednotlivého konkrétního pacienta, umožní nám molekulární klasifikace lepší pochopení biologie nádorů s možností využití v budoucnosti [3,7–9].

 

Identifikace prediktivních molekulárních biomarkerů

Publikovaná data jednoznačně ukazují, jak dramaticky se v posledních dvou dekádách změnila problematika molekulárního testování nádorů [6]. Je evidentní, že došlo k naprosto nevídanému nárůstu molekulárního testování, a to zejména ze dvou důvodů. V první řadě každým rokem narůstá množství diagnóz, resp. jednotlivých typů zhoubných novotvarů, kde informace o molekulárním profilu přímo ovlivňuje rozhodování o léčbě [1,5,6]. V neposlední řadě však také narostl počet jednotlivých řídicích genomických alterací, proti nimž je v současné době dostupná cílená terapie. Kombinace obojího, tj. rozšiřující se spektrum diagnóz a narůstající množství molekulárních markerů, vedlo k masivnímu nárůstu počtu nádorových vzorků, které jsou v současné době za prediktivním účelem v laboratořích patologie vyšetřovány [6]. Patolog tak nyní zaujímá zásadní místo ve struktuře multidisciplinárního týmu, který společně rozhoduje o volbě optimální terapie onkologických pacientů. V následujícím textu budou přehledně diskutovány nádory jednotlivých etáží gastrointestinálního traktu (GIT) se zaměřením na molekulární markery specifické pro danou oblast či diagnózu [1,5].

 

Karcinom jícnu

V jícnu se setkáváme se dvěma histologickými typy karcinomů. V horních zhruba dvou třetinách délky dominuje karcinom dlaždicobuněčný, zatímco spodní třetinu postihují převážně adenokarcinomy. U jednotlivých histologických typů lze identifikovat odlišné etiopatogenetické faktory – zatímco při vzniku dlaždicobuněčného karcinomu hraje hlavní roli alkohol a kouření, v menší míře pak i chronické termické poškození horkými nápoji, u adenokarcinomu distální třetiny má největší význam gastroezofageální reflux a s ním spojené zánětlivě reparativní procesy, které vyústí v kolumnární metaplazii, nejprve kardiální, později i intestinální (Barrettův jícen) a následně dysplazii, která je již premaligní lézí [10–13]. Pokud jde o molekulární markery, nehrají u dlaždicobuněčného karcinomu prakticky žádnou roli, a prediktivní molekulárně genetické testování se tak u tohoto typu nádoru nevyužívá [12,13]. Naproti tomu adenokarcinom distálního jícnu vykazuje velmi podobné molekulární charakteristiky jako intestinální typ adenokarcinomu žaludku a gastroezofageální junkce (GEJ). Vyšetřujeme zde tedy zejména expresi a amplifikaci Her-2/neu (HER2) jako prediktor pro cílenou anti-HER2 terapii a stav mismatch repair (MMR) systému, resp. mikrosatelitní instabilitu (MSI) pro predikci odpovědi na imunoterapii checkpoint inhibitory [14–19]. To, že adenokarcinom jícnu se do určité míry liší od adenokarcinomu GEJ, podporuje např. skutečnost, že zastoupení HER2 pozitivních karcinomů jícnu je zhruba dvojnásobné oproti GEJ [10].

U obou histologických typů karcinomu jícnu se rovněž využívá vyšetření exprese PD-L1 pro indikaci imunoterapie [15,18]. Vyšetření se provádí stejným kitem (22C3), hodnocení se však liší podle histologické diagnózy. Zatímco u dlaždicobuněčného karcinomu hodnotíme metodou TPS (tumor proportion score) procento nádorových buněk s membránovou expresí PD-L1, u adenokarcinomu se využívá hodnocení metodou CPS (combined positivity score – exprese PD-L1 jak v nádorových buňkách, tak ve stromálních imunitních elementech) [12,13,20].

 

Karcinom žaludku

Spektrum prediktivních vyšetření u karcinomu žaludku je do značné míry podobné jako u adenokarcinomu jícnu [2,7,12,18,21,22]. V praxi se tedy setkáváme zejména se žádostmi o vyšetření stavu HER2, MMR a PD-L1. Vyšetření HER2 se provádí podobně, jako je tomu u karcinomu prsu, tedy pomocí imunohistochemie, která je u případů hodnocených jako 3+ nebo 2+ následně doplněna in situ hybridizací (rozdíl proti vyšetření u karcinomu prsu spočívá v tom, že je nutné in situ hybridizací ověřit i případy 3+, které jsou u karcinomu prsu považovány za finálně pozitivní). Jen nádory, které jsou imunohistochemicky pozitivní a vykazují současně amplifikaci genu, jsou klasifikovány jako HER2 pozitivní a lze u nich indikovat anti-HER2 léčbu. Na rozdíl od karcinomu prsu, kde většina HER2 pozitivních případů vykazuje homogenní expresi proteinu napříč všemi nádorovými buňkami, je u karcinomu žaludku známa heterogenita exprese a také odlišný typ membránové pozitivity. Tato skutečnost vedla k zavedení odlišných hodnoticích kritérií ve srovnání s karcinomem prsu [14,17,23–26].

Pro vyšetření stavu MMR je využívána imunohistochemie i molekulárně genetické testování, výsledek je v naprosté většině případů konkordantní [27]. V případě identifikace nádoru s deficitním MMR je namístě doporučení k následnému vyšetření klinickým genetikem, tak aby byla vyloučena možnost Lynchova syndromu [19,28,29].

U případů, kde neprokážeme pozitivitu HER2, deficitní stav MMR ani zvýšenou expresi PD-L1, přichází v úvahu rovněž komplexní genomické vyšetření vzorku nádorové tkáně pomocí sekvenování nové generace (next generation sequencing – NGS) [2,21,22,30]. To může identifikovat celou řadu sice vzácných, avšak potenciálně cílitelných genomických aberací (mutací či genových fúzí). Vyšetření metodou NGS musí být vždy indikováno multidisciplinárním týmem.

V blízké budoucnosti lze očekávat rozšíření testování karcinomů žaludku o další prediktivní markery, jako je např. exprese claudinu 18.2 či exprese receptoru FGFR2b [22,31,32]. V obou případech půjde o imunohistochemické vyšetření ze stejného vzorku nádorové tkáně, ze kterého jsou testovány již v současnosti vyšetřované markery. Půjde proto „pouze“ o navýšení počtu imunohistochemických vyšetření v síti stejných referenčních laboratoří, které již nyní zajišťují vyšetření stávající.

 

Kolorektální karcinom

Termín kolorektální karcinom (colorectal cancer – CRC) je do značné míry zavádějící, neboť nádory vyskytující se v různých etážích tlustého střeva se poměrně zásadně liší svou morfologií, klinickými projevy, molekulárním profilem i biologickým chováním [33–36]. Nakolik jsou tyto rozdíly dány odlišností embryonálního původu různých částí tlustého střeva, nakolik jsou modifikovány různým působením kancerogenů a do jaké míry rozdílným profilem mikrobioty v různých etážích tlustého střeva, zůstává předmětem výzkumu [33,34,37]. Schematicky lze však udělat poměrně ostrou čáru mezi karcinomem pravostranným a levostranným. Celá řada klinických studií dokázala různý efekt jednotlivých typů systémové léčby u těchto dvou topografických kategorií CRC [38]. Z hlediska molekulárního testování však ke všem CRC přistupujeme stejně, byť lze u nádorů z různých etáží tlustého střeva předpokládat výskyt jednotlivých molekulárních alterací v různé frekvenci [3,34]. U nádorů pravostranných je tak vyšší pravděpodobnost výskytu mutací BRAF a nádorů s MSI. U nádorů levostranných je naopak vyšší zastoupení nádorů s mutacemi RAS a nádorů mikrosatelitově stabilních (MSS) [34,35].

Naprostým standardem prediktivního vyšetření metastatického karcinomu tlustého střeva je v současné době stanovení mutací v genech RAS (KRAS a NRAS), genu BRAF a dále zhodnocení mikrosatelitní instability [3,4]. Detekce mutací RAS a BRAF se provádí pomocí PCR technik, klasickým Sangerovým sekvenováním, případně (spolu s vyšetřením dalších genů) v rámci testování NGS. Testování MSI lze provést rovněž PCR technikami, častěji je však prováděno vyšetření proteinů MMR imunohistochemicky. Vyšetřujeme celkem čtyři proteiny – MLH1, MSH2, MSH6 a PMS2 [27].

Zatímco stanovení mutací RAS a BRAF má význam výhradně prediktivní pro volbu systémové cílené léčby anti-EGFR protilátkami, vyšetření MMR/MSI slouží nejen jako prediktor pro indikaci imunoterapie, ale také jako první krok pro identifikaci nádorů, které mohly potenciálně vzniknout v kontextu Lynchova syndromu [9,39]. Proto u každého nádoru, kde identifikujeme deficitní stav MMR, je nezbytné následné dovyšetření příčiny deficience tohoto systému. Zhruba polovina případů CRC s deficientním MMR vzniká sporadicky a porucha MMR jde v naprosté většině případů na vrub hypermetylace promotoru MLH1. Takové nádory se vyskytují u starších pacientů a deficit MMR je často doprovázen současnou mutací BRAF. Ta se naopak prakticky nikdy nevyskytuje u nemocných s Lynchovým syndromem (tedy s germinální mutací jednoho z genů MMR systému). Pokud u nádorů, kdy je imunohistochemicky detekována ztráta proteinu MLH1, případně PMS2, laboratoř vyloučí deficit MMR vzniklý v souvislosti s hypermetylací promotoru MLH1, je nezbytné upozornit onkologa na možnou souvislost s Lynchovým syndromem, kterou lze potvrdit či vyloučit pouze následným vyšetřením klinickým genetikem.

Vzácnou podskupinou CRC jsou nádory, které vznikají v souvislosti s různými genovými fúzemi [40]. Tyto případy byly popsány již v 80. letech minulého století, kdy byl publikován první případ nádoru s fúzí genu NTRK. Do dneška bylo v literatuře publikováno zhruba 80 různých fúzních partnerů genu NTRK. Fúze zahrnují i další geny, zejména ALK, ROS1, RET, BRAF, FGFR, ERBB2 a NRG1. Jednotlivé fúze jsou velmi vzácné, žádná z nich se nevyskytuje častěji než v 0,1 % případů neselektovaných CRC. Všechny fúze kombinovaně dohromady tvoří méně než 1 % pacientů s CRC. Jediným ekonomicky smysluplným způsobem, jak všechny potenciální vzácné fúze vyšetřit, je provedení NGS testováním RNA, kdy v rámci jednoho testu dokážeme vyšetřit všechny tyto fúze najednou. I tak má smysl testovat pouze ty nádory, u kterých byly předtím vyloučeny v rámci standardního prediktivního testování všechny další možné genomické aberace (KRAS, NRAS, BRAF). Výskyt genových fúzí je výrazně vyšší u nádorů s MSI. Když byla vyšetřována pouze „molekulárně obohacená“ kohorta nemocných s nádory MSI a současným wild-type stavem KRAS, NRAS a BRAF, dosáhla pravděpodobnost identifikace pozitivní genové fúze až 26 % [40].

Pro CRC s mutací KRAS není možné použít anti-EGFR léčbu, avšak u malé podskupiny z nich, konkrétně u nádorů s mutací KRAS G12C, se do budoucna rýsuje naděje na užití specifických KRAS inhibitorů, jako jsou adagrasib či sotorasib. Ty jsou již v současnosti úspěšně využívány u nemalobuněčného karcinomu plic nesoucího tuto konkrétní mutaci. Bohužel, zatímco u plicních nádorů tvoří mutace G12C asi 40 % všech KRAS mutací, u CRC je to pouze 5 %, a u karcinomu pankreatu (viz níže), kde mutace KRAS dominují, je zastoupení G12C zcela minoritní.

 

Karcinom pankreatu

Karcinomy exokrinního pankreatu se významně liší od všech dalších malignit GIT v několika ohledech. Jedná se o diagnózu s (přinejmenším v České republice) nejvyšším nárůstem incidence, který zatím nejeví známky zpomalení. Rovněž výrazně odlišné mikroprostředí tohoto nádoru s přítomností hypocelulárního fibrózního stromatu chudého na elementy imunitního systému a bohatého na mezibuněčnou matrix podstatně modifikuje biologické vlastnosti nádorových buněk [41]. Jakákoliv systémová léčba dosahuje k buňkám nádoru jen velmi obtížně. To je jedním z důvodů, proč jsou výsledky systémové terapie u karcinomu pankreatu doposud jen velmi málo uspokojivé. Druhou odlišností u karcinomu pankreatu je poměrně homogenní zastoupení mikroskopických i molekulárních subtypů [8,42]. Naprosto dominantním histologickým typem je pankreatický duktální adenokarcinom (pancreatic ductal adenocarcinoma – PDAC), který reprezentuje více než 90 % všech malignit exokrinní slinivky. Jen malé procento nádorů má mucinózní charakter a vzniká zejména v terénu prekurzorových lézí, jako je intraduktální papilární mucinózní neoplazie a mucinózní cystická neoplazie. Z molekulárního hlediska je naprostá většina karcinomů pankreatu sdružena s aktivačními mutacemi genu KRAS, které lze identifikovat u více než 90 % všech případů. Vzácně se však lze i u nádorů slinivky setkat s případy potenciálně vhodnými pro cílenou léčbu, a proto má význam snažit se tyto vzácné výjimky z pravidla hledat [8,42–44]. Lze se zde setkat s případy deficience MMR, případy s mutacemi genu BRCA1 či (častěji) BRCA2, případně dalšími geny zodpovědnými za homologní rekombinaci DNA [44]. Zcela raritně lze identifikovat i další potenciálně terapeuticky cílitelné mutace. Vzhledem k nízkému zastoupení jednotlivých mutací je jedinou smysluplnou metodou pro jejich identifikaci testování NGS [8,42]. Hlavní výzvou při molekulárním testování vzorků karcinomu slinivky je zejména velmi malé množství tkáně, které je dostupné z bioptických odběrů (zpravidla jehlových biopsií). Tato limitace je ještě násobena skutečností, že často tvoří valnou většinu bioptického vzorku pouze nenádorové stroma a neoplastických elementů je zde zcela minimální množství. To je důvodem, proč je vzorek karcinomu pankreatu pro vyšetření metodou NGS poměrně často nevýtěžný.

 

Nádory žlučníku a žlučových cest

Karcinom žlučníku a karcinom žlučových cest (cholangiokarcinom) jsou si histologicky velmi podobné, jedná se v naprosté většině případů o adenokarcinomy. Cholangiokarcinom rozdělujeme dle místa vzniku na intrahepatální, který vychází z intrahepatálních žlučovodů – představuje asi ­10–20 % cholangiokarcinomů, a extrahepatální, vyskytující se zejména v oblasti junkce hepatiků (Klatskinův tumor – 50–60 % cholangiokarcinomů) a v oblasti choledochu a Vaterské papily (20–30 %) [45]. Z hlediska biologického i terapeutického je důležité, že intra- a extrahepatální cholangiokarcinomy se ve svém molekulárním profilu zásadně liší.

Většina terapeuticky cílitelných genomických aberací se vyskytuje v karcinomech intrahepatálních. Jedná se zejména o mutace genů IDH1 a IDH2, fúze a mutace genu FGFR2, amplifikace či mutace ERBB2, mutace BRAF či mutace BRCA1/2. Zdaleka nejvíc prozkoumané a terapeuticky ověřené jsou fúze FGFR2 a mutace IDH1, které dohromady představují téměř 30–40 % všech případů.

Další terapeuticky využitelné cíle, jako jsou mutace PALB2, KRAS G12C, fúze NTRK či deficience MMR jsou velmi vzácné – každá z nich se vyskytuje v méně než 1 % případů. Sečteme-li však všechny potenciálně využitelné mutace dohromady, lze u téměř poloviny všech případů cholangiokarcinomů identifikovat genomickou aberaci vhodnou pro cílenou léčbu [45,46]. Z logiky věci vyplývá, že jediným způsobem, jak identifikovat takto široké spektrum mutací ve velmi limitovaných vzorcích tkáně z bioptického odběru, je využití sekvenování NGS, a to jak DNA, tak RNA.

 

Nádorová mutační nálož – univerzální prediktivní marker pro imunoterapii?

Před několika lety se začala ve velké míře diskutovat problematika nádorové mutační nálože (tumor mutation burden – TMB). Jedná se o přítomnost takzvaných pasažérských mutací, které nemají přímý vliv na proliferaci nádorové buňky, nelze je cílit specifickou léčbou, část z nich však může vést ke vzniku patologicky konformovaných proteinů, které mohou být imunitnímu systému prezentovány jako tzv. neoantigeny. Čím vyšší je množství těchto pasažérských mutací zjištěných při NGS vyšetření, tím vyšší je TMB a s ní také narůstá antigenicita nádorových buněk. V některých studiích byla TMB prokázána jako prediktor imunoterapie, zejména anti-PD-1 protilátkami (pembrolizumab, nivolumab). U některých nádorů proto dává smysl detekovat TMB (udávanou jako počet mutací na megabázi), protože u nádorů s vysokou TMB lze zvažovat imunoterapii. V této oblasti však existuje ještě celá řada nezodpovězených otázek, zejména proč je TMB úspěšným prediktorem pouze v některých studiích, jaká hranice (cut-off hodnota) TMB je nejvhodnější pro optimální selekci nemocných, případně jaká je mezilaboratorní shoda při užití různých metod stanovení TMB. Do budoucna lze tedy očekávat, že testování TMB bude standardní součástí komplexního genomického vyšetření metodou NGS. Ve kterých konkrétních situacích však bude tento biomarker využíván v klinické praxi, je stále otázkou.

 

Závěr

Nádory GIT tvoří nejenom velmi široké spektrum histologických diagnóz, ale v rámci jednotlivých orgánů se vyskytuje ještě daleko širší spektrum jednotlivých molekulárních subtypů, přičemž u významné části z nich lze řídicí mutace či genové fúze využít jako potenciální terč cílené léčby. Pro správnou indikaci molekulárního vyšetření je nezbytná nejen znalost biologie jednotlivých nádorů, ale rovněž zohlednění komorbidit, stavu výkonnosti pacienta a dalších faktorů. Proto je správné, když o indikaci molekulárního vyšetření vždy rozhoduje multidisciplinární tým, ve kterém jsou zastoupeny všechny relevantní odbornosti [1].

Všechna prediktivní vyšetření jsou v České republice prováděna v síti takzvaných referenčních laboratoří a jsou hrazena z veřejného zdravotního pojištění. U nádorů GIT jsou všechna vyšetření prediktivních markerů prováděna výhradně na vyžádání onkologem (on demand), pro indikaci komplexního genomického profilování pomocí NGS je pak nezbytná indikace multidisciplinárním týmem. Výsledky vyšetření NGS by měly být projednány v rámci molekulárního tumor boardu – jedině tak lze zajistit optimální interpretaci často velmi komplexního výsledku sekvenování desítek či stovek různých genů v rámci jednoho NGS vyšetření. Výsle­dek molekulárního testování by měl být vždy součástí komplexního histologického výsledku, neboť správná interpretace molekulárního testu je možná pouze v kontextu morfologie daného nádoru. I proto hrají (a i v budoucnosti nepochybně budou hrát) patologové zásadní roli ve fungování multidisciplinárních týmů a molekulárních tumor boardů pečujících o onkologicky nemocné. Přes ohromný přínos NGS i do budoucna zůstane určité procento prediktivních biomarkerů, které nebudou vyšetřovány molekulárně geneticky, ale i nadále je budeme testovat pomocí imunohistochemie. Půjde nejen o již etablovanou expresi PD-L1, ale rovněž i o nové markery sloužící jako prediktory pro využití léčby konjugáty protilátek s cytotoxickými jedy. Do této skupiny budou pravděpodobně patřit např. HER2, HER3, TROP2, CEACAM5 či c-MET. O jejich uplatnění v reálné klinické praxi a případném rutinním vyšetřování však teprve rozhodnou výsledky probíhajících klinických studií.

 

Dedikace

Podpořeno projekty BBMRI-CZ LM2023033, BBMRI-CZ: Síť biobank – univerzální platforma k výzkumu etiopatogeneze chorob, reg. č.: EF16_013/0001674 a programem Cooperatio, vědní oblasti DIAG.

 

Konflikt zájmů

Autor článku prohlašuje, že není v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise, s výjimkou kongresových abstrakt a doporučených postupů.