¹³C-methacetinový dechový test u pacientů s jaterní cirhózou a dekompenzovaným srdečním selháním

Souhrn

Ve své práci jsme představili nový neinvazivní diagnostický přístroj IRIS (Wagner Analysen Technik, Německo), využívající princip infračervené nedisperzní spektroskopie, pomocí které měří ve vydechovaném vzduchu pacientů množství stabilního izotopu ¹³C. Naměřené hodnoty slouží pro kvantifikaci parametrů jaterní funkce, a to kinetiky, která definuje typ jaterního poškození a také kapacity jater, která udává procento zpětné výtěžnosti. V článku je krátce popsán fyzikální princip infračervené spektroskopie a akusto-optického detektoru, který diagnostický přístroj IRIS využívá. V závěrečné části jsme na studii 103 pacientů, rozdělených do 3 skupin (podle diagnózy a podle očekávaného různého stupně poškození jater) pomocí analýzy rozptylu a ROC analýzy ověřili diagnostickou kvalitu tohoto přístroje.

Klíčová slova:
¹³C-methacetin, dávka, kumulovaná dávka, infračervená spektroskopie, transmitance, absorbance, cirhóza

Úvod

Vyšetření jaterních funkcí se provádí za účelem posoudit funkční rezervu jater (např. před transplantací jater), určit prognózu pacienta, nebo posoudit účinek léčby. V játrech probíhají základní metabolické, regulační a jiné funkce, které můžeme hodnotit řadou testů. Těmi nejvíce používanými jsou rutinní biochemické tzv. jaterní testy. Žádný z těchto testů však není schopen kvantifikovat celkovou jaterní kapacitu. Také kdysi velmi rozšířené chromoexkreční zkoušky např. s bromsulfoftaleinem nebo tzv. galaktózový eliminační test byly postupně opuštěny a nahrazeny metabolickými testy s použitím radioaktivních izotopů, které ovšem měly také svá významná omezení.

Poslední slovo v kvantifikaci jaterních funkcí patří látkám značeným izotopem ¹³C, který se vyskytuje v přírodě, neemituje ionizující záření a je tedy zcela bezpečný. Princip testování je jednoduchý – proband požije vhodnou látku označenou uhlíkem ¹³C, např. methacetin. Ten je metabolizován v játrech až na oxid uhličitý a množství ¹³CO₂ ve vydechovaném vzduchu je mírou intenzity jaterního metabolismu. Výsledky testu velmi dobře korelují např. s funkční klasifikací jaterní cirhózy podle Childa a Pugha, na rozdíl od ní je však test dobře použitelný pro sledování změn v celém rozsahu jaterních funkcí [1]. Pro stanovení ¹³CO₂ ve vydechovaném vzduchu se užívá infračervená izotopová spektroskopie. Sami již několik let používáme na našem pracovišti přístroj IRIS (Nondispersive InfraRed Isotope-selective Spectroscopy) od firmy Wagner Analysen Technik, Německo [2].

IRIS je dodáván spolu se softwarem, který je schopen rozlišit: játra zdravá (normal); stimulovanou jaterní funkci (stimulated) – metabolizmus jater je velmi rychlý, stimulovaný neustálým odbouráváním jedovatých látek (alkoholu, hepatotoxických léků apod.); jaterní cirhózu (cirrhosis) – metabolizmus jater je velmi poškozen. Průběh měřených veličin – % ¹³C dávky/hod a % C¹³ kumulované dávky ve vydechovaném vzorku pro tyto tři případy spolu s referenčním rozmezím, určujícím pásmo, ve kterém se pohybuje normální jaterní funkce, vidíme na obrázcích 1 a 2 [1].

Test s ¹³C methacetinem je schopen rozlišit mezi zdravými, stimulovanými a cirhotickými játry. Pokusili jsme se zjistit, zda existuje statisticky významný rozdíl v naměřených hodnotách dávky a kumulované dávky ¹³C methacetinu diagnostickým přístrojem IRIS také u pacientů s poškozením jater jiné etiologie, a to konkrétně u pacientů s dekompenzovaným srdečním selháním. Provedli jsme měření a porovnání jaterních dechových testů mezi 3 skupinami pacientů, rozděle-nými podle diagnózy, a to ve všech časových inter-valech. Cílem studie bylo také určit, ve kterém časovém intervalu je tento rozdíl největší, čili který časový okamžik má největší rozlišovací sílu. Diagnostickou schopnost přístroje IRIS jsme porovnali s diagnostickou schopností běžných jaterních testů a také s APRI skóre a s AST/ALT poměrem.

Základní fyzikálně-chemické principy

Uhlík ¹³C

Uhlík ¹³C se běžně vyskytuje v přírodě a v lidském organizmu představuje za normálních okolností 1,1 % z celkového obsahu uhlíku. Je metabolizován stejně jako rozšířenější uhlík ¹²C, je netoxický, neradioaktivní a je stabilním izotopem, proto je vhodný k využití v diagnostice [1].

Methacetin označený ¹³C je metabolizován v jaterním smíšeném oxidázovém systému, a to exkluzivně s použitím podskupiny cytochromu P450 CYP1A2 demethylací/dekarboxylací na acetaminophen a CO₂. Vzniklý oxid uhličitý je rychle absorbován a dostává se do krve, z ní krevním řečištěm do plic, kde je vydýchán. Použití ¹³C značeného methacetinu umožňu-je pomocí poměru ¹³CO₂/¹²CO₂ ve vydechovaném vzduchu kvantifikovat parametry jaterní funkce, a to kinetiku (% ¹³C dávky/hod), která definuje typ jaterního poškození a kapacitu (% ¹³C kumulované dávky), která udává procento zpětné výtěžnosti. Protože cytochrom CYP1A2 je aktivní při metabo-lizmu alkoholu, je také alkoholem poškozován a stimulován, poskytuje ¹³C-methacetin dechový test velmi dobré výsledky při diagnostice jaterních onemocnění způsobených alkoholem [1,2].

¹³C-methacetinový dechový test dále slouží ke stanovení stádia rozvoje NASH (nealkoholická steato-hepatitida, která je charakterizovaná postižením jater, které je morfologicky podobné postižení jater při abúzu alkoholu) nebo ASH (alkoholická steatohepatitida – alkoholické poškození jater), k hodnocení funkčního stavu fibrózy, steatózy či cirhózy, poskytuje informace o funkční rezervě jater při plánování jaterních resekcí a je také vhodným nástrojem pro načasování jaterní transplantace [1,3].

Infračervená spektroskopie

Infračervená spektroskopie je analytická technika určená pro identifikaci a strukturní charakterizaci organických sloučenin a anorganických látek. Její podstatou je interakce měřeného vzorku s infračerveným zářením (elektromagnetickým vlněním v rozsahu vlnových délek kolem 800 nm až 1 mm). Energie fotonů infračerveného záření (1–60 kJ/mol) nepostačuje pro excitaci elektronů v molekulových orbitalech, ale je dostatečná ke změně vibračního či rotačního stavu molekuly. Pokud je změna těchto vibračních a rotačních stavů spojena se změnou dipólových momentů, dochází k absorpci záření charakteristického pro danou vazbu v molekule. Pomocí infračervené spektroskopie sledujeme právě množství pohlceného infračerveného záření v závislosti na vlnové délce, přičemž množství pohlceného záření se vyjadřuje buď v procentech transmitance (% T) nebo jednotkách absorbance (A). Transmitanci definujeme jako poměr intenzit záření prošlého (I) a původního paprsku (I₀) [4]:

Absorbance udává, jaké množství záření bylo pohlceno měřeným vzorkem. Pomocí transmitance ji můžeme definovat jako:

kde c – molární koncentrace, l – délka kyvety, ε – molární absorpční koeficient, který je tabelován.

Tento vztah označujeme také jako Lambertův – Beerův zákon, podle nějž je absorbance přímo úměrná koncentraci absorbující látky [5].

Analytickým výstupem infračervené spektroskopie jsou infračervená spektra, která jsou grafickým zobrazením funkční závislosti absorbované energie, vyjádřené právě transmitancí nebo absorbancí na vlnové délce. Pro jednotlivé látky je infračervené spektrum charakteristické natolik, že prakticky neexistují dvě sloučeniny, které by měly zcela shodné infra-červené spektrum. Příklad typického infračerveného spektra vidíme na obrázku 3.

IRIS používá spolu s nedisperzní infračervenou spektroskopií širokopásmový zdroj záření a akusticko-optický detektor (Luft – Lehrerova typu), který je citlivý pouze na ty vlnové délky, při kterých vyšetřované plyny pohlcují infračervené záření. Dvěma takovými detektory citlivými speciálně na absorpční spektra ¹²CO₂ a ¹³CO₂ se měří koncentrace obou plynů a jejich poměr [2].

Luft – Lehrerův detektor

Základní schéma detektoru je znázorněno na obrázku 4 [6]. Detektor je tvořen uzavřenou komůrkou, ve které se nacházejí molekuly absorbující látky. Pružná membránová deska kondenzátoru rozděluje detektor na zadní část, ve které se nachází pevná deska kondenzátoru a přední, absorpční část, ve které se nachází optické okénko, kterým proniká dovnitř přerušované infračervené záření. Plyn je v důsledku absorpce záření ohříván, dochází k jeho rozpínání a v důsledku deformace membrány – mění se geometrie kondenzátoru – dochází ke změně napětí na deskách kondenzátoru. Membrána osciluje s frekvencí přerušovače a její deformace je nepřímo úměrná koncentraci absorbujících molekul v dechovém vzorku.

Materiály a metody

Pacienti

Studie se zúčastnilo 66 pacientů a 37 zdravých kontrol. Skupinu pacientů s cirhózou (CIRHÓZA) tvořilo 52 pacientů (průměrný věk 59.23 ± 9.87, rozpětí 36–80; poměr ženy/muži (F/M) 26/26; průměrná hodnota Body-Mass-Indexu (BMI) bylo 25.25 ± 6.08. U všech pacientů byla diagnóza potvrzena jaterní biopsií. 2. skupinu tvořilo 14 pacientů s dekompenzovaným srdečním selháním (chronic heart failure (ACHF)) s ejekcí levé komory LVEF ≤ 45%, NYHA III – IV (průměrný věk 77.21 ± 14.08, rozpětí 44–90; F/M poměr 4/10; průměrná hodnota BMI 26.13 ± 4.57). Kontrolní skupinu (KONTROLY) tvořilo 37 zdravých dobrovolníků (průměrný věk 66.81 ± 12.6, rozpětí 38–9; F/M poměr 15/22; BMI 27.27 ± 4.11). Všichni pacienti i zdravé kontroly podstoupili ultrazvukové vyšetření a rutinní biochemické testy. Všichni zdraví jedinci měli testy v rozmezí normálních hodnot, u žádného z nich nebylo zjištěno jaterní nebo závažné kardiovaskulární onemocnění, nebo abusus alkoholu. Všichni pacienti i zdravé kontroly byli vyšetření na I. interní klinice Fakultní nemocnice Královské vino-hrady, 3. lékařské fakulty Karlovy univerzity v Praze. Všichni účastníci studie podepsali informovaný sou-hlas. Studie byla odsouhlasená etickou komisí 3. lékařské fakulty Karlovy univerzity v Praze.

APRI skóre

APRI skóre jsme v naší studii použili k posouzení stupně jaterního poškození, přestože je hlavně používán k posouzení stupně jaterní fibrózy. Tento test se počítá ze snadno dostupných laboratorních parametrů a jeho diagnostická přesnost pro určení stupně fibrózy i cirhózy byla potvrzena v mnoha studiích [7, 8].

¹³C-methacetin jaterní dechový test

Pacienti před začátkem vyšetření přicházejí na lačno a před vypitím testovacího nápoje vydechnou do prvního dechového sáčku. Současně vypijí testovací nápoj (75 mg ¹³C methacetinu rozpuštěného v 200 ml neslazeného čaje nebo vody) a postupně vydechují v intervalech 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100 a 120 minut do dalších dechových sáčků.

Výsledky získané z přístroje IRIS byly vyjádřeny jako dávka (PDR) ¹³CO₂/h (procento dávky izotopu uhlíku ¹³C získaného z vydýchaného vzduchu za hodinu), a kumulativní dávka (CPDR) procento ¹³C zjištěného ve vydýchaném vzduchu v průběhu vy-šetření (¹³C kumulativní dávka). V den vyšetření pomocí přístroje IRIS byly u všech pacientů změřeny rutinní jaterní testy včetně celkového bilirubinu (BILI), aspartát-aminotransferázy (AST), alaninaminotran-sferázy (ALT) a všichni pacienti také podstoupili ultrasonografické vyšetření břicha. Pacienti s de-kompenzovaným srdečným selháním podstoupili echokardiografické vyšetření pomocí přístroje Ultramark 7 [9, 10]. Průměry srdečních komor a předsíní byly měřeny pomocí dvourozměrné echokardiografie, ejekční frakce levé komory (EF) byla spočtena pomocí metody uvedené ve studii [11]. Skóre APRI a poměr AST/ALT byl spočten pro všechny pacienty a zdravé kontroly.

Statistická analýza

K nalezení statisticky významných rozdílů sledova-ných veličin mezi všemi skupinami jsme použili analýzu rozptylu s jednoduchým tříděním ANOVA s následným Bonferroniho testem pro mnohonásobné porovnávání. K určení diagnostické schopnosti jsme použili ROC analýzu. K porovnání diagnostické síly všech výše uvedených testů jsme použili také ROC analýzu, a to metodu to Z-kritérium podle Hanleyho a McNeila [12]. Ke statistické analýze jsme použili statistický program STATISTICA verze 9 firmy StatSoft Inc a IBM SPSS Statistics verze 20. Jako statisticky významnou jsme uvažovali hodnotu p < 0,05.

Výsledky

V tabulce 1 jsou uvedeny průměrné hodnoty a smě-rodatné odchylky biochemických jaterních testů. APRI skóre a poměru AST/ALT a naměřených dávek a kumulovaných dávek ¹³C methacetinu ve všech časových intervalech pro všechny 3 skupiny pacientů.

ROC analýza – nalezení nejlepšího časového intervalu pro ¹³C-methacetin jaterního dechový test pro diskriminaci mezí 3 skupinami pacientů

Pomocí ROC analýzy (podle velikosti plochy pod ROC křivkou (AUC)) jsme našli časový interval, který má největší rozlišovací schopnost mezi jednotlivými skupinami pacientů. Ve všech případech jsme největší diskriminační schopnost nalezli v 10. až 30. minutě dávky (PDR) dechového testu. Pro kumulovanou dávku byla nalezena největší diskriminační síla při porovnání skupin Kontroly vs. ACHF a Kontroly vs. Cirhóza opět mezi 10. až 20. minutou. Mezi skupinami Cirhóza vs. ACHF jsme nalezli největší rozlišovací schopnost v 60. a 80. minutě. Když použijeme tradiční skórovací systém podle Tapea je rozlišovací schopnost dechových testů následující: DOBRÁ (GOOD, AUC 0,80-0,90) pro skupiny Kontroly vs. Cirhóza a ACHF vs. Cirhóza a SLUŠNÁ (FAIR, AUC 0,70-0,80) pro skupiny Kontroly vs. ACHF. Detailní výsledky vidíme v tabulce 2 (AUC a směrodatná chyba (SE) plochy pod ROC křivkou).

ROC analýza – porovnání diskriminační schopnosti nejlepšího rutinního biochemického testu a nejlepšího časového okamžiku ¹³C-methacetin jaterního dechového testu

Při porovnání diskriminační schopnosti mezi rutinními jaterními testy a ¹³C-Methacetinovým dechovým jater-ním testem jsme nalezli větší diskriminační sílu u jaterních testů a to mezi skupinami Kontroly vs. Cirhóza a Kontroly vs. ACHF. V posledním případe Cirhóza vs. ACHF má největší rozlišovací schopnost celkový bilirubín. V žádném případě jsme nenalezli statisticky významný rozdíl mezi nejlepším rutinním biochemickým testem a jaterním dechovým testem. Detailní výsledky vidíme v tabulce 3.

ANOVA – porovnání všech tří skupin s následným Bonferroniho testem

Při porovnání tří skupin pacientů jsme nalezli statisticky významný rozdíl u APRI skóre u AST/ALT poměru a mezi všemi ostatními biochemickými testy kromě ALT v následujících případech: Kontroly vs. Cirhóza a ACHF vs. Cirhóza. Mezi skupinami Kontroly vs. ACHF neexistuje statisticky významný rozdíl ani v jedné výše uvedené veličině. U ¹³C-methacetin dechové-ho testu jsme nalezli statisticky významný rozdíl ve všech časových intervalech při porovnání Kontroly vs. Cirhózy (p < 0,0001) a také mezi skupinami ACHF vs. Cirhózy (p < 0,01) s nejvyšší rozlišovací schopností ve 20. Minutě PDR p = 0,0009. V posledním případě Kontroly vs. ACHF jsme pozorovali statisticky významný rozdíl pouze ve 20. minutě PDR (p = 0,0259) a ve 20. a 30. minutě CPDR (p = 0,0370 a p = 0,0430). Detailní výsledky jsou uvedeny v tabulce 4 (p-hodnoty Bonferroniho testu).

Na obrázcích 5 a 6 jsou uvedeny grafy průměrů a intervalů spolehlivosti pro naměřenou hodnotu dávky a kumulované dávky ¹³C methacetinu pro všechny 3 skupiny pacientů.

Závěr

Výsledky jednoznačně ukazují, že u pacientů s dekompenzovaným srdečním selháním dochází k rozsáhlému poškození jaterní funkce, blížící se jaterní cirhóze. Výsledky studie jsou v naprosté shodě s očekávanými výsledky a ukazují, že analyzátor IRIS je velmi kvalitním diagnostickým přístrojem, který má vysokou schopnost rozlišení mezi různými stupni jaterního poškození.

Ing. Jana Vránová, CSc.

Ústav lékařské biofyziky a lékařské informatiky

3. lékařská fakulta

Univerzita Karlova v Praze

Ruská 87, CZ-100 00 Praha 10

E-mail: jana.vranova@lf3.cuni.cz

Tel.: +420 267 102 303