Fototoxický vliv porfyrinových sensitizerů a viditelného záření na gram-pozitivní methicilin-rezistentní kmen S. aureus

Souhrn

Použití antimikrobiální fotodynamické terapie (aPDT) jako terapeutické možnosti pro léčbu lokálních mikrobiálních infekcí představuje nově se vyvíjející oblast. Výskyt kmenů rezistentních k antibiotikům poskytuje impuls pro vývoj nových látek nebo technologických objevů k boji proti těmto rezistentním sloučeninám. Jako u PDT jsou hlavními komponentami antimikrobiální fotodynamické terapie světlo vhodné vlnové délky fotosensitivní látka (sensitizer) a vzniklé kyslíkové reaktivní částice. V této práci jsou pro antimikrobiální fotodynamickou terapii zkoumány fotosensitizery TMPyP a ZnTPPS₄. Uvedené porfyriny jsme testovali na bakteriálním methicilin – rezistentním kmenu MRSA samotné i ve vazbě s hp-β-cyklodextrinem. LEDs (414 nm) byly použity intenzity záření 0 a 150 J/cm². Testované koncentrace byly od 0,78 do 100 µM. Touto experimentální prací se dokázalo, že TMPyP je velmi úspěšnou komponentou v aPDT. Naopak ZnTPPS₄ byl účinný pro vyhubení gram-pozitivních bakterií pouze ve vyšších koncentracích.

Klíčová slova:
antimikrobiální fotodynamická terapie, porfyriny, modré světlo, dioda emitující světlo

Úvod

PDT i aPDT využívá schopnosti látky (fotosen-sitizeru) absorbovat viditelné záření o vhodné vlnové délce, což vede k utvoření excitovaného tripletního stavu molekuly fotosensitizeru. Následuje přenos energie na molekulu kyslíku a tvorba reaktivního singletního kyslíku, který způsobí buněčnou smrt [1].

Hlavní faktory k úspěšné aPDT zahrnují optimalizaci typu a koncentrace fotosensitizeru a intenzitu záření [2]. Do budoucna můžeme počítat s léčbou rezistentních bakteriálních onemocnění, především lokálních infekcí, jejichž počet neustále roste, a dosavadní léčba není příliš úspěšná. Důvodem nepříliš kladných výsledků bývají infikované, špatně prokrvené tkáně nebo přítomnost bakteriálního biofilmu [3].

V současnosti vede časté užívání antibiotik k urgentní potřebě nových, vyhovujících, nenákladných a rezistenci nezpůsobujících léčebných metod v boji s rezistentními bakteriemi, především s methicilin-rezistentním Staphylococcus aureus [4]. Tento patogen způsobuje hlavně u hospitalizovaných pacientů s popáleninami kůže 75 % infekcí, vedoucích často až ke smrti pacientů [5].

Obecně lze říct, že gram-pozitivní bakterie jsou vůči aPDT více citlivé. Důvodem je stavba buněčné stěny, na kterou se fotosensitizer váže snáze a rychleji, než je tomu u gram-negativních bakterií [6]. V této práci se tedy snažíme popsat úspěšné výsledky, kterých bylo dosaženo ozářením pomocí systému LED diod o vlnové délce 414 nm s použitím dvou porfyrinových fotosensitizerů. Antimikrobiální fotodynamická terapie se aplikovala s cílem vyhubit kolonie MRSA a minimalizovat tak následnou viabilitu kmene.

Materiál a metody

Fotosensitizery, cyklodextrin, zdroj a intenzita záření

Použili jsme pro aPDT dva fotosensitizery (PS) - ZnTPPS₄ (připravený J. Mosingerem) a TMPyP (komerčně zakoupený v Sigma Aldrich). Před použitím se rozpustily v PBS a uchovaly se v -20 ºC ve tmě. Byly použity koncentrace: 0,78; 1,56; 3,125; 6,25; 12,5; 25, 50 a 100 μmol/l. Abychom dosáhli vyšší účinnosti při in vitro terapii, připravili jsme kromě roztoků pouze s porfyriny i vzorky obsahující komplex s hp-β-cyklodextrinem (Sigma-Aldrich). Poměry komplexu PS:CD byly také připraveny v PBS v poměrech 1:4, 1:1 a 2:1.

Jako zdroj záření byla použita soustava LED diod o vlnové délce odpovídající maximu použitých fotosensitizerů 414 nm. Testované vzorky bakterií s fotosensitizerem nebo komplexem PS:CD byly za aerobních podmínek vystaveny intenzitě záření 150 J/cm² ( ̴ 56 minut) při teplotě 37 °C.

Bakteriální kmen a podmínky kultivace

Byly odebrány 1–2 kolonie gram-pozitivního bakteriálního kmene S. aureus MRSA (methicilin-rezistentní) 4591, které se nechaly narůst v aerobních podmínkách ve 2 ml bujónu (Himedia) při 37 °C, 5% CO2 po dobu 45 minut ve tmě. Následně se odebralo do každé jamky 96-jamkové destičky 50 μl suspenze, odpovídající 1 x 106 CFU/ml.

aPDT

Antimikrobiální fotodynamická terapie se prováděla po jednotlivých krocích, jako jsou příprava a kultivace bakterií, příprava potřebných koncentrací fotosensitizerů a komplexů s cyklodextriny. Byly použity porfyriny TMPyP a ZnTPPS₄ k otestování a stanovení viability kmene MRSA a poklesu růstu bakteriálních kolonií. Vzorky na deskách byly rozděleny do několika skupin (Tab. 1). Toto členění sloužilo pro získání výsledků na porovnání samotné antimikrobiální PDT, dále pro ověření pozitivní a negativní kontroly a pro stanovení cytotoxicity na bakteriálním kmeni MRSA. Ve všech případech se pokaždé použilo 50 µl bakteriální suspenze (10⁶ cells/mL) inkubované za uvedených podmínek s fotosensitizery o koncentracích v rozmezí 0,78 μmol/l do 100 μmol/l. Po inkubaci a samotném ozáření byly měřeny absorbance pomocí spektrofotometru (BioTek, Winooski, Vermont, USA) v programu Gen5 každou hodinu po dobu 24 hodin.

Z hodnot byly sestrojeny růstové křivky a bylo vypočteno % zastoupení živých bakterií. Růstové křivky vyjadřují nárůst absorbance odpovídající množství bakterií v závislosti na čase.

Stanovení viability bakteriálního kmene

Procentuální vyjádření počtu bakterií, které nejsou citlivé na aPDT, se stanovuje z hodnot naměřených absorbancí při vlnové délce 630 nm ve vybraných časových úsecích (1).

Procentuální inhibice růstu se u všech skupin testovaných bakterií kmene MRSA byla stanovena pomocí rovnice

A_X (absorbance při dané koncentraci) a A_C (absorbance kontrolního vzorku v PBS) jsou absorbance měřené po 45 minutách inkubace ve tmě v intervalech 0, 6, 12, 18 a 24 hodin, A₀ představuje pro léčené a kontrolní suspenze počáteční hodnoty absorbance.

Statistika

K popisu růstu bakterií se použily regresní koeficient a intervaly spolehlivosti (95% CIs). Analýzy se prováděly s SPSS software vision 15 (SPSS, Ing. Chicago, USA) a statistická signifikance byla určená pro p<0.05.

Výsledky a diskuze

aPDT

Pro testovaný kmen MRSA se při aplikaci aPDT prokázaly účinné všechny ověřované koncentrace fotosensitizeru TMPyP v poměru 1:1 s CD (Graf 1). Došlo tu k výraznému poklesu růstu bakterií.

V grafu 2 můžeme vidět eliminovaný růst MRSA, běžný růst kontrolní křivky MRSA v PBS a nepatrný nárůst křivky v koncentraci 0,78 μM bez aplikace CD. Ostatní koncentrace TMPyP v kombinaci se zářením o vlnové délce 414 nm snížily růst bakterií na minimum.

Prezentovaná data v grafu 3 ukazují nižší účinnost fotosensitizeru ZnTPPS₄ s CD v poměru 1:1. Růstové křivky MRSA pro ZnTPPS₄:CD v poměru 1:1 rostly v nejnižších koncentracích téměř shodně jako kontrolní růstové křivky bakterií, pouze s časovou prodlevou od 12. do 18. hodiny měření. Pokles růstu bakterií je zřejmý pouze v nejvyšších koncentracích 100 až 12,5 μM.

V případě použití ZnTPPS₄ bez CD nedochází k poklesu růstu kmene MRSA, pouze pro 100 μM koncentraci je růst zredukován na 17 %. Konkrétní růstové křivky po aPDT jsou zobrazeny v grafu 4.

Na následujících dvou grafech 5 a 6 je vynesen pokles růstu v procentech pro kmen MRSA během 0, 6, 12, 18 a 24 hodin. Je vidět, jak se snižuje nárůst MRSA po aPDT při aplikaci TMPyP s CD v poměru 2:1 a ZnTPPS₄ s CD v poměru 1:4. V případě TMPyP klesla životnost ve všech zobrazených koncentracích výrazně pod 20 %, u ZnTPPS₄ tomu tak je v případě 100 μM koncentrace.

Staphylococcus aureus i další bakteriální druhy je možno vystavením modrému světlu v oblasti 400–420 nm fotodynamicky inaktivovat [7].

Aplikace aPDT s sebou stále nese některé otázky, na které je třeba odpovědět:

• Které bakterie jsou citlivé na ozáření?
• Jaký je přímý účinek na mikrobiální populaci?
• Jaký typ fotosensitizeru se selektivně váže na různé druhy bakterií?
• Jaká je vhodná terapeutická koncentrace PS?
• Jaké jsou přijatelné parametry záření (vlnová délka, délka expozice …)? [8].

Nicméně lze zdůraznit, že ačkoli je zatím tato oblast na počátku vývoje, posunuje se stále kupředu a objevuje se na toto téma pořád více publikací orientovaných směrem k antimikrobiální fotodynamické terapii, které potvrzují možnou inaktivaci gram-pozitivních, ale i gram-negativních bakteriálních kmenů [9, 10].Jako alternativa se aPDT může užívat v léčbě lokálních infekcí (v ústech nebo na pokožce) a zamezit tak rozvoji rezistence na systémová léčiva [11].

Jelikož aktuální využití aPDT v klinické praxi závisí na baktericidní aktivitě a zároveň na cytotoxicitě vůči okolní hostující tkáni [12], naše předchozí publikace byla zaměřena i na PDT nenádorové buněčné linie NIH3T3 (myší fibroblasty). Pro porovnání a z důvodu aplikace PDT také v oblasti tumorů [13], jsme testovali fotosensitizery i na nádorovou buněčnou linii HeLa.

Tato publikace demonstruje současnou práci, která byla úspěšná především z hlediska dosažení kladných výsledků inaktivace růstu bakterií pro kationtový fotosensitizer TMPyP, a to i ve velmi nízkých koncentracích.

Statistika

Statisticky významné regresní koeficienty a 95% CI (levá a pravá mez) se stanovily u MRSA kmene pro fotosensitizer ZnTPPS₄ ve všech koncentracích 100 až 25 μM, v případě s CD v poměru 1:4 - 12,5 až 1,56 μM, v poměru 1:1 - 6,25 a 3,125 μM, v poměru 2:1 a bez CD - 12,5 a 6,25 μM. Pro fotosensitizer TMPyP byly regresní koeficienty významné ve všech kon-centracích a poměrech s CD i bez CD.

Závěr

Světlo o vlnové délce 414 nm v  oblasti elektro-magnetického spektra odpovídá absorpčnímu maximu porfyrinů ZnTPPS₄ a TMPyP, které byly použity pro navození fotodynamického jevu, a tedy k in vitro antimikrobiální, nádorové i nenádorové terapii.

V budoucnu se naše práce bude ubírat směrem kombinace aPDT s antibiotiky. Perspektivou bude možné zesílení efektu s použitím antibiotik, se kterými momentálně vykazují gram-pozitivní i gram-negativní kmeny rezistenci.

Poděkování

Tato práce byla podpořena grantovými projekty 303/09/H048, CZ.1.05/2.1.00/01.0030 a LF_2012_019.

Mgr. Adéla Hanáková

Katedra lékařské biofyziky

Lékařská fakulta

Univerzita Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3, CZ-775 15 Olomouc

E-mail: a.hanakova@upol.cz

tel.: +420 585 632 110