Metabolická plasticita nádorových buněk

Souhrn

Východiska: Společným rysem metabolizmu nádorových buněk je schopnost získávat potřebné živiny z poměrně chudého prostředí a využívat je k udržení životaschopnosti a tvorbě nové bio­masy. Změny v intracelulárních a extracelulárních metabolitech, které doprovází metabolické přeprogramování spojené s růstem nádoru, mají následně zásadní účinek na genovou expresi, buněčnou diferenciaci a mikroprostředí nádoru. V průběhu kancerogeneze čelí nádorové buňky selekčním tlakům, které je nutí neustále optimalizovat dominantní metabolické dráhy a nádorové buňky tak procházejí zásadními metabolickými reorganizacemi. Obecně platí, že vyšší flexibilita metabolických drah zvyšuje schopnost nádorových buněk sladit metabolické potřeby s měnícím se prostředím. Cíl: V tomto přehledovém článku pojednáváme o metabolických vlastnostech nádorových buněk a popisujeme účinek transformovaného metabolizmu na progresi nádoru. Domníváme se, že metabolické změny jsou pro rozvoj nádorů zásadní a mohly by poskytnout zajímavé cíle pro léčbu.

Klíčová slova:

nádorová onemocnění – metabolizmus – glutaminolýza – Warburgův efekt – anapleróza – Krebsův cyklus – nádorová transformace – onkometabolity

Úvod

Společným rysem nádorových buněk je schopnost získávat potřebné živiny z poměrně chudého prostředí a flexibilně je využívat k udržení životaschopnosti a budování nové bio­masy. Bioenergeticky náročné procesy doprovázející maligní transformaci, jako jsou rychlá proliferace a schopnost migrovat, vyžadují zvýšenou produkci adenosintrifosfátu (ATP), nukleových kyselin, proteinů a lipidů. Změny v intracelulárních a extracelulárních metabolitech, které doprovází metabolické přeprogramování spojené s růstem nádoru, mají následně zásadní účinek na genovou expresi, buněčnou diferenciaci a mikroprostředí nádoru [1].

V průběhu kancerogeneze procházejí nádorové buňky častými metabolickými reorganizacemi. Obecně platí, že vyšší flexibilita metabolických drah využitelných danou buňkou nebo skupinou buněk zvyšuje jejich schopnost sladit metabolické potřeby s měnícím se prostředím. Metabolická plasticita je zprostředkována řadou mechanizmů zahrnujících receptory, různé typy signálních drah, pozměněnou aktivitu transkripčních faktorů a mutace ovlivňující expresi či funkci enzymů. Metabolická plasticita není výlučným znakem nádorových buněk, hraje totiž významnou roli v embryogenezi. Časná embrya jsou zpočátku závislá na oxidačním metabolizmu a upřednostňují oxidaci pyruvátu pomocí mateřských mitochondrií z oocytu. Příjem glukózy se postupně zvyšuje v morule a je urychlován ve stadiu blastocysty, kde její příjem převyšuje příjem pyruvátu či laktátu. V tomto období převažuje glykolýza, která je dále akcelerována při implantaci embrya do stěny dělohy. Během pozdějšího vývoje umožňuje mitochondriální replikace opětovné zahájení oxidačního metabolizmu a progresivní pokles glykolýzy [2,3]. Tyto metabolické posuny jsou zásadní; mutace v genech spojených s glykolýzou nebo oxidační fosforylací mohou vést ke zpoždění vývoje nebo k embryonální letalitě [4]. Metabolická plasticita embryonálních buněk může být „odblokována“ v průběhu kancerogeneze a využita nádorovými buňkami.

V tomto přehledovém článku jsme se pokusili shrnout metabolické procesy, které mohou významně přispívat k progresi nádorového onemocnění: Warburgův efekt, význam anaplerózy Krebsova cyklu, glutaminolýzu a oportunistické zdroje nutrientů využívané nádorovými buňkami. Dále jsou rozebrány mutace a změny v expresi metabolických enzymů, které mohou přispívat k nádorové transformaci prostřednictvím produkce onkometabolitů.

Warburgův efekt

Na počátku 20. let minulého století objevil Otto Warburg, že ve srovnání s většinou netransformovaných tkání konzumují nádory obrovské množství glukózy. Většina glukózy spotřebované nádory je fermentována na laktát, a to i v přítomnosti kyslíku [5]. Tento fenotyp se označuje jako aerobní glykolýza. Aerobní glykolýza je charakteristickým znakem proliferativního metabolizmu a je často spojována s nádorovým bujením. V této souvislosti je aerobní glykolýza známá jako Warburgův efekt. Warburg předpokládal, že aerobní glykolýza je příznakem poškození mitochondrií a blokády oxidačního metabolizmu nádorových buněk [6]. Ačkoli mnoho druhů nádorových buněk produkuje ATP prostřednictvím glykolýzy, většina z nich má rovněž funkční a aktivní mitochondrie, které hrají ústřední roli jak v metabolizmu, tak v tumorigenezi. Funkční mitochondrie se zdají být pro nádorovou buňku dokonce nezbytné [7]. Mutace v mitochondriálních genech jsou u nádorů běžné, nicméně většinou neinaktivují energetický metabolizmus, ale spíše mění mitochondriální bio­syntézu, což vede ke změnám v komunikaci s jádrem (mitochondriální retrográdní signalizace) za účelem modulace signálních drah, transkripční aktivity a struktury chromatinu [8]. Pro viabilitu nádorové buňky je zásadní zachovat si určitý počet mitochondrií s neporušeným proteomem. Negativní selekci podléhají zejména mutace významně poškozující dýchací řetězec [9]. Nádorové buňky bez mitochondriální DNA (mtDNA) vykazují sníženou proliferaci a k dalšímu rozvoji nádoru je nezbytné získání mtDNA z hostitelských buněk [7]. K překonání zástavy buněčného cyklu není nutná mitochondriální syntéza ATP, je však nutná bio­syntéza pyrimidinů závislá na dýchacím řetězci a aktivitě dihydroorotát dehydrogenázy [10].

Provozování aerobní glykolýzy místo dýchání je poměrně energeticky nevýhodné (jsou vytvořeny pouze 2 molekuly ATP, tedy pouze 6 % teoretického maximálního výtěžku z dýchacího řetězce a oxidační fosforylace). Co tedy vede k aerobní glykolýze u nádorů a proč je spojena s proliferací, ačkoli snižuje efektivitu produkce ATP a vede ke ztrátě důležitých bio­syntetických prekurzorů? (Většina uhlíků získaných z glukózy se při aerobní glykolýze vylučuje skrze laktát.) Možným vysvětlením je, že aerobní glykolýza usnadňuje produkci kofaktorů a nosičů elektronů potřebných pro redoxní reakce v buňkách (obr. 1). Zvýšená absorpce glukózy umožňuje vyšší produkci nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH) v rámci pentózo-fosfátové dráhy (pentose phosphate pathway – PPP) a fermentace zahrnuje regeneraci oxidované formy nikotinamidadenindinukleotidu (NAD⁺) působením laktátdehydrogenázy (LDH). NADPH spolupracuje především s enzymy anabolických drah a dodává elektrony pro syntézu energeticky bohatých molekul, zatímco NAD⁺ působí jako oxidační činidlo v katabolických dějích.

Proliferující buňky mají vysokou spotřebu NAD⁺, jehož fatální nedostatek může vést k buněčné smrti typu parthanatos [11]. Hlavními enzymy podílejícími se na regeneraci NAD⁺ v buňce jsou LDH a mitochondriální komplex I, který je hlavním místem pro aerobní regeneraci NAD⁺, jelikož katalyzuje oxidaci NADH na NAD⁺ a zároveň transfer dvou elektronů na koenzym Q. Pokud poptávka po NAD⁺ překročí rychlost spotřeby ATP, regenerace NAD⁺ komplexem I bude omezena, jelikož zvýšený potenciál mitochondriální membrány (Dψm) vznikající v důsledku pomalejší syntézy ATP ztěžuje transport elektronů a regeneraci NAD⁺. Odpojení dýchání od syntézy ATP nebo zvýšení hydrolýzy ATP [12] obnovuje homeostázu NAD⁺/NADH a proliferaci, a to i při vysoké aktivitě dýchacího řetězce. Aby se zabránilo hyperpolarizaci mitochondriální membrány (vysoká hodnota Dψm), mohou se nádorové buňky spoléhat na indukovaný únik protonů pomocí odpřahujících proteinů (uncoupling proteins – UCP). UCP jsou mitochondriální transportéry přítomné ve vnitřní membráně mitochondrií, které podporují metabolickou flexibilitu tím, že umožňují vysokou rychlost regenerace NAD⁺ mitochondriálním dýcháním, a to bez tvorby ATP [13]. Zvýšená exprese UCP2 byla popsána u leukemií, nádorů prsu, vaječníků, močového měchýře, jícnu, slinivky břišní, ledvin, varlat, plic, prostaty a kůže [14–17]. Buňky se tedy zapojují do aerobní glykolýzy, pokud poptávka po NAD⁺ převyšuje poptávku po ATP a aerobní glykolýza je charakterizována přesunem pyruvátu z Krebsova cyklu směrem k fermentaci, která umožňuje snadnější regeneraci NAD⁺ [13]. Oxidace pyruvátu v mitochondriích vyžaduje komplex pyruvátdehydrogenázy (pyruvate dehydrogenase complex – PDHC), který usnadňuje vstup pyruvátu do Krebsova cyklu. PDHC je negativně regulován pyruvátdehydrogenázovými kinázami (PDK). Transkripční faktory notoricky spojované s kancerogenezí, jako jsou Myc, Wnt a hypoxií indukovatelné faktory (HIF), působí v nádorových buňkách navýšení exprese jedné nebo více izoforem PDK. Aktivované PDK následně fosforylují PDHC, což inhibuje jeho aktivitu a oxidaci pyruvátu [18]. Ke snížení redukčního stresu způsobeného hromaděním intracelulárního NADH využívají nádorové buňky rovněž transport elektronů na plazmatické membráně, jehož hlavní funkcí je recyklace NADH na NAD⁺ [19].

Široké klinické využití PET s použitím ¹⁸F-fluorodeoxyglukózy přispívá k vnímání mnoha nádorů jako glykolytických. Tato metoda však poskytuje informace o absorpci glukózy, ale ne o jejím následném metabolickém osudu. Zvýšený příjem glukózy nemusí být vždy v pozitivní korelaci s mírou glykolýzy. Maligní buňky mohou využívat glukózu k produkci buněčné bio­masy, podpoře růstu a překonání bariér k metastazování [20]. Z tohoto důvodu je pro nádorové buňky důležitá PPP. Tato dráha poskytuje redukované kofaktory NADPH a pětiuhlíkaté sacharidy (pentózy). NADPH je následně spotřebováván při bio­syntéze steroidních látek a mastných kyselin. Vytváření pentóz je nezbytné pro syntézu nukleotidů a nukleových kyselin. Vzhledem k tomu, že PPP a glykolýza sdílejí glukózu-6-fosfát (G6P) jakožto společný meziprodukt, je při rychlé glykolýze G6P zpracována na pyruvát dříve, než se stihne odklonit do PPP. Pyruvát je syntetizován pyruvátkinázou (PK) jako poslední krok glykolýzy. PK se může vyskytovat jako izoforma M1 nebo M2. U mnoha typů nádorů je více exprimovanou formou PK izoforma M2, zatímco netransformované tkáně s vysokou poptávkou po ATP mají tendenci exprimovat spíše izoformu M1, která v porovnání s M2 vykazuje vyšší rychlost [21]. Buňky se zvýšeným poměrem PK-M2/PK-M1 mají potenciál zpomalit produkci pyruvátu v reakci na signály proliferace. Tento jev pravděpodobně umožňuje využití glykolytických meziproduktů pro bio­syntézu stavebních bloků vč. nukleotidů a aminokyselin [22–24].

NADPH může být také syntetizován prostřednictvím cytosolické akonitázy (cytosolic aconitase – c-ACN). c-ACN je známější jako protein regulující železo (iron regulatory protein 1 – IRP1). Pokud je intracelulární objem železa nízký, IRP1 se váže na nepřekládané oblasti specifických mRNA a zvyšuje expresi proteinů odpovědných za intracelulární příjem železa. V přítomnosti zvýšených hladin intracelulárního železa tvoří IRP1 klastry 4Fe-4S vykazující aktivitu akonitázy. c-ACN metabolizuje citrát na izocitrát, který se pak transformuje na a-ketoglutarát (a-KG) za současné syntézy NADPH. Snížený tok citrátu přes c-ACN může tedy snížit produkci cytosolického NADPH, což je hlavní zdroj redukčních ekvivalentů pro syntézu mastných kyselin a důležitá obrana proti oxidačnímu stresu [25]. Pokud jsou nádorové buňky schopny importovat dostatečné množství citrátu [26], podporuje přebytek železa přeměnu citrátu na izocitrát pomocí c-ACN s následnou tvorbou NADPH. Inhibice c-ACN vede ke snížení poměru NADPH/NADP a k nižší expresi genů spojených s lipogenezí [27]. Nádorové buňky syntetizují větší množství lipidů než nemaligní buňky a vyžadují vyšší hladinu železa, což zvyšuje jejich náchylnost k ferroptóze (forma buněčné smrti, která je výsledkem akumulace reaktivních forem kyslíku v závislosti na přítomnosti železa) [28], nicméně vysoké hladiny NADPH mohou nádorové buňky před takovým typem smrti ochránit [29].

Důsledkem Warburgova efektu může být akumulace laktátu v nádorovém mikroprostředí (tumor microenvironment – TME) a vyvolání laktátové acidózy. Laktátová acidóza má silný imunosupresivní účinek a v ně­kte­rých případech zprostředkovává únik nádorových buněk před imunitním dohledem (obr. 2). Laktát je molekula schopná potlačovat imunitní reakce prostřednictvím inhibice efektorových T lymfocytů či dendritických buněk a modulací fenotypu makrofágů [30,31]. Naopak diferenciace a aktivita regulačních T lymfocytů, které inhibují protinádorovou imunitní odpověď, je zvýšenou koncentrací laktátu v TME podporována [32]. Acidóza nádorového mikroprostředí významně podporuje rovněž metabolizmus lipidů, indukci autofagie, produkci NADPH v rámci PPP a remodelaci extracelulární matrix [33]. Mírná acidóza může změnit morfologii mitochondrií, což následně umožňuje zachování účinné produkce ATP bez ohledu na hladiny kyslíku a zabraňuje mitochondriální fragmentaci v důsledku hypoxie [34]. Jednou z možných adaptací nádorových buněk na vysoké hladiny laktátu je ustavení metabolické symbiózy mezi buňkami generujícími laktát a buňkami konzumujícími laktát. Laktát se z buňky uvolňuje prostřednictvím monokarboxylátového transportéru 4, jiné buňky přítomné v nádorovém mikroprostředí mohou laktát zachytit pomocí monokarboxylátového transportéru 1 (MCT1) a metabolizovat jej na pyruvát [35]. K přežití nádorových buněk v podmínkách acidózy rovněž přispívá membránový protein asociovaný s lysozomy (lysosome-associated membrane protein 2 – LAMP2), který běžně funguje k ochraně lysozomálních membrán před kyselou proteolýzou. LAMP2 byl nalezen na plazmatické membráně nádorových buněk přizpůsobených acidóze [36].

Možné terapeutické cílení Warburgova efektu zahrnuje inhibici transportu glukózy (ritonavir, fasentin, genistein, STF-31 a WZB117) či inhibici fosforylace glukózy a vzniku glukóza-6-fosfátu (3-bromopyruvát, lonidamin, 2-deoxy-D-glukóza) [38,39]. Výsledky klinických studií ukázaly, že lonidamin potencoval terapeutický účinek doxorubicinu u melanomů, nádorů prsu, prostaty, mozku a vaječníků [40,41]. Účinek 2-deoxy-D-glukózy je založen na snížení využitelnosti glukózy, jelikož 2-deoxy-D-glukóza je metabolizována na deoxyglukózu-6-fosfát, kterou nelze dále využít k produkci ATP [42]. Přestože 2-deoxy-D-glukóza samotná má pouze omezený terapeutický potenciál, může být úspěšně kombinována s jinými terapeutickými přístupy (např. radioterapií) [43].

Nadějným přístupem pro terapeutické využití Warburgova efektu vyznačujícího se nadměrným příjmem glukózy je vazba léčiva přímo na glukózu. Příkladem může být glufosfamid, který se během glykolýzy štěpí na glukózu a toxický ifosfamid [44]. Dalšími slibnými látkami, které lze navázat na glukózu, jsou 1,4-naftochinony [45], rozvětvený polyethylenglykol [46], platina [47] či methotrexát [48]. Látky konjugované s glukózou jsou využitelné rovněž pro fotodynamickou terapii. Příkladem fotosenzibilizátoru konjugovaného s glukózou je např. G-chlorin e6 [49].

Jak bylo diskutováno výše, PK-M2 hraje klíčovou roli v metabolizmu a proliferaci nádorových buněk. Mezi inhibitory PK-M2 patří látky TT-232, VK3 a VK5 [38]. Nedávno bylo zjištěno, že mezi inhibitory PK-M2 patří rovněž kyselina oleanolová [50]. Dalším významným enzymem účastnícím se Warburgova efektu je LDH. Zatímco laktát izoforma dehydrogenáza A (LDHA) má vyšší afinitu k pyruvátu a přednostně přeměňuje pyruvát na laktát a NADH na NAD⁺, izoforma laktát dehydrogenáza B (LDHB) má vyšší afinitu k laktátu a přednostně převádí laktát na pyruvát a NAD⁺ na NADH [51,52]. LDHA je hlavním enzymem regulujícím Warburgův efekt, a je tedy rovněž důležitým cílem pro vývoj antineoplastických léčiv. Příkladem mohou být 1- (fenylseleno) -4- (trifluormethyl) benzen a FX11 [53,54].

Anabolizmus, anapleróza a Krebsův cyklus

Během překotného dělení nádorových buněk je spotřebováváno velké množství lipidů, nukleotidů a aminokyselin. K jejich syntéze používají buňky prekurzory odvozené z meziproduktů Krebsova cyklu (KC). Např. oxaloacetát a a-KG jsou nezbytné pro syntézu neesenciálních aminokyselin a nukleotidů. Během buněčné proliferace se tedy velká část uhlíku, který vstupuje do KC, používá spíše v bio­syntetických drahách než k produkci ATP. To má za následek nepřetržitý odliv meziproduktů Krebsova cyklu (katapleróza). Ukázkovým příkladem kataplerózy v proliferujících buňkách je syntéza lipidů (mastných kyselin, cholesterolu a izoprenoidů) z citrátu. Citrát uvolněný do cytoplazmy je metabolizován ATP-citrát lyázou (ACLY) a hraje ústřední roli v syntéze mastných kyselin. Inhibice ACLY může potlačit růst nádorových buněk [55,56]. Metabolické meziprodukty KC musejí být u rychle se dělících buněk neustále doplňovány anaplerotickými reakcemi (oxaloacetát, a-KG či fumarát mohou vznikat z aminokyselin – aspartát může být transaminován na oxaloacetát, glutamát na a-KG; sukcinyl-CoA může být pak syntetizován z propionyl-CoA, jenž se tvoří během degradace mastných kyselin, a acetát může přispívat k navýšení buněčných zásob acetyl-CoA [57]. Zvýšené požadavky na citrát mohou být kromě jeho běžné syntézy z pyruvátu v KC pokryty také a-ketoglutarátem vzniklým z glutaminu (obr. 3). Ten je redukčně karboxylován mitochondriální izocitrátdehydrogenázou 2 za vzniku izocitrátu, který lze poté izomerizovat na citrát [58]. Až donedávna se věřilo, že nádorové buňky nemohou získat citrát z extracelulárního prostoru a vzniká tak jejich závislost na importu glutaminu. To se však ukázalo být chybným předpokladem [26]. Ně­kte­ré nádorové buňky jsou závislé na glutaminu pouze in vitro, zatímco in vivo je jejich míra absorpce glutaminu podobná jako u netransformovaných buněk [59]. Import extracelulárního citrátu může významně podporovat proliferaci nádorových buněk skrze syntézu mastných kyselin a bílkovin [60]. Způsob, jakým je v nádorových buňkách obstaráván citrát, může záviset na okolních metabolických podmínkách (hypoxie, dostupnost glukózy, typ nádorového stromatu). Zvýšená absorpce glutaminu byla pozorována ve stromálních buňkách přítomných v mikroprostředí glioblastomu [61]. Tato zvýšená absorpce glutaminu by byla konzistentní s konceptem metabolické symbiózy, kdy nádorové stroma syntetizuje metabolické substráty podporující růst nádorových buněk; to by mohlo potenciálně zahrnovat také citrát. Syntéza citrátu z glutaminu a jeho uvolňování do TME by mohly být jedním z metabolických důsledků transformace fibroblastů v nádorovém  mikroprostředí [62].

Dalším metabolitem, který se může podílet na podpoře mitochondriálního metabolizmu nádorových buněk a v důsledku toho na syntéze citrátu, je laktát, který byl dlouho považován za odpadní produkt. Ně­kte­ré nádorové buňky či buňky přítomné v TME však laktát přijímají a metabolizují [35,63]. Laktát lze do buňky importovat pomocí MCT1. Intracelulárně může být laktát přeměněn na pyruvát a poté na acetyl-CoA, který se přivádí do Krebsova cyklu. Konverze laktátu na pyruvát je navíc doprovázena redukcí NAD⁺ na NADH, který potlačuje aktivitu glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy ve směru odbourávání glukózy, čímž šetří G6P pro převod do PPP. Nadměrná aktivita PPP a zvýšená exprese MCT1 významně podporují metastazování melanomu [64].

U mnoha typů nádorů je navýšena de novo syntéza serinu, při které je relativně velké množství glykolytického uhlíku odváděno pomocí fosfoglycerátdehydrogenázy (PHGDH) do syntetických drah serinu a glycinu a následné tvorby nukleotidů (obr. 3). Limitujícím faktorem využití serinu pro syntézu nukleotidů je přítomnost dostatečného množství NAD⁺ [65]. Gen pro PHGDH je často amplifikován u melanomů. Zvýšená exprese PHGDH byla také spojena s ně­kte­rými podtypy nádorů prsu [66]. PHGDH a syntéza serinu jsou paradoxně vyžadovány rovněž v přítomnosti nadměrného množství environmentálního serinu, a to i v případě, kdy absorpce serinu přesahuje požadavky na syntézu nukleotidů. Lze tedy předpokládat, že serinová cesta neslouží pouze k syntéze serinu, ale může být alternativním prostředkem k produkci a-KG či glutathionu (GSH). Zvýšená aktivita KC cyklu a PPP může zvrátit důsledky inhibice PHGDH [67,68].

Anapleróza KC umožňuje nádorovým buňkám udržovat vysokou míru proliferace a anabolických reakcí, zároveň se tyto procesy stávají pro nádorovou buňku nezbytnými, a jsou tedy lákavým cílem protinádorové terapie. Možné terapeutické cílení anaplerózy KC a následných anabolických reakcí zahrnuje inhibici ACLY (SB-204990, (-) -kyselina hydroxycitronová, deriváty emodinu, antimycin A2 a A8 či radicicol) [69–72], inhibici LDHB (derivát indolu AXKO-0046 [73]) či nespecifickou inhibici LDH [74], inhibici importu laktátu (syrosingopin, 7ACC2) [75,76] či inhibici PHGDH [77,78].

Glutaminolýza

Mnoho nádorových buněk (obzvláště při hypoxii) konzumuje vysokou rychlostí glutamin a současně vylučuje glutamát. Glutamin je transportován do buněk pomocí transportérů glutaminu v plazmatické membráně, jako jsou proteiny kódované geny SLC1A5, SLC38A1 a SLC38A217. Glutamin je v rámci glutaminolýzy přeměněn na glutamát pomocí glutaminázy (GLS1 či GLS2) [79]. Glutaminolýza má v nádorovém metabolizmu zásadní roli, podílí se na doplňování meziproduktů KC, bio­syntéze nukleotidů, GSH a ně­kte­rých aminokyselin. Zvýšená exprese fosforibosylpyrofosfátamidotransferázy, která přenáší g-dusík glutaminu na 5-fosforibosylpyrofosfát (klíčová reakce při bio­syntéze purinů), je jedním z nejsilnějších indikátorů špatné prognózy u malobuněčného karcinomu plic [80]. Glutamát hraje ústřední roli v metabolizmu aminokyselin, protože je zásadní pro bio­syntézu alaninu, aspartátu, prolinu a serinu, kteréžto aminokyseliny se dále používají pro bio­syntézu asparaginu, argininu, cysteinu a glycinu. Glutamát se rovněž využívá jako směnný faktor pro import extracelulárního cystinu prostřednictvím transportéru kódovaného genem SLC7A11 [81]. Asi 30 % glutaminu je metabolizováno v cytosolu [79]. U mitochondriální glutaminolýzy musí být cytosolický glutamin nejprve transportován přes vnitřní mitochondriální membránu prostřednictvím transkripční varianty genu SLC1A5 přepsané z alternativního místa iniciace transkripce [82]. Mitochondriální glutamát lze exportovat z mitochondrií do cytosolu prostřednictvím transportérů kódovaných geny SLC25A18 a SLC25A22 [83].

Spotřeba glutaminu je spojována s doplňováním meziproduktů KC, zvýšenou poptávkou po dusíku a syntézou ATP, ale důvod vylučování glutamátu je spíše nejasný. Předpokládá se, že vylučování glutamátu pomáhá buňce zvýšit rychlost syntézy nukleotidů [79]. Možné je též využití exportu glutamátu v obraně proti oxidačnímu stresu (import cystinu skrze (Xc–) systém) [84]. Nicméně vysoké koncentrace extracelulárního glutamátu mohou blokovat absorpci cystinu systémem (Xc–) a indukovat ferroptózu [85,86]. Ně­kte­ré nádorové buňky vylučující vysoké koncentrace glutamátu mohou být citlivé na ferroptózu v případě, že nezískají podporu dalších buněk nacházejících se v mikroprostředí nádoru. Glutamát může být importován např. fibroblasty asociovanými s nádorem (CAF), a to prostřednictvím transportéru kódovaného genem SLC1A3. Tyto fibroblasty mají často zvýšenou expresi glutamin syntetázy (GS/GLUL) a uvolňují aspartát a glutamin podporující proliferaci nádorových buněk [87]. Nastolená metabolická symbióza umožňuje nádorovým buňkám zbavit se glutamátu podporujícího ferroptózu a získat glutamin. Podobná metabolická výměna může probíhat také mezi nádorovými buňkami a M2-makrofágy [88].

Vzhledem ke kritické roli glutaminolýzy v metabolizmu nádorových buněk a jisté závislosti ně­kte­rých nádorů na glutaminu bylo vyvinuto mnoho účinných inhibitorů tohoto procesu (DON, JHU-083, BPTES, CB-839) [89]. DON je antagonista glutaminu, který široce inhibuje enzymy využívající glutamin. Tato neselektivní inhibice však vyvolává vysoký stupeň toxicity. Aby se minimalizovala toxicita DON, byla vyvinuta strategie proléčiv, která mohou být podávána v inertním stavu a poté aktivována v mikroprostředí nádoru [90]. Na rozdíl od antagonistů glutaminu alosterické inhibitory, jako jsou BPTES a CB-839, selektivně cílí na glutaminázu, aniž by narušily další aspekty metabolizmu glutaminu. Ačkoli BPTES vykazuje vysokou specifičnost a účinnost při inhibici proliferace nádorových buněk in vitro, jeho nevýhodou je špatná rozpustnost ve vodě a nízká bio­logická dostupnost in vivo omezující jeho další aplikace. Sloučenina CB-839 již vstoupila do klinických studií pro léčbu pokročilých solidních nádorů a hematologických malignit [91]. Dalším slibným přístupem v cílení glutaminolýzy je inhibice vychytávání glutaminu z extracelulárního prostředí. Chemická inhibice transportu glutaminu benzylserinem nebo L- g-glutamyl-p-nitroanilidem vedla k významnému snížení růstu nádorových buněk endometria [92].

Onkometabolity

Pojem onkometabolit označuje metabolit, který je v nádorech nadměrně akumulován a může ovlivňovat progresi onemocnění prostřednictvím epigenetické dysregulace či přepínáním fenotypových vlastností buněk (např. epitelo-mezenchymová tranzice – EMT). Jedním z nejznámějších onkometabolitů je D-2-hydroxyglutarát (D2HG). Jeho akumulace je způsobena mutacemi v izocitrátdehydrogenáze (IDH1 nebo IDH2), která za normálních okolností katalyzuje oxidační dekarboxylaci izocitrátu na a-KG. Tyto mutace se běžně vyskytují u gliomů a akutní myeloidní leukemie. Hladiny D2HG mohou v gliomové tkáni dosahovat až 35 mM koncentrace a tyto vysoké hladiny D2HG byly spojeny s onkogenezí a inhibicí diferenciace buněk. Díky své strukturální podobnosti s a-KG má D2HG inhibiční účinky na enzymy závislé na α-KG [93], a může tedy přispívat k maligní transformaci narušením normálního cyklu metylace a demetylace DNA (prostřednictvím inhibice enzymů závislých na a-KG, jako je Tet metylcytosin dioxygenáza 2 (TET2)). Exprese mutantních alel IDH produkujících D2HG je schopna vyvolat globální hypermetylaci DNA [94], způsobit defekt homologní rekombinace [95], indukovat angiogenní aktivitu prostřednictvím signální dráhy receptoru vaskulárního endotelového růstového faktoru (vascular endothelial growth factor – VEGF) [96] či snížit hladinu glutathionperoxidázy 4, enzymu klíčového pro zvládání oxidačního stresu a peroxidace lipidů. Určité mutantní formy IDH1 mohou tedy vyvolávat senzitivitu k ferroptóze [97]. Kromě D (R) – enantiomeru 2-hydroxyglutarátu může být produkován také jeho L (S) – enantiomer (L2HG). K akumulaci L2HG může vést zvýšená aktivita LDH a malátdehydrogenázy (MDH), nedostatek kyslíku či kyselé pH. Zvýšená produkce L2HG vede ke stabilizaci hypoxií indukovatelného faktoru 1 alfa (HIF-1a), a to i v normoxii [98]. L2HG je onkometabolit významný u nádorů ledvin a funguje jako epigenetický modifikátor, jelikož inhibuje aktivitu TET2 [99].

K produkci onkometabolitů mohou přispívat rovněž mutace či změny v genové expresi enzymů Krebsova cyklu [100]. Mezi onkometabolity odvozené z KC bývají řazeny sukcinát a fumarát (obr. 4). Ztráta funkce sukcinátdehydrogenázy (SDH) doprovázená nadprodukcí sukcinátu byla spojena s iniciací malignit [101]. Akumulace sukcinátu usnadňuje angiogenezi stimulací sukcinátového receptoru 1 (SUCNR1) a způsobuje nadprodukci VEGF [102,103]. Akumulace sukcinátu také přispívá k aktivaci EMT a k epigenetickým modifikacím díky inhibici enzymu TET (snížení oxidace 5-metylcytosinu a následná hypermetylace DNA) [104–106]. Nedostatečná aktivita SDH byla spojena s metabolickým přeprogramováním nádorových buněk směrem ke glykolytickému, pseudohypoxickému fenotypu [107], jelikož sukcinát stabilizuje hypoxií indukovatelný faktor-1a (HIF-1a) a podporuje uvolňování prozánětlivého interleukinu IL-1b imunitními buňkami, jako jsou makrofágy či dendritické buňky [108].

Podobně jako sukcinát je i fumarát důležitým metabolitem Krebsova cyklu. K intracelulární akumulaci fumarátu vede např. ztráta aktivity fumarát hydratázy (FH), která má mnoho rozdílných důsledků vč. aktivace onkogenních drah a vychytávání glutaminu [109]. Ztráta funkce FH přispívá např. k propuknutí dědičné leiomyomatózy, melanomu a nádorů ledvin [101]. Tumorigeneze v FH-deficientních buňkách je zřejmě vícestupňovým procesem. Po ztrátě FH procházejí buňky řadou bio­chemických adaptací, aby kompenzovaly zkrácení Krebsova cyklu. Tyto kompenzační změny podporují akumulaci intracelulárního fumarátu, což může vést k vyčerpání zásob glutathionu, oxidačnímu stresu a senescenci. Souběžně může fumarát vyvolat epigenetické změny, které umožňují senescenci obejít (např. hypermetylace p16), a aktivaci dalších onkogenních drah vč. těch, které jsou řízeny faktorem 2 souvisejícím s jaderným faktorem erythroid 2 (Nuclear factor erythroid 2-Related Factor – 2NRF2), nereceptorovou tyrozin-protein kinázou (ABL1) a HIF-1a [110]. Akumulovaný fumarát vede k posttranslační modifikaci cysteinových zbytků různých proteinů (proces sukcinace). Sukcinací kelch-like ECH-asociovaného proteinu 1 (KEAP1) a aktivací ABL1 stimuluje fumarát antioxidační odpověď zprostředkovanou transkripčním faktorem NRF2 [110,111]. Jedním z transkripčních cílů NRF2 je rovněž hemoxygenáza 1 (HMOX1), která je nutná pro bio­syntézu a degradaci hemu, což je základní cesta pro přežití buněk s deficitem FH. Působením HMOX1 vzniká oxid uhelnatý, železnatý iont a biliverdin, který je následně redukován na bilirubin. Sukcinace proteinu regulujícího železo (iron regulatory protein 2 – IRP2) znemožňuje potlačit translaci mRNA pro ferritin. Zvýšené hladiny ferritinu následně podporují expresi promitotického transkripčního faktoru „forkhead box protein M1“, který podporuje proliferaci buněk [112], a způsobují pokles hladiny volného intracelulárního železa. Redukce železa a sukcinace klíčových cysteinových zbytků v katalytickém jádru také inaktivuje mitochondriální akonitázu, což znemožňuje oxidaci citrátu a umožňuje jeho využití pro syntézu lipidů [113]. Fumarát může fungovat také jako inhibitor pyroptotické buněčné smrti, jelikož způsobuje sukcinaci gasderminu D a zabraňuje tak jeho interakci s kaspázami, omezuje jeho oligomerizaci a schopnost indukovat pyroptózu, která úzce souvisí s aktivací protinádorové imunity [114,115]. Akumulace fumarátu v buňkách s deficitem FH vede rovněž k obrácení aktivity enzymu močovinového cyklu argininosukcinát lyázy, což způsobuje produkci argininosukcinátu z fumarátu a argininu. V důsledku toho jsou buňky s deficitem FH pro arginin auxotrofní, a tedy citlivé k jeho nedostatku [109]. Podobně akumulace fumarátu podporuje nadprodukci adenylosukcinátu obrácením aktivity adenylosukcinát lyázy v cyklu purinových nukleotidů [110].

Pro regulaci vzniku onkometabolitů bylo vyvinuto několik typů inhibitorů cílících na mutované formy IDH. Mezi ně patří např. BAY-1436032, AGI-5198, IDH305, FT-2102, HMS-101, MRK-A a GSK321. Mezi léčiva povolená americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv patří enasidenib (AG-221) a ivosidenib (AG-120) [116]. K cílení aktivity MDH byl doposud využit např. metyl- -3- (3- (4- (2,4,4-trimethylpentan-2-yl) fenoxy) propanamido) benzoát neboli sloučenina 16c [117] či 4- (3,4-difluorfenyl) thiazol-2-amin [118]. Možné cílení aktivity LDH bylo popsáno výše.

Oportunistické zdroje nutrientů – kanibalizmus

Neoplastický růst a mnoho charakteristických vlastností nádorů jsou způsobeny rozbitím regulačních molekulárních sítí vytvořených během vzniku mnohobuněčnosti. Narušení komunikace a koordinace mezi různými typy buněk ve tkáních může způsobovat rozvoj nádorů, jelikož přechod od jednobuněčnosti k mnohobuněčnosti zanechal ve struktuře regulačních sítí citlivá místa. Mnoho vlastností typických pro mnohobuněčný organizmus je při onkogenezi utlumeno, zatímco geny sahající až k jednobuněčným předkům jsou během transformace často aktivovány a/nebo jsou vyžadovány pro udržení nádorového fenotypu. Mezi nádorovými buňkami a jednobuněčnými organizmy lze nalézt mnoho fenotypových podobností vč. spíše kompetitivního než kooperativního růstu buněk, závislosti na fermentačních procesech a zvýšené genomové nestability připomínající mutátorové fenotypy jednobuněčných organizmů [119,120]. Předpokládá se, že tato reaktivace starobylých drah je vyvolána závažným environmentálním stresem, jako je deprivace živin, hypoxie, reaktivní formy kyslíku a nízké pH. Selekční priorita se poté přesouvá spíše k přežití jednotlivé buňky než k přežití organizmu, což podporuje maligní transformaci [119]. Známku regrese k primitivnějšímu životnímu stylu podobnému jednobuněčným mikroorganizmům, jako jsou améby, může představovat např. kanibalizmus. Nádorové buňky, stejně jako jednobuněčné organizmy, umí pohlcovat živiny ze svého okolí, a to vč. proteinových shluků či celých buněk. Silnou kanibalistickou aktivitu vykazují např. buňky maligního melanomu, které dokážou pohltit a strávit T lymfocyty i sousední živé nádorové buňky. Kanibalizmus je zřejmě důležitou metabolickou adaptací maligních nádorových buněk [121]. Mechanizmus, který je základem kanibalistické aktivity nádorových buněk, se do určité míry podobá fagocytóze u jednobuněčného organizmu Dictyostelium discoideum, při které je nutná účast fagocytického receptoru Phg1A. Phg1A se v jiných organizmech také nazývá transmembránový protein 9 (TM9) a patří do vysoce konzervativní rodiny transmembránových proteinů. U metastatických buněk melanomu je produkt genu TM9SF4 vyžadován při pohlcování kvasinek a živých lymfocytů a jeho inaktivace potlačuje kanibalistickou aktivitu melanomu. Nádorové buňky mohou pomocí mechanizmů zahrnujících aktin, ezrin a kaveolin 1 aktivně kanibalizovat živé buňky (např. T lymfocyty, neutrofily a NK buňky), mrtvé buňky i neživý materiál (např. umělé mikročástice) [121,122]. Ně­kte­ré studie předpokládají, že by kanibalizmus mohl být formou kompetice mezi nádorovými buňkami a že pohlcené buňky jsou těmi prohrávajícími. Identita pohlcujících („vítězných“) a pohlcených („poražených“) buněk může být diktována aktivitou onkogenu KRAS a mechanickou tuhostí, kdy „měkčí“ nádorové buňky přednostně pohlcují sousední „rigidnější“ buňky [123]. Inhibice ezrinu, kaveolinu či katepsinu B vedla k podstatné inhibici kanibalistické aktivity nádorových buněk [124,125]. Pohlcení a smrt entotických buněk byly významně potlačeny inhibitorem Y27632 [123].

Závěr

Nádorové buňky akumulují metabolické změny, které jim umožňují získat přístup ke konvenčním i méně konvenčním zdrojům živin. Tyto živiny následně využívají k vytváření nové bio­masy a k udržení nadměrné proliferace. Při metastazování a kolonizaci vzdálených orgánů čelí nádorové buňky rychle se měnícím podmínkám vč. změn v dostupnosti různých nutrientů. Buňky, které vykazují vyšší metabolickou flexibilitu a mají schopnost provádět glykolýzu i oxidační fosforylaci, mají většinou vyšší fitness.

Ně­kte­ré z meziproduktů nádorového metabolizmu mohou výrazně ovlivňovat výsledný fenotyp samotných nádorových buněk i dalších buněk přítomných v mikroprostředí nádoru. Nejčastější rysy nádorového metabolizmu zahrnují: (1) deregulovanou absorpci glukózy, acetátu, citrátu a ně­kte­rých aminokyselin; (2) použití produktů glykolýzy, fermentace či meziproduktů Krebsova cyklu pro bio­syntézu, produkci NADPH a regeneraci NAD⁺; (3) zvýšenou poptávku po dusíku; (4) epigenetické změny zapříčiněné akumulací onkogenních metabolitů; (5) vznik metabolické symbiózy a využívání metabolitů k manipulaci TME; (6) použití oportunistických způsobů získávání živin. Zatímco ně­kte­ré nádory vykazují všechny výše zmiňované znaky, mnoho typů nádorů jich exprimuje pouze několik. Specifické metabolické znaky, které vykazují jednotlivé typy nádorů, mohou přispět k lepší klasifikaci nádoru a pomoci při výběru vhodné léčby.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare they have no potential confl icts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.
Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

Obdrženo/Submitted: 21. 5. 2021
Přijato/Accepted: 18. 10. 2021

prof. RNDr. Michal Masařík, Ph.D.
Ústav patologické fyziologie LF MU
Kamenice 5
625 00 Brno
e-mail: masarik@med.muni.cz