Chimérický antigenní receptor T lymfocytů –  genová terapie budoucnosti u nádorových onemocnění?

Souhrn

Chimérické antigenní receptory jsou syntetické, geneticky upravené receptory T lymfocytů. Jejich transfer do autologních T lymfocytů pacienta dokáže tyto lymfocyty cíleně naprogramovat proti specifickým antigenům vyskytujícím se na povrchu maligních buněk. Tento princip se v současnosti rozvinul jako potenciálně slibný přístup v terapii nejprve hematologických malignit a později i solidních nádorů. Byly vyvinuty různé strategie v designu chimérických antigenních receptorů a jejich transferu do T lymfocytů a zdá se, že tyto faktory mají velký dopad na aktivitu výsledných modifikovaných T lymfocytů a následně i na úspěšnost léčby. Jednotlivé proměnné v designu se v současnosti intenzivně testují v nespočetných klinických studiích. V tomto přehledu stručně popíši základní princip a strukturu chimérických antigenních receptorů a postup generování T lymfocytů nesoucích chimérický antigenní receptor.

Klíčová slova:
chimérický antigenní receptor –  CAR-T lymfocyty –  genová terapie –  imunoterapie –  nádorová onemocnění

Vývoj chimérického antigenního receptoru

Imunoterapie nádorových onemocnění přitahuje již nějakou dobu pozornost vědců a lékařů, jelikož nabízí možnost dlouhotrvajících remisí a potenciálně kompletní zničení nemoci. Jednotlivé přístupy zahrnují např. adoptivní transfer nádor infiltrujících T lymfocytů spojený s jejich extrakcí a expanzí ex vivo nebo aplikace monoklonálních protilátek. Rutinně se aplikují (a v klinických studiích nadále testují) protilátky proti povrchovým antigenům specifickým pro nádorové buňky nebo protilátky blokující molekuly jako PD‑ 1 nebo CTLA‑ 4, jež se vyskytují na povrchu T lymfocytů a negativně regulují jejich aktivaci. Tyto metody se ovšem setkávají s řadou překážek, jako je náročnost kultivace nádor infiltrujících lymfocytů, tolerance imunitního systému vůči autoantigenům a nutnost prezentace antigenu v komplexu s hlavním histokompatibilním systémem (major histokompatibility complex –  MHC).

Chimérický antigenní receptor (CAR) představuje kombinaci protilátky a T buněčného receptoru (T-cell receptor –  TCR) [1,2]. Jde o spojení části protilátky vázající antigen s funkčními doménami TCR signálních drah. CAR tak kombinuje v jedné molekule schopnost protilátek rozeznat a vázat antigen se schopností signálních domén aktivovat T lymfocyt [3,4]. CAR receptory jsou schopny na rozdíl od klasického TCR rozeznat a vázat molekuly v nativním stavu na povrchu cílových buněk [5]. Genetická modifikace autologních T lymfocytů pomocí CAR konstruktů tak umožňuje T lymfocytům vázat nádorově specifické povrchové antigeny nezávisle na procesování antigenu uvnitř buňky a prezentaci antigenu na MHC komplexu a překonává tak problém s MHC kompatibilitou a výše zmíněné překážky jiných imunoterapeutických postupů [6].

V průběhu vývoje CARs se zjistilo, že když se ke CAR receptoru připojí více signálních domén stimulujících T lymfocyty, lze dosáhnout větší efektivity takto modifikovaných T lymfocytů. První doménou přidanou ke CAR receptoru byla intracelulární část kostimulační molekuly CD28. Lymfocyty déle přežívají v periferii, ale ne dostatečně dlouho na to, aby mohly zabít všechny nádorové buňky. Teprve přidání další molekuly, CD137 (4- 1BB), by mělo zajistit dostatečnou perzistenci in vivo a vyšší protinádorovou aktivitu [7,8].

Jako první byly CARs testovány na hematologických malignitách. Tyto mají několik výhod: 1. na rozdíl od většiny solidních nádorů je známá celá řada povrchových antigenů exprimovaných specificky na hematologických buňkách; 2. lze snadno monitorovat průběh léčby a odebírat hematologické nádorové buňky a 3. T lymfocyty přirozeně migrují do hematologických orgánů, jako je kostní dřeň či lymfatické uzliny. V současnosti se ovšem aplikace CAR‑ T lymfocytů rozšiřuje i na celou plejádu solidních nádorů. Proces výroby a aplikace CAR‑ T lymfocytů zahrnuje separaci T lymfocytů z krve pacienta a selekci požadované populace. Poté je do buněk vnesen vektor kódující CAR receptor pro příslušný povrchový nádorový antigen a takto geneticky upravené T lymfocyty jsou selektovány a expandovány do populace čítající biliony buněk. Ty jsou následně opět vpraveny do pacienta. Úspěšnost této terapie závisí především na míře exprese CAR receptoru, aktivitě CAR‑ T lymfocytů a délce jejich perzistence v krvi pacienta. Tyto parametry jsou ovlivňovány několika různými faktory, z nichž hlavní roli hrají pravděpodobně samotná struktura CAR receptoru a způsob jeho transferu do autologních T lymfocytů.

Struktura chimérických antigenních receptorů

Extracelulární část CAR receptoru většinou představuje jednořetězcová variabilní část protilátky, konkrétně variabilní část lehkého plus variabilní část těžkého řetězce navzájem spojené linkerem (obr. 1). Tyto variabilní části pocházejí většinou z myších nebo humanizovaných protilátek, popř. jsou uměle syntetizovány a screenovány pomocí fágových knihoven [9]. Na rozdíl od klasického TCR, kde je specifita a aktivace T lymfocytu striktně dána úzkým rozsahem afinity TCR, CARs mají mnohem vyšší a širší rozmezí afinity zaručující vazbu na antigen, aniž by docházelo k nespecifické kros‑ reaktivitě. Z preklinických studií se zdá, že prostorová lokalizace vazebného epitopu má větší efekt na aktivitu CAR než rozdíly v jeho afinitě [10]. Také délka, flexibilita a původ kloubu mezi extracelulární a transmembránovou částí jsou důležité faktory pro správnou aktivitu CAR [11– 13]. V současnosti neexistují žádná obecná pravidla regulující design CAR proti cílovým molekulám, a je proto nutné testovat jednotlivé proměnné v designu empiricky. Doposud bylo vyvinuto několik generací CARs [3,4]. Jednotlivé generace CAR jsou zpravidla rozlišovány podle použitých intracelulárních signálních domén nutných pro aktivaci T lymfocytu. První generace CARs zahrnuje jako signální doménu pouze řetězec CD3 zeta. Druhá generace obsahuje navíc i jednu kostimulační doménu odvozenou buď od molekuly CD28, nebo 4- 1BB. Třetí generace CARs obsahuje dvě kostimulační domény jako CD28 nebo 4-1BB plus doménu dalších kostimulačních molekul. Současné klinické studie se zabývají především testováním CARs druhé a třetí generace, které dosahují delší perzistence CAR‑ T lymfocytů v krvi pacienta a vyšší lymfocytární aktivity. Také transmembránová doména a kloub spojující tuto část s extracelulárním řetězcem mohou hrát důležitou roli při interakci s antigenem, tvorbě imunologické synapse a asociaci CAR s jinými proteiny důležitými pro tvorbu robustního signálu nutného pro plnou aktivaci buňky. Většinou se používá transmembránová část a kloub z molekuly CD8α nebo CD28. Ovšem byly testovány i různě modifikované klouby z FcR oblasti a bylo zjištěno, že jsou schopny vázat Fc receptory a aktivovat buňky vrozeného imunitního systému [11– 13].

Produkce CAR‑ T lymfocytů

Důležitým aspektem při přípravě CAR‑ T lymfocytů je způsob bezpečného a účinného vložení CAR receptoru do autologních T lymfocytů. V současnosti je testováno několik různých metod pro vnesení CAR konstruktu do expandovaných T lymfocytů pacienta [14]. Každý z těchto systémů má své výhody a nevýhody, co se týče míry exprese CARs v buňkách, bezpečnosti systému a finanční náročnosti. Původně byla používána DNA transfekce, jelikož je to technika levná a nehrozí riziko inzerční mutageneze jako v případě virové infekce. Na druhé straně ovšem dosahuje relativně nízké efektivity transferu genu, a proto vyžaduje dlouhodobou kultivaci a selekci transfekovaných lymfocytů pomocí antibiotik. Dlouhodobá kultivace přitom není prospěšná pro aktivitu a perzistenci transfekovaných buněk a vnesené geny pro rezistenci mohou navíc tvořit imunogenní produkty. Užití transpozonových vektorů obsahujících element pro integraci (např. tzv. Sleeping Beauty transpozon) může vést k účinnějšímu integrování transgenu [15– 17]. Tento systém se nyní testuje v různých klinických studiích a zdá se, že vede k účinnějšímu transferu genu a jeho déle trvající expresi [18]. Nejčastěji užívaným systémem vnesení CAR konstruktu je infekce lymfocytů pomocí γ‑ retrovirů. Retroviry lze jednoduše připravit a navíc jsou schopny velmi účinně a permanentně transdukovat lymfocyty. Předběžné výsledky navíc ukazují, že z hlediska integrace do genomu je retrovirová infekce do primárních lidských lymfocytů bezpečná [19]. Nevýhodou retroviru může potenciálně být utlumení exprese CARs z důvodu utlumení LTR oblasti integrovaného retrovirového konstruktu. V jistém kontextu se toto ovšem může stát výhodou terapie. Pravděpodobně bezpečnější než retroviry z hlediska místa integrace je infekce pomocí lentivirových vektorů, které jsou také schopny efektivně a stabilně transdukovat T lymfocyty [20]. Použití specifických promotorů ve spojitosti s lentivirovými vektory dosahuje stabilní exprese CAR konstruktů na povrchu transdukovaných T lymfocytů a déle trvající perzistenci funkčních CAR‑ T lymfocytů in vivo.

Také způsoby kultivace T lymfocytů a její délka mohou být důležitým faktorem přispívajícím ke kvalitě konečného produktu CAR‑ T lymfocytu. Obyčejně se používá expanze lymfocytů pomocí stimulace anti‑TCR protilátkami plus podpůrnými cytokiny, což udržuje centrální paměťový fenotyp T lymfocytů, nebo pomocí umělých antigen‑ prezentujících buněk [21,22]. Expandované CAR‑ T lymfocyty jsou poté vpraveny zpět do pacienta a je monitorována délka jejich perzistence v periferii, aktivita a progres nemoci.

Autor deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Michal Šmída, Ph.D.

CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU

Kamenice 753/5

625 00 Brno

e-mail: michal.smida@ceitec.muni.cz

Obdrženo: 1. 9. 2015

Přijato: 16. 9. 2015