Význam minimální zbytkové nemoci u chronické lymfocytární leukemie

Souhrn

S příchodem nových a vysoce účinných léčebných postupů do terapie chronické lymfocytární leukemie nabývá na významu analýza minimální reziduální nemoci. Minimální reziduální nemoc získává u chronické lymfocytární leukemie význam jako prediktivní faktor, nicméně její důležitost je v mnoha klinických situacích stále nejasná. Roli minimální reziduální nemoci ovlivňují především tyto faktory: metoda použitá k detekci minimální reziduální nemoci, léčebný režim, vyšetření z periferní krve vs. kostní dřeně nebo časový bod, kdy byl proveden odběr vzorku na analýzu minimální reziduální nemoci. Vysoce senzitivní metody, které dnes ke kvantifikaci minimální reziduální nemoci používáme, dosahují citlivosti 10^– 4– 10^– 5. Jde o metody ASO‑PCR (allele‑ specific oligonucleotide polymerase chain reaction) a vícebarevnou průtokovou cytometrii. Postavení minimální reziduální nemoci v běžné hematologické praxi není bohužel stále ještě jasně definováno.

Klíčová slova:
chronická lymfocytární leukemie –  minimální reziduální nemoc –  prognostické faktory –  průtoková cytometrie –  přežití bez progrese

Úvod

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je stále i přes značné pokroky v určení prognózy nemoci a pokroky v její terapii v posledních 15 letech považována za nevyléčitelné onemocnění, tedy s výjimkou alogenní transplantace krvetvorných buněk [1]. Ale i přesto se ukazuje, že nové možnosti léčby, především nové typy kombinované chemoimunoterapie, dokáží u nemocných s CLL navodit hlubokou léčebnou odpověď. Čím větší masu maligních buněk se podaří odstranit, tím větší je pravděpodobnost prodloužené doby do progrese nemoci (progression‑free survival –  PFS) a celkového přežití (overall survival –  OS).

K detekci reziduálních leukemických buněk (minimální reziduální nemoc –  MRN) u nemocných s výbornou léčebnou odpovědí je zapotřebí použít citlivé metody. Zatím ale není zcela jasné, zda i u CLL bude detekce MRN tak významná, jako je tomu v případě akutní promyelocytární leukemie [2,3], akutní lymfoblastické leukemie [4,5], akutní myeloidní leukemie [6] a samozřejmě chronické myeloidní leukemie [7]. Jisté je, že eradikace MRN je nezbytnou podmínkou pro vyléčení hematologické malignity, nicméně každá negativita MRN se automaticky nerovná vyléčení, což je u CLL zřejmější snad ještě více než u ostatních leukemií (graf 1) [8– 11].

Podrobně se sledování MRN u CLL věnuje řada prací, včetně českých [12]. V roce 2010 byl k tomuto tématu publikován zevrubný přehled pražských autorů [13]. Tato práce si klade za cíl na přehled pražských autorů navázat předložením nových poznatků o postavení detekce MRN u CLL. Stále totiž v této oblasti není jasno. Základní otázka, která se týká MRN u CLL, zní i v dnešní době značných pokroků v oblasti bio­logie a léčby CLL takto: Má léčba CLL směřovat k eradikaci MRN? A pokud ano, v jakých případech?

Metody detekce MRN u CLL

Ke zjištění MRN u CLL je zapotřebí metod, které jsou citlivější než konvenční cytologie, histologie či základní analýza průtokovou cytometrií.

V současné době jsou ke sledování MRN u CLL využívány tyto metody: ASO‑PCR (allele‑ specific oligonucleotide polymerase chain reaction) s primery individuálně navrženými pro každého pacienta a průtoková cytometrie [14– 18]. Dříve používané polymerázové řetězové reakce (PCR) s využitím konsenzuálních (consenzus, univerzálních) primerů k určení klonality IgH řetězců se pro nízkou senzitivitu již nepoužívá [13]. Vzhledem k absenci specifického molekulárně genetického markeru (jaké představují např. fúzní geny či mutace genů akutní myeloidní leukemie, chronické myeloidní leukemie nebo akutní promyelocytární leukemie) nemohou být tyto aberace ke sledování MRN u CLL využity. Metody sledování MRN u CLL jsou v podstatě shodné s metodami používanými pro detekci MRN u akutní lymfoblastické leukemie [5].

Průtoková cytometrie

Průtokovou cytometrií (FCM) byly původně CLL buňky identifikovány jen na základě koexprese znaků CD5 a CD19 [19]. Toto vyšetření je ale značně nepřesné [14]. Velmi citlivou detekci MRN může poskytnout analýza čtyřbarevnou FCM, která umožní detekovat jednu nádorovou buňku až z 10^– 4– 10^– 5 leukocytů [16,17]. Pracovní skupina ERIC (Evropská výzkumná iniciativa pro CLL) navrhla čtyřbarevné kombinace monoklonálních protilátek umožňující identifikaci CLL buněk s limitem detekce 0,01 % z leukocytů pro CLL s typickým imunofenotypem (přesnost 96,7 %, senzitivita 91,1 % a specificita 98,8 %). Předpokladem k dosažení uvedených parametrů je ale naměření dostatečného počtu událostí (500 000 leukocytů na zkumavku) a důkladná znalost charakteristiky „gatovaných“ populací CLL buněk umožňující správné vyhodnocení [16]. Srovnatelných výsledků lze dosáhnout při užití doporučených klonů jednotlivých monoklonálních protilátek. Antigeny, proti kterým jsou monoklonální protilátky při testování MRN pomocí čtyřbarevné FCM namířeny, ukazuje tab. 1. Ve snaze snížit pracnost a časovou náročnost prováděného vyšetření byl opět z popudu ERIC zveřejněn standardizovaný přístup ke sledování MRN pomocí šestibarevné FCM [17] a v současné době se pracuje na přípravě publikace o sledování MRN pomocí osmibarevné FCM (odesláno k publikování, osobní komunikace).

Osmibarevnou FCM detekci MRN u CLL navrhlo rovněž brněnské pracoviště [18]. Osmibarevná FCM měla 100% shodu se čtyřbarevnou FCM a silně korelovala rovněž s výsledky ASO‑PCR v reálném čase (r = 0,94).

Výsledkem FCM analýzy je stanovení procenta CLL buněk z leukocytů s uvedením limitu detekce pro dané měření (podstatné zejména u MRN negativních výsledků).

Největšími výhodami sledování MRN pomocí FCM jsou rychlost vyšetření, fakt, že pro vyšetření není nutné mít vstupní vzorek pacienta (znalost vstupního imunofenotypu je ale vhodná především u pacientů s atypickým imunofenotypem), a to, že metodiku lze s minimálními úpravami aplikovat na jakýkoliv průtokový cytometr s možností vícebarevné analýzy.

Polymerázová řetězová reakce

Technika detekce MRN pomocí konsenzuálních primerů pro jednotlivé IgVH rodiny má relativně nízkou senzitivitu (10^– 3) a je považována za překonanou [13]. Díky sekvenačnímu vyšetření přestavby IgVH (gen pro těžký řetězec imunoglobulinů) identifikované při diagnóze však máme možnost sledovat reziduální maligní populaci s vysokou senzitivitou a specifitou pomocí individuálních, pacient‑ specifických primerů (ASO‑PCR). Příprava eseje je založena na navržení klon‑ specifických primerů a vyklonování standardu, který je v průběhu času používán k přesné kalibraci eseje. Každou esej je nutné před použitím otestovat pro detekční limit senzitivity [12,13,20]. Použije‑li se jako templát DNA, dosahuje senzitivita analýzy MRN hodnoty 10^– 4, což odpovídá senzitivitě detekce MRN pomocí FCM. Při použití RNA (cDNA) jako templátu lze senzitivitu detekce MRN zvýšit až o 3– 4 řády. Nevýhodou práce s RNA je ale fragilita této molekuly s nutností rychlejšího transportu do laboratoře. Detaily molekulárně genetické analýzy byly popsány v řadě publikací [20,21].

Samozřejmou součástí analýzy MRN pomocí FCM či PCR je kontrola kvality (vzájemné korelace, mezilaboratorní kontroly s výměnou vzorků, optimalizace vyhodnocování již naměřených dat v případě FCM).

Klinický význam sledování MRN u CLL

Výsledky klinických studií

O významu dosažení MRN negativity u CLL pro prodloužení PFS nás informuje už práce z roku 2003, v níž bylo dokumentováno, že konsolidace alemtuzumabem vede k navození negativity MRN u 38 % pacientů a PFS nemoci u těchto nemocným je významně delší než PFS u pacientů s přetrvávající MRN pozitivitou [22]. Ke stejným výsledkům dospěly i další studie používající alemtuzumab v konsolidační léčbě CLL [23,24]. Studie Montilla et al prokázala navíc význam negativity MRN pro prodloužení OS [24]. Rovněž rituximab přidaný k léčbě CLL jako maintenance vedl k navýšení počtů negativit MRN [25,26]. Přidání rituximabu do udržovací terapie CLL vedlo k dosažení 70 % MRN negativních remisí. U MRN negativních pacientů pak bylo zjištěno delší PFS (77 vs. 36 % ve 2,5 letech) a dokonce i OS (89 vs. 72 % ve 3 letech) [25].

V rámci klinických studií s novými kombinacemi chemoimunoterapie, novými monoklonálními protilátkami či novými léky jako jsou inhibitory signálních drah B buněčného receptoru (BCR signalizace) je analýza MRN prováděna v současné době téměř rutinně. Seznam vybraných studií [27– 33], u nichž bylo prováděno měření MRN, podává tab. 2.

Uvedené klinické studie [27– 33] ukazují, že MRN negativity bývá daleko častěji dosahováno u nemocných léčených chemoimunoterapií než u nemocných léčených novými inhibitory BCR signalizace, ať již v monoterapii nebo v kombinaci s rituximabem. Nemocní léčení inhibitory BCR signalizace v monoterapii dosahují především parciálních remisí. V případě použití ibrutinibu, jednoho z inhibitorů BCR signalizace, v monoterapii dochází navíc u pacientů s CLL k lymfocytóze, která hodnocení MRN může komplikovat [34]. Je ale pravda, že výsledky těchto studií nelze dobře srovnávat (soubory pacientů jsou odlišné, dávkování a terapeutická schémata jsou naprosto rozdílná, hodnocení léčebné odpovědi je prováděno v jiných časových intervalech a měření MRN využívá různých metod).

Senzitivita MRN je vyšší při vyšetření kostní dřeně ve srovnání s periferní krví [27], většina hodnocení MRN v běžné praxi ale probíhá z periferní krve.

Allogenní transplantace

I přes povzbuzující data uvedená výše má i v současné běžné hematologické praxi analýza MRN u CLL nezpochybnitelné místo jen u pacientů po alogenní transplantaci krvetvorných buněk [1,35– 37]. Alogenní transplantace představuje v současné době jediný potenciálně kurativní přístup k léčbě CLL a jejím prostřednictvím lze dosáhnout dlouhodobého vymizení MRN dokonce u pacientů s nežádoucími prognostickými znaky [1,35– 37]. Na základě nové pozitivity MRN po alogenní transplantaci krvetvorných buněk lze indikovat léčbu již v případě tohoto počínajícího relapsu, což je rozdíl oproti konvenčně léčeným pacientům, u nichž se relapsy detekované na základě MRN neléčí (neléčí se ani hematologické relapsy, nesplňují‑li standardní kritéria zahájení terapie) [38,39].

Význam měření MRN u CLL pro běžnou praxi

Doporučený postup pro diagnostiku a terapii CLL Mezinárodní pracovní skupiny pro CLL (International Workshop on CLL) zatím neuvádí měření MRN jako nutnou podmínku hodnocení léčebné odpovědi, avšak doporučují zařadit sledování MRN do klinických studií, jejichž cílem je dosáhnout co nejhlubší a nejdéle trvající léčebné odpovědi, a samozřejmě použít ke sledování MRN po alogenní transplantaci [40].

V současné době je ale již nezpochybnitelné, že dosažení negativity MRN je příznivý nezávislý prediktivní faktor CLL (alespoň co se týká PFS). Aktuálně je ve schvalovacím procesu doporučení Evropské lékové agentury (EMA), který umožní v rámci klinických studií využití měření MRN jako náhradní cíl místo sledování PFS, což může významně zrychlit proces klinického hodnocení. Není však dořešena otázka, zda velký selekční tlak, který vyvíjíme s cílem dosáhnout MRN negativity u většiny nemocných, nevede rovněž k selekci malignějších klonů nemoci, a tedy i k daleko agresivnějšímu a obtížněji léčitelnému průběhu následného relapsu onemocnění [41]. Navíc toxicita intenzivnější terapie může být rovněž nezanedbatelná [23,24].

Česká skupina pro chronickou lymfocytární leukemii i Česká leukemická skupina pro život proto v současnosti vydávají následující doporučení, které se týká MRN u CLL: Sledování MRN v periferní krvi či kostní dřeni metodami s citlivostí minimálně 10^– 4 (pomocí FCM nebo ASO‑PCR) je vhodné zvážit u nemocných léčených intenzivní léčbou (např. kombinované fludarabinové režimy, alemtuzumab, režimy s novými monoklonálními protilátkami a alogenní transplantace). Dosud se nejedná o vyšetření povinné, ale význam MRN v budoucnu pravděpodobně významně vzroste. Vhodné je především u pacientů po alogenní transplantaci krvetvorných buněk [38,39].

Závěr

Na základě výše uvedených informací je možné otázku analýzy MRN u CLL shrnout následovně:

1. Dosažení MRN negativity u CLL je možné, a to nejen po alogenní transplantaci krvetvorných buněk.
2. Vyšetření MRN z kostní dřeně má větší senzitivitu než z periferní krve.
3. MRN negativity je častěji dosahováno pomocí chemoimunoterapie než s využitím nových molekul, jako jsou inhibitory BCR signalizace [33,42], zatím ale není jasné, bude‑li mít tento fakt nějaký význam pro osud nemocných a běžnou klinickou praxi.
4. Řada prací ukazuje, že dosažení MRN negativity prodlužuje nemocným PFS (dle některých menších prací i OS). MRN tak může být použito jako další prediktivní marker u CLL.
5. Na druhou stranu nová MRN pozitivita po předešlé negativitě se u pacientů s CLL neléčí (s výjimkou pacientů po alogenní transplantaci krvetvorných buněk), a tak pravidelné měření MRN po terapii nepřináší nemocným v běžné hematologické praxi zatím žádnou výhodu.
6. Dosud není dořešena otázka, zda snaha po co nejvyšším procentu dosažených MRN negativit pomocí intenzivní terapie nepovede také ke zvýšení tlaku, jenž bude mít za následek daleko větší selekci malignější klonů CLL, a tedy daleko agresivnější průběh relapsu nemoci po takovéto léčbě.

Autor deklaruje, že v souvislosti s předmětem studie nemá žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

prof. MUDr. Michael Doubek, Ph.D.

Interní hematologická a onkologická klinika

LF MU a FN Brno

Jihlavská 20625 00 Brno

e-mail: mdoubek@fnbrno.cz

Obdrženo: 29. 7. 2015

Přijato: 4. 8. 2015