Jaký je prognostický význam molekulárně genetických faktorů u karcinomu endometria?

Souhrn

Východiska:
Kritické zhodnocení významu vybraných molekulárně genetických ukazatelů u karcinomu endometria na základě analýzy dosud publikovaných prací a u K- ras mutace též prezentace vlastních výsledků. Cílem původní části práce bylo porovnat výskyt této mutace v tkáni karcinomu oproti zdravému endometriu u pacientek léčených na našem pracovišti a posléze i zhodnocení jejího podílu na vzniku tohoto onemocnění v rámci multivariační analýzy. 

Materiál a metody:
Byla provedena molekulárně bio­logická analýza vzorků endometriální tkáně pacientek léčených na Porodnické a gynekologické klinice Fakultní nemocnice v Hradci Králové. Vyšetření mutací genu K- ras bylo provedeno z DNA získané z formalinem fixovaných a v parafinu zalitých vzorků. K detekci byla použita metoda K- ras StripAssay™, ViennaLab Diagnostics GmbH. 

Výsledky:
Bylo vyšetřeno 30 vzorků endometroidního karcinomu ve stadiu I (dle FIGO), mutace genu K- ras byla prokázána v 7 případech (23 %). V kontrolní skupině 20 vzorků normálního endometria byla sledovaná mutace nalezena ve 3 případech (15 %). Mutace se častěji vyskytovala u stadia IA a ve skupině dobře diferencovaných nádorů. 

Závěr:
Význam molekulárně genetických faktorů u karcinomu endometria se přelomově liší v závislosti na typu nádoru. U častějších endometroidních nádorů prvního typu nejsou dosud publikované výsledky zdaleka tak jasné jako u karcinomů druhého typu, kde je výskyt alterace p53 uváděn až v 90 %. Naše výsledky u představitelek místní populace podporují teorii o možném podílu K- ras mutace v procesu endometriální karcinogeneze u nádorů prvního typu ve smyslu časné události. 

Klíčová slova:
karcinom endometria –  gen K- ras –  mutace

Úvod

Karcinom endometria je po karcinomu prsu nejčastější gynekologickou malignitou a jeho incidence neustále narůstá.

Ze zemí Evropské unie je jeho výskyt v České republice nejvyšší.

Od roku 1983 platí dualistická Bokhmanova teorie modelu karcinogeneze endometria, která vychází z klinického pozorování a histopatologických charakteristik [1]. Asi o deset let později byla tato dosud platná teorie podpořena studiemi na molekulární úrovni. Charakteristika obou základních subtypů souvisí i s odlišnou genetickou nestabilitou a molekulárními změnami [2].

U endometroidního karcinomu (typ I) jsou nejčastěji popisovány mutace PTEN tumor- supresorového genu [3], mikrosatelitální instabilita [4], mutace K- ras protoonkogenu [5] a β- cateninu [6]. Pro karcinomy typu II je charakteristická porucha funkce tumor- supresoru p53 a ně­kte­ré práce uvádějí, že gen p53 je alterován až v 90 % serózních karcinomů endometria [7]. Na rozdíl od typu I jsou u typu II vzácně popisované mutace K- ras , β- cateninu , dále mikrosatelitální instabilita a inaktivace p16 [2,8– 11].

V původní části naší práce jsme se zaměřili na úlohu mutace K- ras genu v patogenezi endometroidního typu karcinomu endometria.

K- ras patří do rodiny onkogenů ras, které jsou nejčastěji spojovány se vznikem lidských maligních nádorů. Ras proteiny jsou součástí buněčné membrány a vykazují GTPázovou aktivitu. Podílejí se na spouštění růstu a diferenciaci buňky. Mutovaný K K- ras protein ztrácí schopnost spontánní inaktivace, což způsobí trvalou stimulaci buněčného růstu [12]. Z dostupných prací se mutace K- ras genu vyskytuje u 10– 30 % případů endometroidního karcinomu [5,13], a to nejčastěji u nádorů středně a nízce diferencovaných [14]. To, že je mutace též přítomna asi v 16 % případů hyperplastického endometria, podporuje hypotézu o časné události v procesu karcinogeneze v této lokalizaci [15]. Jiné zdroje však naopak uvádějí možný vznik karcinomu endometria za přispění mutovaného K K- ras protoonkogenu bez stadia hyperplazie [16].

Materiál a metody

Byla provedena molekulárně bio­logická analýza 50 vzorků endometriální tkáně pacientek vyšetřených a léčených na Porodnické a gynekologické klinice LF UK a FN v Hradci Králové. Vzorky byly získány z archivu Fingerlandova ústavu patologie LF UK a FN v Hradci Králové, stáří vyšetřovaného materiálu nepřesáhlo 5 let. Vyšetřeno bylo 30 vzorků s endometroidním karcinomem ve stadiu I dle FIGO klasifikace. Dále byla vyšetřena kontrolní skupina 20 vzorků normálního endometria pacientek operovaných pro jinou, nezhoubnou diagnózu dělohy. Tyto vzorky byly histopatologem hodnoceny jako proliferační, sekreční či klidové endometrium. Do kontrolní skupiny nebyl zařazen žádný vzorek hyperplastického endometria. Vyšetření mutací genu K- ras bylo provedeno z DNA získané z formalinem fixovaných, v parafinu zalitých vzorků tkání. DNA z parafinového bločku byla izolována pomocí kitu firmy Qiagen. Vlastní vyšetření K- ras mutace bylo realizováno metodou K K- ras StripAssay™ (ViennaLab Diagnostics GmbH). Tento test zahrnuje vyšetření 10 mutací v K- ras genu (kodon 12 a 13). PCR amplifikace s využitím bio­tinylovaných primerů byla provedena dle protokolu výrobce, pro analýzu bylo použito 25 ng izolované DNA. Amplifikace byla uskutečněna v termocykléru Veriti (Applied Biosystems, CA). Amplifikační reakce využívala teplotní profil: 94 °C 2 min, 35 cyklů (94 °C 1 min, 70 °C 50 s, 56 °C 50 s, 60 °C 1 min) a 60 °C 3 min. Amplifikaci následovala kontrolní elektroforéza na 2% agarosovém gelu (délky PCR produktů 151 bp a 204 bp). Amplifikované produkty byly dle protokolu výrobce hybridizovány na testovací strip (proužek) obsahující alelově specifické imobilizované oligonukleotidové proby. Navázané bio­tynilované sekvence byly detekovány s využitím streptavidin alkalické fosfatázy a barevného substrátu.

Ke statistickému zpracování získaných dat byl použit χ² test.

Výsledky

Vlastní soubor sestával ze 30 karcinomů a 20 zdravých kontrol. Věkový medián pacientek s karcinomem byl 65 roků (rozmezí 52– 77 roků) a 56 roků (rozmezí 50– 79 roků) u pacientek kontrolní skupiny.

Vyšetřeno bylo 30 vzorků endometroidního karcinomu ve stadiu I (dle FIGO), mutace genu K- ras byla prokázána v 7 případech (23 %). V kontrolní skupině 20 vzorků normálního endometria byla sledovaná mutace nalezena ve 3 případech (15 %). Se spolehlivostí 0,95 je rozmezí výskytu mutace pro ženy s endometroidním karcinomem 10 % až 42 %, pro zdravé ženy je to 3 % až 38 %. Rozdíl mezi četností výskytu mutace v obou skupinách je však statisticky nevýznamný.

S ohledem na jednotlivá stadia a grade nádoru se mutace častěji vyskytovala ve stadiu IA a ve skupině dobře diferencovaných nádorů (tab. 1 a 2).

V kontrolní skupině byla sledovaná mutace popsána ve 3 vzorcích. Ve dvou případech se jednalo o normální proliferační endometrium a v jednom o klidové endometrium u postmenopauzální ženy.

Diskuze

Kromě zcela základních charakteristik, ze kterých obvykle vycházíme (stupeň postižení, typ nádoru a grading), existuje řada dalších ukazatelů, které mohou mít svoji prognostickou významnost. Nejinak je tomu u karcinomu endometria. Gynekologické zhoubné nádory představují skupinu chorob, u kterých je prognóza závislá také na subtilních genomických, epigenetických a proteomických změnách.

Tab. 3 ukazuje nejčastěji se vyskytující genetické alterace karcinomu endo­metria (typ I, II).

Ve vztahu k molekulární genetice je výrazněji profilován druhý typ karcinomu, který je méně častý a prognosticky horší (nevzniká na podkladě hyperplazie a není závislý na estrogenní stimulaci). Tento typ karcinomu je molekulárně geneticky charakterizován mutacemi genu p53 a četnými ztrátami heterozygozity. Ně­kte­ré práce uvádějí, že gen p53 je alterován až u 90 % serózních karcinomů [7]. Podle jiných autorů je mutace genu p53 dvakrát častěji popisována u tumorů bez přítomnosti hyperplazie (estrogen non dependentních) než u tumorů s hyperplazií (estrogen dependentních) [16,17]. Zvýšená exprese p53 koreluje se špatnou diferenciací nádorů endometria, hloubkou myo­metriální invaze, pokročilým stadiem a metastatickým šířením [18,19].

Naopak zdaleka ne tak jasná je situace u prvního typu karcinomu, který vzniká na podkladě atypické hyperplazie a je podmíněn estrogenní stimulací. Stále není jasně prokázáno, která ze změn maligní transformaci iniciuje. Zdá se, že většina genetických alterací charakteristických pro toto nádorové onemocnění vzniká již na počátku tumorigeneze. Nejčastěji se vyskytující genetickou poruchou u endometriálního karcinomu je mutace PTEN tumor- supresorového genu, která je popisována u 25– 83 % všech tumorů [20]. Zatímco u jiných typů nádorů je tato alterace genu PTEN asociována s pokročilým onemocněním včetně metastatického postižení, u karcinomu endometria je tomu naopak a ztráta funkce PTEN genu je považována za časnou událost a navíc je spojována s velmi dobrou prognózou [21]. K nejčastěji popisovaným molekulárním abnormitám u endometroidního typu karcinomu patří spolu s mutací genu PTEN také mikrosatelitální instabilita (MI) způsobená poruchou funkce DNA mismatch repair (MMR) genů. Několik prací uvádí shodu ve výskytu MI a PTEN mutací; mutace je popisována u 60– 86 % MI pozitivních endo­metroidních karcinomů a pouze u 24– 35 % tumorů, kde MI prokázána nebyla. Pro sporadické formy endometroidního karcinomu je typická inaktivace MMR genu MLH1 následovaná poruchou exprese genů MSH2 a MSH6 [22]. Přítomnost MI je asociována s dobrou prognózou endometroidního karcinomu [8,23]. b- catenin je další z genů, jehož porušená funkce je spojována s procesem endometriální karcinogeneze. Jeho mutace je signifikantně častěji popisována u endometroidních lézí (31– 47 %) ve srovnání s non endometroidním typem nádorů (0– 3 %) [24]. Jiné práce uvádějí častější výskyt u endometriální hyperplazie, což by svědčilo pro podíl této mutace v časné karcinogenezi [25]. Her2/ neu patří do skupiny protoonkogenů, jehož overexprese je popisována u 10– 20 % endometroidních karcinomů se středním a nízkým stupněm diferenciace a ně­kte­rými autory je dávána do souvislosti s progresí onemocnění a horší prognózou. Mutace je dále popisována u 9– 30 % serózních karcinomů a spolu s alterovaným genem p53 je asociována s velmi špatnou prognózou u non endometroidního typu nádorů [26,27].

Z dostupných pramenů je patrné, že mutace K- ras protoonkogenu je detekována u 10– 30 % případů endometroidního karcinomu [5,13]. Také výsledky naší práce potvrzují účast mutace K- ras genu v procesu vzniku karcinomu endometria ve smyslu časné události [28,29]. Prezentace dosavadních výsledků o K- rasmutaci u karcinomu endo­metria a prognostický význam tohoto ukazatele však nejsou jednotné. Například S. F. Lax ve své práci připouští, že pro vznik endometroidního karcinomu lze použít podobný model patogeneze jako u kolorektálního karcinomu. Působení K- ras mutace přichází v úvahu jednak na úrovni přechodu z atypické hyperplazie do dobře diferencovaného endometroidního karcinomu, ale především potencuje progresi do méně diferencovaných forem nádoru [9]. Z práce Mizuuchiho et al (n = 49) vyplývá, že K- ras mutace je nezávislý rizikový faktor odpovědný za agresivní chování endometriálního karcinomu [30]. Podobného názoru jsou i Ito et al (n = 221), kteří mutaci K- ras signifikantně spojují s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách a předpokládají její důležitou roli v mechanizmu odpovědném za nepříznivé bio­logické chování endometroidního karcinomu u postmenopauzálních pacientek [31].

Semczuk et al (n = 57) na souboru pacientek s karcinomem endometria neprokázali souvislost přítomnosti K- ras mutace s věkem, stadiem, hloubkou invaze ani gradingem nádoru. Data podporují hypotézu o náhodné aktivaci K- ras genu v lidském neoplastickém endometriu a dále autoři naznačují, že by průkaz mutovaného protoonkogenu mohl být negativním prognostickým faktorem [32]. Naproti tomu práce kolektivu Esteller et al (n = 55) dokazuje, že K- ras mutace je relativně běžnou událostí v procesu endometriální karcinogeneze, ale bez jasného prognostického významu [33]. Ani Jones et al (n = 32) neprokázali vliv přítomnosti K- ras mutace na prognózu onemocnění. Autoři srovnávali výskyt mutace p53 a K- ras a jejich vztah k celkovému přežití pacientek s karcinomem endometria, kdy mutace p53 silně korelovala s krátkým přežitím, K- ras však nikoli [34]. Studie autorů Pijnenborga et al (n = 44) se zabývala otázkou K- ras mutace u recidivujícího endometriálního karcinomu, kdy nebyl pozorován vliv této mutace na vznik recidivy onemocnění [35]. Několik prací se zabývalo také problematikou mutovaného K- ras genu u žen léčených Tamoxifenem. Prasad et al (n = 29) porovnávali pacientky s karcinomem endometria vzniklým při léčbě Tamoxifenem s pacientkami se sporadickým endometriálním karcinomem, kdy nebyl prokázán statistický rozdíl mezi četností výskytu mutace u obou vyšetřovaných skupin [36]. Tsujioka et al (n = 28) prokázali mutovaný K- ras gen u 46 % pacientek léčených Tamoxifenem. Po zastavení léčby u pacientek mutace již prokázána nebyla. Z práce vyplývá, že ukončení léčby Tamoxifenem by mohlo redukovat riziko vzniku karcinomu endometria cestou mutovaného genu K- ras [37].

V porovnání se sporadickými formami endometriálního karcinomu je genetické pozadí u hereditárních forem nádoru mnohem méně prozkoumané. Jedná se především o endometriální karcinomy vznikající v souvislosti s Lynchovým syndromem neboli HNPCC (hereditary nonpolyposis colorectal cancer). Endometriální karcinom je nejčastější malignita, která se u pacientek s Lynchových syndromem vyskytuje [38]. Lynchův syndrom je spojován s mutací genů patřících do rodiny mismatch repair (MMR), např. MLH1, MSH2, MSH6, PMS1 nebo PMS2 [39]. Zdá se, že mechanizmus vzniku endometriálního karcinomu v rámci HNPCC je důsledkem poruchy odlišných genů, než je tomu u kolorektálního karcinomu. Inaktivace komplexu genů MSH2/ MSH6 hraje pravděpodobně zásadní roli v procesu karcinogeneze [40]. Další genetickou alterací, která se uplatňuje v nádorovém procesu, je mutace PTEN genu, která se vyskytuje asi v 90 % případů endometriálního karcinomu u pacientek s Lynchovým syndromem [41].

Závěr

Prognostický význam molekulárně genetických faktorů u karcinomu endometria se přelomově liší v závislosti na typu nádoru. Jasně je definován u tumor-supresorového genu p53 a nádorů druhého typu, kde koreluje s horší prognózou. U častějších endometroidních nádorů prvního typu však nejsou dosud publikované výsledky zdaleka tak jasné. Jako nejčastější událost na této úrovni je u nich popisována mutace genu PTENa mikrosatelitální instabilita.

Naše výsledky u představitelek místní populace podporují teorii o možném podílu K-ras mutace v procesu endometriální karcinogeneze u nádorů prvního typu ve smyslu časné události.

Práce byla podpořena grantem Grantové agentury Univerzity Karlovy č. 157310.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

MUDr. Eva Křepinská

Porodnická a gynekologická klinika

LF UK a FN v Hradci Králové

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: evajurkova@seznam.cz

Obdrženo: 12. 12. 2011

Přijato: 27. 6. 2012