Potenciál indukovaných pluripotentných kmeňových buniek v štúdiu a liečbe monogénového diabetu

Souhrn

MEHMO a Wolframov syndróm sú z kategórie monogénových ochorení, u ktorých jedným z príznakov je aj neauto­imunitný diabetes mellitus. Oba syndrómy sa zaraďujú medzi vzácne ochorenia. Získanie pacientskych B-buniek, na ktorých by bolo možné lepšie preštudovať mechanizmus vzniku ochorenia, je zložité až nemožné. Nové možnosti štúdia diabetu prináša metóda reprogramovania somatických buniek na bunky kmeňové a ich následná diferenciácia na B-bunky pankreasu. Takto pripravené B-bunky pankreasu by mohli byť využité nie len na vedecké štúdie, ale aj na bunkovú terapiu pacientov s monogénovým, prípadne polygénovým typom diabetu.

Klíčová slova:

ľudské indukované pluripotentné kmeňové bunky (hiPSC) – MEHMO – monogénový diabetes – Wolframov syndróm

Úvod

Monogénová forma diabetes mellitus. Monogénová forma diabetu je samostatná skupina v kategórii „špecifické typy diabetu“ podľa klasifikácie Americkej diabetologickej asociácie (ADA) [1]. Monogénový diabetes vzniká v dôsledku patologického variantu v jednom géne. Samotný klinický prejav závisí od patologického účinku danej mutácie. Pre monogénové formy diabetu je charakteristický rodinný výskyt ochorenia, prejavenie ochorenia v mladom veku a neprítomnosť autoimunitných protilátok (okrem prípadov monogénového autoimunitného diabetu), čím sa zároveň odlišujú od polygénových foriem diabetu [2].

Najaktuálnejšia klasifikácia podľa International Society for Pediatric and Adolescent Diabetes ISPAD [3], rozdeľuje typy monogénového diabetu u mladistvých na 4 kategórie:

neonatálny diabetes mellitus (nástup diabetu do 6 mesiacov od narodenia)

hyperglykémia alebo diabetes s rodinným výskytom a autozómovo-dominantným typom dedičnosti (Maturity Onset Diabetes of the Young – MODY)

genetické syndrómy asociované s diabetom (mito­chondriálny diabetes, diabetes s renálnymi cystami, Wolframov syndróm)

monogénové syndrómy inzulínovej rezistencie (mutácie inzulínového receptora, lipoatrofický diabetes)

Epidemiológia monogénového diabetu nie je presne známa [4]. Najčastejším typom monogénového diabetu je hyperglykémia alebo diabetes, a to s rodinným výskytom a autozómovo dominantným typom dedičnosti, v literatúre nazývaný aj Maturity Onset Diabetes of the Young (MODY). Približne 1 % pacientov do 45 rokov, pôvodne klasifikovaných ako diabetes 1. typu (DM1T), a približne 4 % pacientov do 45 rokov, pôvodne klasifikovaných ako diabetes 2. typu (DM2T), sú v skutočnosti MODY-pacienti [5]. Druhý najčastejší typ monogénového diabetu je mitochondriálny diabetes (cca 0,5 % spomedzi všetkých diabetikov) [6]. Výskyt ostatných typov monogénového diabetu vrátane syndrómových foriem je pravdepodobne nižší.

Syndróm MEHMO

Medzi genetické syndrómy asociované s diabetom patrí aj syndróm MEHMO (Mental retardation, Epileptic seizures, Hypogonadism and Hypogenitalism, Microcephaly and Obesity). MEHMO je na X-chromozóm viazané recesívne ochorenie definované ako ťažká porucha intelektu v spojení s mikrocefáliou, epilepsiou, hypogonadizmom a hypogenitalizmom, diabetom a obezitou [7]. Syndróm vzniká v dôsledku mutácie v géne EIF2S3, ktorý kóduje podjednotku eukaryotického iniciačného faktora proteo­syntézy γ (eIF2γ) potrebného pre iniciáciu translácie [8].

Wolframov syndróm

Ďalším zo syndrómov asociovaných s diabetom je Wolf­ramov syndróm, známy tiež ako DIDMOAD (Diabetes Insipidus, early-onset Diabetes Mellitus, progressive Optic Atrophy, and Deafness). Klinické prejavy ochorenia sa zhoršujú vekom. Prvým klinickým prejavom býva spravidla diabetes mellitus s potrebnou inzulinoterapiou, ktorý nastupuje v prvej dekáde života (približne 6. rok života). Nasleduje atrofia zrakového nervu (približne 11. rok života), senzorineurálna porucha sluchu (približne 12,5 roka), centrálny diabetes insipidus (približne 14. rok života), dilatácia močových ciest až napokon neurologické abnormality [9,10]. Ochorenie je asociované s mutáciou v géne WFS1 kódujúcom wolframín, transmembránový proteín endoplazmatického retikula [11]. Vo väčšine prípadov ide o recesívne mutácie [12], no boli popísané aj heterozygotné a autosomálne dominantné mutácie, ktoré spôsobujú spektrum subfenotypov od izolovanej poruchy sluchu [13], izolovanej formy diabetu [14], kombináciu optickej atrofie a poruchy sluchu [15], až po klinicky závažný Wolframov synfróm s nástupom v neonatálnom veku [16].

Štúdium funkcie B-buniek

Zdokonalenie techník sekvenovania DNA prispelo k objavu mnohých monogénových ochorení, no napriek identifikovaným mutáciám v konkrétnych génoch, etiológia týchto ochorení nemusí byť známa. Wolframov syndróm je jedným z príkladov monogénových syndrómov, u ktorých prepojenie genotypu s fenotypom nie je úplne jasné [10,16]. Objasnenie etiológie monogénových syndrómov je do určitej miery jednoduchšie kvôli skutočnosti, že patogénna mutácia sa nachádza v jedinom géne. Monogénový diabetes tak môže predstavovať vhodný model pre štúdium mechanizmov poškodenia funkcie B-buniek pankreasu. Výsledky štúdia môžu byť prípadne aplikovateľné aj na polygénové typy diabetes mellitus.

Možnosti štúdia funkcie B-buniek v podmienkach in vivo sú limitované. Pre pochopenie patogénnych mechanizmov asociovaných s diabetom sú potrebné experimentálne modely buniek pankreasu. V súčasnosti existujú 3 možné spôsoby štúdia B-buniek: 1. primárne ostrovčeky izolované z pankreasu darcov orgánov, 2. humánne línie B-buniek a 3. bunky podobné ostrovčekom diferencované z ľudských pluripotentných kmeňových buniek (human Pluripotent Stem Cell – hPSC), ktoré zahŕňajú buď ľudské embryonálne (human Embyonic Stem Cell) alebo ľudské indukované pluripotentné kmeňové bunky (human-induced Pluripotent Stem Cell – hiPSCs).

Primárne ostrovčeky

Primárne ostrovčeky pankreasu sa získavajú od donorov pankreasu alebo počas operácie pankreasu, pričom ich veľkou výhodou je izolácia bez porušenia krvného toku, čím bunky v ostrovčekoch nestrácajú svoju funkčnosť [17]. Stanovenie transkripčného profilu týchto ostrovčekov spolu s GWAS (Genome Wide Association Studies) významne uľahčilo poznanie expresie génov, ako aj poznanie efektu génových variácií na expresiu génov. Toto umožnilo objav mnohých génov s potenciálnou úlohou v metabolizme glukózy a sekrécii inzulínu [18–22].

Stabilné bunkové línie

Ďalšou možnosťou ako študovať funkcie B-buniek je využitie stabilných bunkových línií, ktoré môžu byť živočíšneho alebo ľudského pôvodu. Vo veľkej miere sa používajú bunkové línie produkujúce inzulín, ktoré pochádzajú z myší, potkanov, či škrečkov, ako napr. RINm5F, HIT-T15, MIN-6, INS-1, B-TC (tab) [23–27]. Myšacie a potkanie bunkové modely prispeli k mnohým objavom v biológii B-buniek, sú pomerne stabilné, ich počet pasáží (t.j. počet prenesení buniek do novej kultivačnej nádoby) je menej limitovaný a celkové náklady na ich kultiváciu sú nižšie [17]. Endokrinné bunky pankreasu hlodavcov sa každopádne odlišujú od tých ľudských a existujú aj medzidruhové rozdiely v usporiadaní ich A- a B-buniek pankreasu. Medzičasom sa stali dostupnejšie práve ľudské bunkové línie, napr. EndoC-BH1 [27], ktoré jednoznačne prispievajú k ešte väčšiemu pochopeniu funkcie a fyziológie ľudských B-buniek, ako aj ich reakcie na rôzne liečivá [28–30]. Spomínané línie sú endokrinné a sú schopné produkovať a sekretovať inzulín po stimulácii glukózou. Každá z týchto bunkových línií má taktiež svoje limitácie (tab.).

V prípade štúdia patofyziológie B-buniek spôsobenej mutáciou v konkrétnom géne u pacientov s monogénovým diabetom majú spomínané bunkové modely značné limity. Nakoľko sa nejedná o bunky izolované od konkrétnych pacientov, nie sú schopné kopírovať fenotyp ich B-buniek. Naším cieľom bolo reprogramovať somatické bunky pacientov s MEHMO a Wolf­ramovým syndrómom na indukované pluripotentné kmeňové bunky.

Indukované pluripotentné kmeňové bunky

Kvôli limitáciám B-bunkových stabilných línií sa stáva čoraz populárnejšou metóda vytvorenia indukovaných pluripotentných kmeňových buniek (iPSC). Ide o prípravu kmeňových buniek zo somatických buniek pacienta, ktoré nesú pacientovu kompletnú genetickú informáciu. Najčastejšie využívaným typom somatických buniek pre reprogramovanie sú fibroblasty, resp. PBMC-bunky (Peripheral Blood Mononucelar Cells), ktoré sú pomerne jednoducho získateľné.

Technika reprogramovania

Fusaki et al [31] vytvorili unikátnu metódu, pri ktorej sú somatické ľudské bunky reprogramované prostredníctvom špeciálne navrhnutého Sendai vírusového vektora (SeV) na pluripotentné kmeňové bunky. Vírusový vektor v sebe nesie zakódovanú informáciu pre markery ľudských kmeňových buniek (hESC, human Embryonic Stem-Cells): OCT3/4, SOX2, KLF4 a c-Myc. Tieto 4 transkripčné faktory sú nevyhnutné na spustenie reprogramovania buniek zo somatických na kmeňové. Jedná sa o kaskádovú reakciu, kedy expresia transkripčných faktorov „zapne“ ostatné signálne dráhy a expresiu génov zodpovedných za reprogramovanie diferencovanej bunky na kmeňovú bunku. Z vírusového vektora sú už na 3. deň od infikovania v bunkách exprimované endogénne markery pluripotencie Oct3/4, Sox2, Nanog, GDF3, TDGF1, Zfp42, Sal4F, Dnmt3b, CABRB3, CYP26A1, a FOXD3; telomerázová reverzná transkriptáza (hTERT) a povrchové markery pluripotencie SSEA4 a TRA-1–60 a -81. SeV vektor sa replikuje konštitutívne v cytoplazme infikovaných buniek, neintegruje sa do genómu a rastom a množením buniek sa z nich časom vymyje [31].

V súčasnosti sú publikované viaceré štúdie s iPSC bunkami od pacientov s monogénovým diabetom vrátane MEHMO [32] a Wolframového syndrómu [33–36]. V spolupráci s Université Libre de Bruxelles (ULB) Center for Diabetes Research sme reprogramovali PBMC bunky od pacienta so syndrómom MEHMO. V predchádzajúcich analýzach sme u pacienta identifikovali pomocou celoexómového sekvenovania (Whole Exome Sequencing – WES) variant c.1394_1397delTCAA v géne EIF2S3 spôsobujúci frameshift v eukaryotickom iniciačnom faktore eIF2γ s predčasným stop kodónom p.I465Sfs*4 [8]. Reprogramovali sme taktiež PBMC-bunky od pacienta s Wolframovým syndrómom, u ktorého sme pomocou Sangerovho sekvenovania identifikovali mutáciu c.2608_2619del v géne WFS1 spôsobujúcu deléciu 4 aminokyselín p.(870_873del) vo wolf­ramíne.

Približne po 2 týždňoch kultivácie izolovaných PBMC-buniek s vírusovým vektorom začali bunky vytvárať prvé kolónie, ktoré niesli morfologické znaky ľudských kmeňových buniek. Kultiváciou a pasážovaním (prekultivovaním do novej kultivačnej nádoby) kolónií sme vypestovali iPSC-kolónie od pacienta s MEHMO syndrómom (obr. 1) a Wolframovým syndrómom. iPSC kolónie od pacienta s Wolframovým syndrómom však často podliehali spontánnej diferenciácii (obr. 2). Práve kvôli nestabilite iPSC-buniek je potrebné vykonať ich komplexnú kontrolu kvality.

Kontrola kvality reprogramovania

Tak ako práca s ľudskými embryonálnymi kmeňovými bunkami a modelovými pankreatickými bunkovými líniami, aj práca s ľudskými indukovanými pluripotentnými kmeňovými bunkami a z nich diferencovanými B-bunkami má svoje limitácie. V súčasnosti sú stále diskutované jednotlivé kroky reprogramovania aj diferenciácie buniek [37,38]. iPSC-bunky môžu mať nestabilný genóm, nestabilitu pluripotencie, a to nie len medzi iPSC-líniami rôznych pacientov, ale aj medzi iPSC-klonmi v rámci jednej bunkovej línie. V tomto kontexte bolo publikovaných viacero štúdií, ktoré sa venovali nestabilite genómu vedúcich k diferenciácii ľudských kmeňových buniek na nádorové bunky [39–43]. Pri iPSC-bunkách je problémom taktiež spontánna diferenciácia. Riadená diferenciácia iPSC-buniek je častokrát neúspešná, nedostatočná, a opäť veľmi variabilná medzi jednotlivými bunkovými kolóniami či líniami [39,44–48].

Práve kvôli variabilite získaných iPSC sú potrebné rozsiahle kontrolné testy, v ktorých sa analyzuje ich pluripotencia, a to a) sledovaním expresie markerov pluripotencie pomocou imunocytologického farbenia a kvantitatívnej PCR; b) zistenie potenciálu diferencovať sa na 3 zárodočné vrstvy; c) kontrolou vymytia vírusového vektora použitého na reprogramovanie; d) analýzy karyotypu a genotypu pre prípadné odhalenie chromozomálnych aberácií alebo nechcene vnesených DNA-mutácií; e) v neposlednom rade je dôležitá kontrola čistoty, resp. prípadnej kontaminácie. Samotná príprava, reprogramovanie a kontrola iPSC trvá 3–6 mesiacov.

Vybrané iPSC-kolónie od pacientov s MEHMO a Wolf­ramovým syndrómom sme podrobili kontrole kvality. qPCR potvrdila expresiu faktorov pluripotencie Nanog, Oct3/4, TNGF a Sox2. Imunocytochemické farbenie potvrdilo expresiu endogénnych faktorov pluripotencie Nanog a OCT3/4, ako aj povrchových markerov SSEA4, TRA-1–60. iPSC navyše preukázali potenciál diferencovať sa na 3 zárodočné vrstvy – endoderma, mezoderma, exoderma. Nezmenený karyotyp bol potvrdený G-prúžkovaním chromozómov, zachovanie genotypu bolo potvrdené prítomnosťou mutácie v géne EIF2S3 Sangerovým sekvenovaním. Vybraná iPSC-kolónia od MEHMO pacienta prešla kontrolou neprítomnosti bakteriálnej kontaminácie i vymytia vírusového vektora (pasáž 9).

Zvolený iPSC-klon od pacienta s Wolframovým syndrómom bol negatívny pre prítomnosť vírusového vektora (už v pasáži 7), imunocytochemické farbenie však ukázalo, že bunky boli síce pozitívne pre endogénne aj povrchové faktory pluripotencie, no v prítomnosti spontánne diferencovaných buniek, ktoré začali vytvárať svoje vlastné kolónie (obr. 3). Preto budú dodatočne zvolené iné iPSC-klony, ktoré podstúpia kontrolu kvality. Reprogramované bunky môžu byť zmrazené v médiu s DMEM (Dulbecco′s Modified Eagle′s – Medium), inaktivovaným Fetal Bovine Serum (FBS) a Dimethyl Sulfoxide (DMSO) v kryoskúmavkách pri -80°C a následne uskladnené v tekutom dusíku pri -196 °C.

Diferenciácia iPSC na pankreatické B-bunky

iPSC-bunky vďaka svojej pluripotentnosti môžu byť diferencované in vitro na viaceré typy buniek, ako napr. bunky krvi a endotelu [49], B-bunky [50], neuróny [51,52], či bunky očnej sietnice [53]. Z iPSC-buniek nie je možné vypestovať embryo či placentu. Diferenciáciou iPSC-buniek od pacienta na pankreatické B-bunky získavame unikátny model, na ktorom je možné študovať mechanizmus sekrécie inzulínu, reakciu bunky na príjem glukózy, bunkový stres, apoptózu atď. Prvý protokol pre diferenciáciu ľudských B-buniek z ľudských kmeňových buniek, ktoré boli použité na následnú transplantáciu, bol etablovaný v rokoch 2006 až 2008 [54,55].

Na to, aby sa z iPSC-buniek diferencovalo dostatočné množstvo B-buniek, ktoré sú schopné sekretovať inzulín, je nevyhnutné, aby exprimovali 2 transkripčné faktory – PDX1 a NKX6.1. Tie sú prirodzene exprimované vo veľkej miere v progenitorových i maturovaných bunkách pankreasu [56]. In vitro diferencované B-bunky nie sú úplne maturované B-bunky pankreasu, ale B-like bunky, ktoré sú schopné úplne dozrieť až po transplantácii napr. do myšacej obličkovej kapsule [57,58], alebo do ľudskej pečene cez portálnu žilu [59,60]. Progenitorové bunky pankreasu ako aj B-bunky získané z ľudských embryonálnych kmeňových buniek sú po transplantácii schopné zvrátiť hyperglykémiu v imunodeficientných myšiach s DM1T a DM2T [57,61–63]. Aby sa v transplantovaných B-bunkách prejavila sekrécia inzulínu regulovaná glukózou, je potrebné, aby bunky dozrievali v tele dlhší čas [57,58,64–66].

Vďaka tomu majú aj z iPSC derivované B-bunky po ich transplantácii potenciál aspoň čiastočne a aspoň na určitú dobu nahradiť funkciu poškodených B-buniek pacienta. V súčasnosti sa zdokonaľujú najmä techniky transplantácie B-buniek odvodených od iPSC pacientom s diabetom [37,67–70].

Diskusia

Reprogramovanie somatických buniek pacientov s diabetom na indukované pluripotentné kmeňové bunky a ich následná diferenciácia predstavujú jedinečný model pre molekulárno-genetické štúdie mechanizmov ochorenia a štúdium účinku liečiv. Okrem štúdia narušených bunkových mechanizmov vedúcich k diabetu majú diferencované B-bunky veľký potenciál v bunkovej terapii. B-bunky diferencované in vitro síce nemajú sekrečnú kapacitu ako B-bunky izolované zo živého organizmu, no sú schopné reagovať na zvýšenú hladinu glukózy zvýšenou sekréciou inzulínu [62,71,72].

Indukované pluripotentné kmeňové bunky sa odlišujú od embryonálnych ľudských kmeňových buniek. Ak by boli bunky transplantované pacientovi, imunitný systém ich dokáže rozpoznať ako vlastné, a tým sa eliminuje riziko odmietnutia či nutnosť imunosupresívnej liečby. Na rozdiel od výskumu s ľudskými embryonálnymi bunkami, pri iPSC je do značnej mieri vyriešený etický problém práce s kmeňovými bunkami. iPSC-bunky prinášajú aj možnosť štúdia organogenézy, čo u diferencovaných buniek už možné nie je [73]. Je však dôležité poznamenať, že izolované bunky nemôžu poskytnúť presný obraz fungovania endokrinného pankreasu, pretože nie sú inervované a vaskularizované [28].

iPSC-kmeňové bunky sú v pomerne veľkej miere využívané pre účely úpravy genetickej informácie. Revolučná metóda DNA-editingu, Crispr-Cas9, umožňuje v živej bunke zaviesť špecifickú mutáciu na špecifické miesto v DNA, a tým vytvoriť model B-bunky pacienta s monogénovým diabetom [74–78], t. j. model „disease on a dish“. Takýmto spôsobom je možné získať vzácne pacientske B-bunky bez nutnosti biopsie pankreasu. Pomocou Cas9-endonukleázy, ktorá štiepi dvojvláknovú DNA, je mutácie možné nielen vniesť, ale aj odstrániť. Odstránením patogénnej mutácie v pacientových iPSC sa získava jedinečná izogénna kontrolná línia buniek, ktorá je adekvátnejšia ako kontrolné iPSC-bunky izolované z iného donora bez diabetu. „Opravené“ iPSC-bunky môžu byť následne diferencované na B-bunky pankreasu (schéma). V prípade syndrómových ochorení, akými sú aj MEHMO a Wolframov syndróm, by sa pacientom dalo pomôcť nie len s transplantáciou funkčných inzulín sekretujúcich B-buniek, ale aj neurónov, či buniek iných poškodených orgánov.

Reprogramovaniu a diferenciácii buniek in vitro sa venuje čoraz viac laboratórií. Indukované pluripotentné kmeňové bunky boli úspešne pripravené zo somatických buniek nie len od pacientov s MEHMO [32] a Wolframovým syndrómom [33,34], ale aj DM1T, DM2T, MODY1/2/3/5/8, či nediabetických nosičov mutácie v géne PDX1, ale aj zdravých kontrolných jedincov [68]. V rámci vedecko-výskumných aktivít laboratória Diabgene Ústavu experimentálnej endokrinológie Biomedicínskeho centra SAV v spolupráci s Université Libre de Bruxelles plánujeme diferenciáciu iPSC-buniek na pankreatické B-bunky, izolovaných z PBMC od pacienta s MEHMO syndrómom.

Napriek svojim obrovským výhodám sú iPSC a z nich derivované B-bunky stále systémom, ktorý nie je dokonalý. Reprogramovanie je proces, ktorý si vyžaduje týždne až mesiace, kým sa získajú stabilné pluripotentné kmeňové bunky. Je nevyhnutné, aby sa procesy reprogramovania a diferenciácie zjednotili a vylepšili na takú úroveň, aby prinášali stabilné bunkové línie, ktoré majú menšiu diverzitu v rámci kolónií. Zároveň je potrebné eliminovať technické nedostatky, ktoré môžu brzdiť napredovanie tejto metodiky. Pri diferenciácii na B-bunky bude obzvlášť dôležité vylepšiť „proteínový kokteil“, ktorý je bunkám pridávaný, aby sa dokázali cez jednotlivé štádiá postupne diferencovať z kmeňových buniek až na bunky produkujúce inzulín v závislosti od podanej koncentrácie glukózy in vitro.

Grantová podpora: Výskumný pobyt v Center for Diabetes Research, Université Libre de Bruxxelles (Brusel, Belgicko) bol podporený Slovenskou diabetologickou spoločnosťou; Národným štipendijným programom Slovenskej republiky a grantom APVV 170296.

Vyhlásenie o konflikte záujmov autora

Autor nevyhlasuje žiaden konflikt záujmov.

RNDr. Daniela Gašperíková, DrSc.

 daniela.gasperikova@savba.sk

www.endo.sav.sk

Doručené do redakcie | Received 1. 3. 2021

Prijaté po recenzii | Accepted 29. 3. 2021