Novinky v klasifikaci adenokarcinomů plic a potenciální prognostické a prediktivní faktory u nemalobuněčných plicních karcinomů

Souhrn

Vzhledem ke stále ještě používanému dělení karcinomů plic na malobuněčné a nemalobuněčné (NSCLC, non-small cell lung cancer) je klíčovou úlohou patologa přesnější zařazení nádorové léze tak, aby termín NSCLC byl užíván pouze v naprosté minoritě případů. Recentně došlo k reklasifikaci plicních adenokarcinomů a tyto nové trendy by měly být zohledněny ve standardních výsledkových protokolech bioptických vyšetření. Naléhavě stoupá potřeba zajištění dostatečného množství kvalitního materiálu pro testování genetických vlastností NSCLC, v první řadě přítomnosti a funkčního stavu receptoru pro EGFR (epidermal growth factor receptor), a také jiných potenciálních prognostických a prediktivních markerů. Požadavek na kvalitní diagnózu a rychlost testování klade zásadní důraz na úzkou multioborovou spolupráci, v jejímž centru je specializovaný patolog koordinující celý diferenciálně-diagnostický postup. Z toho ovšem plyne i nutnost zohlednění nárůstu finančního zatížení diagnostikujících pracovišť.

Klíčová slova:
karcinom plic – adenokarcinom – klasifikace – prognostické faktory – EGFR

Důvody ke změně klasifikace plicních adenokarcinomů

Karcinomy plic jsou celosvětově nejčastější příčinou mortality na nádorová onemocnění (1,2). Kromě malobuněčného karcinomu je rozeznávána heterogenní skupina plicních karcinomů nazývaných nemalobuněčné (NSCLC – non-small cell lung cancer). Adenokarcinom je nejčastějším histologickým subtypem NSCLC a reprezentuje téměř polovinu všech plicních nádorů. Adenokarcinomy plic představují širokou skupinu vysoce odlišných nádorových entit. Přes významný pokrok ve studiu těchto nádorů v uplynulém desetiletí přetrvává potřeba sjednocení všeobecně uznávaných kritérií pro jednotlivé subtypy adenokarcinomů. Nejvýraznější je tato změna v případě nádorů dříve klasifikovaných jako bronchioloalveolární karcinom (BAC) (3,4).

Základem nejnovější klasifikace jsou sice histologická kritéria, avšak výsledná verze byla vyvinuta konsenzuálně ve spolupráci s klinickými pneumoonkology, radiology, molekulárními biology a chirurgy. Komplexní úsilí a multidisciplinární přístup vedly k vývoji terminologie a klasifikace, která nejen definuje jednotlivé patologické entity, ale poskytuje současně potřebné informace důležité pro léčbu pacienta. Součástí klasifikace jsou zároveň doporučení pro strategickou manipulaci se vzorky a návrhy vyšetřovacích postupů s ohledem na rozšiřující se spektrum nových biologických léčiv. Navíc obsahuje doporučení, jak zacházet s malými bioptickými vzorky a cytologiemi v managementu diagnostického procesu plicních nádorů. Přibližně 70 % karcinomů plic je totiž v současnosti diagnostikováno z malé biopsie nebo cytologie (5), kde podrobnější zařazení NSCLC bývá mnohdy svízelné. Vzhledem k novým diagnostickým a léčebným modalitám je však nutné bližší určení subtypu NSCLC provést, protože například v rámci odhadu reakce na léčbu tyrozinkinázovými inhibitory EGFR (epidermal growth factor receptor) je důležité rozlišení karcinomu se skvamocelulární diferenciací od adenokarcinomu a nemalobuněčného karcinomu blíže nespecifikovaného (NOS) u pacientů v pokročilém stádiu nádorového onemocnění. Pro zkušeného patologa je relativně snadné odlišit dobře nebo středně diferencovaný skvamocelulární karcinom od adenokarcinomu již ze standardního barvení, diagnóza však může být problematická až nemožná u hůře diferencovaných nádorů. V malých biopsiích a/nebo cytologických vzorcích je stále 10–30 % vzorků diagnostikováno jako NSCLC-NOS (6). Právě v těchto případech je indikováno užití speciálních histochemických a imunohistochemických metod, které bližší zařazení subtypu NSCLC umožní. Na druhou stranu je nutné zdůraznit, že zachování co možná největšího množství nádorové tkáně pro následné molekulárně-patologické vyšetření má prioritu před dokonalou subtypizací. Je právě nejdůležitějším a nejnáročnějším úkolem pneumopatologa najít kompromis, kolik vyšetřovacích metod zvolit a kolik jich užívat, aby molekulárnímu biologovi dodal co možná nejvíce nádorové tkáně co nejlépe subtypizovaného karcinomu.

Z recentních údajů vyplývá, že více než 90 % plicních adenokarcinomů spadá do kategorie smíšených subtypů podle klasifikace WHO z roku 2004. Proto bylo konsenzuálně navrženo provádět procentuální semikvantitativní hodnocení různých histologických komponent: acinární, papilární, mikropapilární, lepidické a solidní, a klasifikovat nádory podle převládajícího histologického subtypu (11). Uvedený přístup umožní zohlednit histologickou heterogenitu adenokarcinomů plic a pomůže zlepšit korelaci molekulárních a prognostických markerů (11).

Zásadním problémem se ukázal termín bronchioloalveolární karcinom (BAC). Ve WHO klasifikaci z roku 1999 a 2004 (3,4) se termín BAC používal pro široké spektrum nádorů, včetně solitárních neinvazivních periferních plicních nádorů se 100% 5-letým přežitím (8), invazivních adenokarcinomů s minimální invazí, který má rovněž téměř 100% 5-tileté přežití (9,10), ale i u smíšených invazivních adenokarcinomů mucinózního a nemucinózního subtypu (12–15), což jsou nádorová onemocnění s velmi špatnou prognózou (3,4,16). Předešlé studie prokázaly, že pacienti s malými solitárními periferními adenokarcinomy s histologickým obrazem BAC můžou mít 5-leté přežití až 100 % (7,8), rovněž pacienti s tímto typem adenokarcinomů s minimální invazí mají velice příznivé přežití na rozdíl od jiných typů (9,10). Proto je v nové klasifikaci doporučení termín „BAC“ nadále vůbec nepoužívat, aby nedocházelo k záměně různých subtypů nádorů s diametrálně odlišnou prognózou a termín BAC nahradit nově vytvořeným názvem „adenokarcinom s predominantně lepidickým typem růstu (LPA)“.

Klasifikace plicních adenokarcinomů dle doporučení IASLC/ATS/ERS

Souhrn doporučení vyplývající z nového návrhu klasifikace karcinomů plic dle doporučení IASLC (International Association for the Study of Lung Cancer), ATS (American Thoracic Society) a ERS (European Respiratory Society) (17) je následovný (viz tab.1):

• Doporučuje se zcela opustit používání termínu “BAC”. Pro malé (≤3 cm) solitární adenokarcinomy s čistě lepidickým typem růstu bez jednoznačného invazivního růstu používat termín “adenokarcinom in situ (AIS)“. Jde o nádory s excelentní prognózou, které mají po kompletní chirurgické resekci 100% přežití.
• Pro malé (≤3 cm) solitární adenokarcinomy s převažujícím lepidickým růstem a malými ohnisky invaze s menšími než 0,5 cm se doporučuje použít termín “minimálně invazivní adenokarcinom (MIA)”. Ten by měl definovat nádory s velmi dobrou prognózou, u nichž po radikálním chirurgické resekci přežití může dosáhnout až 100 %.
• Pro invazivní adenokarcinomy se doporučuje použít komplexní histologickou subtypizaci založenou na stanovení dominantního histologického obrazu ze všech zastoupených subtypů s tím, že každý další subtyp vyskytující se ve více než 5 % nádorové masy by měl být uveden a mělo by být definováno jeho procentuální zastoupení.
• U pacientů s vícečetnými ložisky plicních adenokarcinomů se rovněž doporučuje použít výše uvedenou komplexní histologickou subtypizaci, která napomůže odlišení histohomologní metastázy od synchronních nebo metachronních primárních tumorů.
• Pro nemucinózní adenokarcinomy dříve klasifikované jako smíšené subtypy s převahou nemucinózního BAC se doporučuje použití termínu LPA bez dalšího upřesnění a termín “smíšený podtyp” nadále nepoužívat.
• Adenokarcinomy dříve klasifikované jako mucinózní BAC by měly být odděleny od adenokarcinomů dříve klasifikoványch jako nemucinózní BAC a v závislosti na rozsahu lepidického nebo invazivního růstu by měly být nadále klasifikovány jako “mucinózní adenokarcinom in situ” nebo “invazivní mucinózní adenokarcinom”.

Praktická doporučení pro správné nakládání s malými bioptickými vzorky (17)

Nejdůležitějším doporučením pro malé biopsie a cytologie je, aby se NSCLC dále dělil na konkrétní typ (adenokarcinom či skvamocelulární karcinom), kdykoli je to možné, a aby se termín NSCLC blíže nespecifikovaný (NOS) používal co nejméně. Termín NSCLC-NOS by měl být vyhrazen pouze pro nádory, kdy není možné stanovit přesnější diagnózu ze základní morfologie a/nebo ani s pomocí imunohistochemických metod. Neuroendokrinní imunohistochemické markery by měly být aplikovány pouze v případě, že existuje podezření na neuroendokrinní diferenciaci ze základního morfologického obrazu. Zásadní je rovněž doporučení, aby byly bioptické a cytologické vzorky ze stejné léze optimálně vyšetřovány společně, což může napomoci co nejpřesnější diagnóze. Důležité je také doporučení, aby z veškerého cytologického materiálu včetně pleurálních punkcí byly vždy připraveny cytobloky. V tomto ohledu se bude jednoznačně zvyšovat zásadní potřeba bližší spolupráce mezi diagnostikujícím histopatologem a plicním cytologem.

Pokud je diagnóza stanovena z malé biopsie a/nebo cytologie, měla by být součástí výsledkového protokolu informace, zda byla finální diagnóza stanovena ze základního barvení, nebo zda byly použité speciální metody. Znovu je však potřeba zdůraznit, že vzorky tkáně by měly být k dispozici nejen pro diagnostiku (ta je zásadní), ale také v maximální možné míře pro účely molekulárně-biologického vyšetřování.

Další změny zohledňuje nová klasifikace v terminologii NSCLC, protože má mnohdy zásadní terapeutické konsekvence. Termíny AIS (adenokarcinom in situ) a MIA (minimálně invazivní adenokarcinom) by se neměly používat u malých biopsií nebo v cytologických vzorcích. Pokud je neinvazivní typ nádoru přítomen v malé biopsii, je třeba jej označit jako adenokarcinom s lepidickým typem růstu (LPA) bez další specifikace ohledně invazivního růstu. Termín velkobuněčný karcinom by se neměl používat v případě malých biopsií nebo cytologických vzorků, protože je vyhrazen pouze pro případy, kde byl proveden dostatečný sampling celého resekátu a byla vyloučena původní diferencovaná komponenta nádoru. Termín nonskvamózní karcinom plic by v rutinních diagnostických závěrech neměl být používán, protože se jedná se o klinický termín. Nádory, které vykazují sarkomatoidní charakteristiky, jako např. výraznou jadernou polymorfii, přítomnost obrovských nebo vřetenitých buněk, by měly být zařazeny do kategorie adenokarcinomů nebo skvamocelulárních karcinomů, pokud jsou přítomny morfologické charakteristiky dlaždicobuněčné nebo glandulární diferenciace. Termín špatně diferencovaný nemalobuněčný karcinom s obrovskými a/nebo vřetenitými buňkami (v závislosti na přítomné komponentě) by se měl používat pouze v případě, že nebyly v dostatečném množství vzorků nádoru nalezeny jednoznačné morfologické charakteristiky skvamózní či žlázové diferenciace.

PROGNOSTICKÉ A PREDIKTIVNÍ FAKTORY U NSCLC

Plicní karcinomy a receptor pro epidermální růstový faktor (EGFR)

EGFR (známý také jako ErbB-1 nebo HER1) patří do rodiny receptorů epidermálních růstových faktorů. Tato skupina receptorů hraje významnou úlohu jak v homeostáze normálních tkání, tak v regulaci fetálního vývoje u mnoha druhů organismů, včetně člověka. Gen kódující receptor epidermálního růstového faktoru je lokalizován na chromozomu 7. Aktivace tohoto genu může být způsobena genovou amplifikací, genovou mutací nebo nadprodukcí růstových faktorů, popř. jiných molekul se schopností vazby na receptor. EGFR je protein, který se podílí na ochraně buňky před apoptózou, stimulaci proliferace, angiogenezi, buněčné diferenciaci a migraci. Blokáda EGFR vede naopak ke snížení proliferace, angiogeneze, metastazování a k indukci apoptózy. Změny exprese receptoru EGFR doprovází často vznik a rozvoj řady karcinomů. Jeho ovlivnění je klíčovým cílem biologické léčby u mnoha nádorových onemocnění. Zvýšená exprese EGFR v nádorové tkáni má u četných typů nádorů negativní prognostický význam.

EGFR je aktivován růstovými faktory (ligandy), které se váží na jeho extracelulární část. Intracelulární část receptoru je po aktivaci vnější části autofosforylována a zároveň může docházet k dimerizaci receptorů. Tím je zahájena transdukční dráha, při které dochází k přenosu signálu z povrchu buňky do jejího jádra. Výsledkem tohoto procesu je aktivace transkripce cílových genů, které buď přímo kódují proteiny, nebo ovlivňují jejich transkripci (transkripční faktory), translaci, popř. ovlivňují posttranslační úpravy.

V současné době je známo několik typů mutantních forem EGFR, které se zřejmě podílejí přímo na procesu vzniku a rozvoje nádoru a které jsou zřejmě významné pro rezistenci nádorových buněk k některým typům protinádorové terapie. Poznatky o těchto specifických mutacích se proto velmi rychle dostávají do klinické praxe a jejich rutinní testování se jeví u většiny případů plicních adenokarcinomů jako zcela nezbytné vzhledem k rozšiřujícímu se spektru nových cílených léčiv. Nasazení mnohých léčiv je již nyní často (a bude stále více) přímo podmíněno zjištěním mutačního stavu EGFR.

Plicní karcinomy s ALK translokacemi

U minoritní části plicních nádorů byla zjištěná malá inverze chromozomu 2p, která vede ke vzniku fúzního genu EML4-ALK. Výsledkem dimerizace je vznik fúzního proteinu s určitou aktivitou. Uvedené změny se vyskytují u 5 % plicních adenokarcinomů, častěji u mužů, nekuřáků v mladším věku, bez ohledu na histologický subtyp (18–21). Zůstává zatím otázkou, zda skvamocelulární karcinomy také obsahují EML4-ALK translokaci. Detekce EML4-ALK translokace může být provedená pomocí několika metod včetně imunohistochemie, FISH, a RT-PCR (20–23). Většina nádorů s EML4-ALK translokací je pozitivních v reakci s TTF-1, avšak může být také p63 pozitivní (20,24). Nádory s EML4-ALK translokací nemají povětšinou EGFR a KRAS mutace a mají nižší frekvence mutací p53 (18,20,24,25). Nedávno byla zjištěna de novo mutace v oblasti EML4-ALK, která je odpovědná za rezistenci na léčbu inhibitory ALK (26).

Další potenciální molekulárně biologické prognostické faktory u NSCLC

Studiu prognostického významu imunohistochemické detekce potenciálních prediktivních markerů jako jsou EGFR (27), TTF-1 (28), p21ras (29), HER2 (30), p53 (27,31), Ki-67 (32), Bcl-2 (33) a cyklooxygenázy 2 (34) byly věnované rozsáhlé metaanalýzy. Doposud však nebyl jednoznačné prokázaný jejich význam (17).

MET proteinový produkt protoonkogenu c-met je transmembránový tyrozinkinázový receptor, jehož ligandem je hepatocytární růstový faktor. U NSCLC je MET zvýšeně exprimován a tato exprese je spojena s častými recidivami a krátkodobým přežíváním. Před nedávnem byla jako důsledek amplifikace c-met popsána rezistence na gefitinib. Preklinické údaje prokázaly, že inhibice MET může citlivost ke gefitinibu obnovit.

KRAS je protein, jehož hlavním významem je přenos signálů v rámci dráhy EGFR. Mutace genů KRAS jsou detekovány u 20–30 % případů NSCLC. Otázky vztahu mutací genu pro KRAS a predikcí k chemorezistenci nejsou dostatečně objasněny. Některé studie však korelaci mutačního statutu KRAS a rezistencí k tyrozinkinázovým inhibitorům receptorů EGFR, resp. k neúčinnosti léčby těmito inhibitory potvrdily.

Již delší dobu jsou popisovány vztahy autofagie a tumorigeneze (35). V nedávné době byla publikována řada prací popisujících autofagické proteiny jako prognostické markery (36,37). Byly potvrzeny předpoklady, že by proteiny, podílející se na autofagii, mohly mít u některých nádorových onemocnění prognostický význam. U NSCLC byl tento význam potvrzen pro protein LC3A, který je důležitou součástí autofagozomálních membrán, a je využíván jako marker autofagie. Karpathiou et al. v roce 2010 popsali silnou korelaci mezi zastoupením tzv. „stone-like“ struktur a nízkým přežíváním pacientů ve stadiích I a II NSCLC (38).

Dalším proteinem s prognostickým významem u NSCLC je BNIP3. Jedná se o proapoptotický mitochondriální protein, který je nadměrně exprimován v hypoxických oblastech nádorů. V těchto oblastech bývá často aktivována autofagie, proto se předpokládá jeho zapojení v těchto procesech. U raných stádií operabilních nemalobuněčných karcinomů plic (T1,2 - N0,1 - M0) byla prokázána silná korelace mezi expresí BNIP3 a nízkým celkovým přežíváním (39). U pokročilejších stádií NSCLC se tento prognostický význam neprokázal (40).

INHIBICE BUNĚČNÉHO RECEPTORU – MODERNÍ TERAPEUTICKÁ STRATEGIE

V klinické praxi se u NSCLC uplatňují zejména inhibitory tyrozinkináz (TKI), které blokují fosforylaci intracelulární domény EGFR receptoru. V lidském genomu je kolem 500 proteinových kináz, z nichž je 90 tyrozinkináz. Inhibitory těchto kináz mohou blokovat buď jediný typ receptoru, nebo více receptorů současně. V současné době jsou testovány desítky molekul, ale v praxi se u NSCLC používají jen léky blokující signální dráhu receptoru EGFR a léky inhibující růstový faktor cévního endotelu (vascular endothelial growth factor – VEGF).

EGFR je exprimován nejen u >80 % případů NSCLC, ale je také exprimován u řady dalších karcinomů. Proto je receptor pro epidermální růstový faktor a možnosti jeho ovlivnění jedním ze stěžejních cílů výzkumu.

Praktické aspekty testování mutačního statusu EGFR z hlediska patologa

Při setkání pneumoonkologů, patologů a molekulárních biologů 25. 6. 2010 v Čestlicích u Prahy byl navržen konsenzus testovat všechny pacienty, kteří jsou potenciálními kandidáty léčby TKI. Testování mutací EGFR by měla provádět molekulárně-biologická laboratoř, která je schopna provést vyšetření pomocí nejméně dvou na sobě nezávislých metod (např. sekvenováním a RT-PCR) v úzké spolupráci s diagnostikujícím pneumopatologem a pneumoonkologem. Souhrn nejdůležitějších praktických aspektů pro patology, na kterých se účastnící shodli, je následující:

Vhodným materiálem pro molekulárně-genetické vyšetření je jakýkoliv materiál vhodný pro morfologickou diagnózu. Bez kvalitní morfologické diagnózy NSCLC však nelze testovat molekulárně geneticky. Cytologie je ve srovnání s bioptickým vzorkem vhodnější pro molekulárně-genetickou diagnózu, a to jak z hlediska času stanovení diagnózy, tak výtěžnosti kvalitní DNA. Tento aspekt je však třeba porovnat s výrazně nižší diagnostickou výtěžností subtypizace NSCLC, která je z cytologického vyšetření jen omezeně možná zejména v porovnání s bioptickými parafinovými vzorky, proto je optimální kombinovat diagnózu cytologickou a histomorfologickou. Testování lze provést pouze po potvrzení přítomnosti nádorových buněk NSCLC, ideálně po subtypizování NSCLC a určení adenokarcinomu jako převládajícího histologického subtypu. Vyšetřovaný materiál by měl obsahovat nejméně 200–400 nádorových buněk.

ZÁVĚR

Vzhledem k současnému dělení karcinomů plic na malobuněčné a nemalobuněčné je klíčovou úlohou patologa přesnější zařazení nádorové léze tak, aby termín NSCLC byl užíván pouze v naprosté minoritě případů. Kromě toho však naléhavě stoupá potřeba zajištění dostatečného množství kvalitního materiálu pro testování genetických vlastností NSCLC, v první řadě přítomnosti a funkčního stavu receptoru pro EGFR, ale také jiných potenciálních prognostických markerů. Požadavek na kvalitní diagnózu a rychlost testování klade zásadní důraz na úzkou multioborovou spolupráci všech zúčastněných odborníků, v jejímž centru je specializovaný patolog koordinující celý diferenciálně-diagnostický postup. Z toho ovšem plyne i nutnost zohlednění nárůstu finančního zatížení diagnostikujících pracovišť.

Adresa pro korespondenci:

MUDr. et MVDr. Jozef Škarda, Ph.D.

Ústav klinické a molekulární patologie LF UP a FN Olomouc

Hněvotínska 3, 77200 Olomouc

e-mail: jojos@email.cz