Fekální kalgranulin C u nemocných s idiopatickými střevními záněty

Souhrn

Cílem práce je analýza hladin fekálního kalgranulinu C u nemocných se střevními záněty, srovnání s vyšetřením fekálního kalprotektinu, výpočet senzitivity a specificity testu fekálního kalgranulinu C pro diagnózu idiopatického střevního zánětu (IBD) a určení parametrů variability měření kalgranulinu C při použití metody enzymové imunoanalýzy (ELISA).

Materiál a metodika:
Bylo analyzováno 50 vzorků stolice pacientů s Crohnovou nemocí (n = 21), ulcerózní kolitidou (n = 19) a nemocných s blíže nespecifikovanou nemocí střeva (n = 10). Ve fekálních eluátech byly stanoveny koncentrace kalprotektinu (MRP8/14) a kalgranulinu C (MRP6). Statistická analýza dat spočívala ve srovnání kvantitativních a kvalitativních výsledků obou testů, ve stanovení parametrů variability měření a diagnostické hodnoty vyšetření kalgranulinu C a ve výpočtu referenčního rozmezí normálních hodnot.

Výsledky:
Byla nalezena signifikantní pozitivní korelace fekálních koncentrací kalprotektinu a kalgranulinu C (r = 0,829; p < 0,001). Při kvalitativním hodnocení výsledků bylo dosaženo konsenzu metod v 90 % případů. Vypočtená diagnostická senzitivita testu fekálního kalgranulinu C pro diagnózu IBD byla 75 %, specificita 88 %. Parametry variability použité ELISA soupravy k detekci fekálního kalgranulinu C byly v souladu s požadavky normy ISO15189.

Závěr:
Kalgranulin C je novým biomarkerem zánětu střevní sliznice. Do značné míry koreluje s fekálním kalprotektinem, jeho hladina však stoupá výhradně při neutrofily zprostředkovaném zánětu.

Klíčová slova:
kalgranulin C – kalprotektin – S100 proteiny – idiopatické střevní záněty

Laboratorní diagnostika se uplatňuje ve všech etapách vyšetřování nemocných s idiopatickými střevními záněty (inflammatory bowel disease – IBD) – diagnostikou počínaje přes hodnocení aktivity a tíže nemoci, posuzování efektu terapie nebo hrozícího relapsu a odhadem prognózy nemoci konče. Dosud však neexistuje „zlatý standard“, tj. jediný diagnostický test či vyšetření, nýbrž je využíváno kombinací klinického vyšetření, zobrazovacích metod a celého spektra laboratorních analýz.

Imunologické laboratorní diagnostice v tomto komplexu náleží místo zejména při vyšetřování sérových hladin autoprotilátek a systémových a lokálních zánětlivých markerů. Jako marker aktivity zánětu střevní sliznice se v současné době uplatňuje především fekální kalprotektin. Dle řady studií vykazuje toto vyšetření vysokou senzitivitu a specificitu pro diagnózu aktivního IBD a analýza již našla své jednoznačné místo v diagnostice imunopatologií zažívacího ústrojí [1–6].

Kalprotektin, nazývaný též kalgranulin A/B, S100A8/S100A9 nebo MRP8/14, je malá bílkovina patřící do rodiny S100 proteinů (název „S100 proteiny“ znamená, že tyto bílkoviny jsou při ­neutrálním pH 100% rozpustné v síranu ­amonném). V lidském těle se nachází ­řada forem S100 proteinů a jde většinou o intracelulárně působící bílkoviny. V tomto směru jsou výjimkou tři S100 proteiny – S100A8, S100A9 a S100A12, které se od ostatních proteinů této skupiny liší tím, že mají kromě intracelulárních též řadu extracelulárních funkcí. Jsou součástí vrozené imunity zejména díky svým významným chemotaktickým vlastnostem, aktivují intracelulární kaskády vedoucí k produkci prozánětlivých cytokinů a podílejí se na indukci reakcí oxidačního stresu [7].

Praktický význam proteinu S100A8//S100A9 neboli kalprotektinu ve stolici při diagnostice IBD je již dobře znám ­[8–10]. Cílem předkládané práce je analýza hladin fekálního S100A12 proteinu neboli kalgranulinu C. Provedli jsme srovnávací analýzu výsledků vyšetření fekálního kalgranulinu C a fekálního kalprotektinu, hodnotili jsme senzitivitu a specificitu testu fekálního kalgranulinu C a určili jsme parametry variability měření kalgranulinu C (linearita, opakovatelnost) při použití metody enzymové imunoanalýzy.

Materiál a metodika

Soubor biologických vzorků

Analyzovali jsme 50 vzorků stolice, které byly sousledně vyšetřeny v Laboratoři klinické imunologie a alergologie ÚLBLD VFN a 1. LF UK a ve kterých bylo dle ordinace klinika provedeno vyšetření fekální koncentrace kalprotektinu. Dle údajů na žádankách šlo o 21 pacientů s Crohnovou nemocí, 19 pacientů s ulcerózní kolitidou a 10 nemocných s blíže nespecifikovanou nemocí střeva. Vzorek stolice o hmotnosti 50–100 mg byl odebrán do speciálních odběrových zkumavek Faecal Sample Preparation Kit Roche umožňujících přesné zhotovení eluátu.

Laboratorní vyšetření

Byly analyzovány eluáty stolice naředěné v poměru 1 : 50 eluačním roztokem dle pokynů výrobců souprav. Při analýzách realizovaných manuálně bylo postupováno dle návodu z kitu. Fekální vzorky byly zpracovány pomocí dvou diagnostických souprav:

1. Calprotectin ELISA (Bühlmann, Švýcarsko) k detekci fekálního kalprotektinu,
2. Inflamark F-INFL-ELISA (Cisbio Bioassays, Francie) k detekci fekálního kalgranulinu C.

Statistická analýza

Statistická analýza dat byla provedena s pomocí softwaru Statistica CZ 10.0 (Statsoft,USA). Bylo provedeno srovnání výsledků dvou souprav, hladina významnosti korelačního koeficientu byla stanovena na p ≤ 0,05. U soupravy Inflamark byly stanoveny parametry variability měření a diagnostická hodnota testu, tj. senzitivita a specificita pro diagnózu IBD. Referenční rozmezí normálních hodnot kalgranulinu C bylo stanoveno pomocí online softwaru Cutoff Finder [11].

Výsledky

Nejdříve jsme definovali hraniční (cutoff) koncentraci fekálního kalgranulinu C: normální fekální kalgranulin C se pohybuje v rozmezí koncentrací 0–2,8 µg/g. Referenční rozmezí hodnot fekálního kalprotektinu 0–50 (­0–70) µg/g je známo [2,4,12] a používáno v klinické praxi.

V 50 vyšetřených vzorcích byly nízké hladiny kalprotektinu (< 70 µg/g) nalezeny ve 20 případech (40 %), hraniční hladiny (70–100 µg/g) v devíti případech (18 %) a vysoké hodnoty (>100 µg/g) ve 21 případech (42 %).

Ve stejném souboru vzorků bylo 25 vzorků (50 %) negativních na kalgranulin C (< 2,8 µg/g), v osmi vzorcích (16 %) byly naměřeny hraniční hodnoty ­(2,8–3,3 µg/g) a v 17 vzorcích (34 %) byly zjištěny vysoké hodnoty fekálního kalgranulinu C (> 3,3 µg/g).

Srovnání analýz

Pro sledování závislosti mezi dvěma soubory měření byl použit Spearmanův korelační koeficient. Vypočtená hodnota r = 0,829 svědčí pro signifikantní pozitivní korelaci fekálních koncentrací kalprotektinu a kalgranulinu C (graf 1).

Při kvalitativním hodnocení výsledků s řazením do tří kategorií – negativní, hraniční a pozitivní – bylo dosaženo konsenzu metod v 90 % případů. Shoda nebyla nalezena u pěti vzorků: ve dvou z nich byla hladina kalprotektinu hraničně zvýšená (73,4 a 103,7 µg/g), kdežto hladina kalgranulinu C v obou případech nulová. Ve třech vzorcích byla naměřena koncentrace kalprotektinu >250 µg/g (referenční rozmezí 0–70 µg/g), ale hladina fekálního kalgranulinu C byla < 1,5 µg/g. Z uvedeného vyplývá, že test fekálního kalprotektinu poukázal častěji na možnou zánětlivou iritaci střevní sliznice.

Senzitivita a specificita

Diagnostická senzitivita a specificita testu fekálního kalgranulinu C a srovnání s diagnostickou hodnotou testu fekálního kalprotektinu [12] je uvedena v tab. 1.

Linearita testu kalgranulinu C – diluční pokus

Linearita měření v soupravě Inflamark byla hodnocena po naředění eluátu stolice se známou velmi vysokou hodnotou fekálního kalgranulinu C vzorkem neobsahujícím kalgranulin C. Naředěním vznikly vzorky s klesajícími koncentracemi kalgranulinu C. Vyhodnocením závislosti průměrů změřených hodnot na očekávaných výsledcích byla u jednotlivých vzorků výtěžnost vyhodnocena v rozmezí ­92–115 %, s variačním koeficientem (CV) 9,8 % v celém rozsahu kalibrace, což je zcela v souladu s požadavky normy ISO15189 [13].

Variace v rámci testu a mezi testy (intra-assay a inter-assay charakteristiky)

Vyšetřili jsme šest alikvot jednoho vzorku s vysokou koncentrací a jednoho vzorku s nízkou koncentrací kalgranulinu C v jeden den na různých pozicích mikrotitrační destičky. CV vysokého i nízkého vzorku nepřevýšily 5 %. Dále jsme připravili tři alikvoty jednoho vzorku s vysokou koncentrací a jednoho vzorku s nízkou koncentrací kalprotektinu. Jedna dvojice alikvot byla zpracována ihned po přípravě, druhé dvě dvojice byly zamrazeny při teplotě −20 °C. Zmrazené alikvoty byly rozmraženy a analyzovány s odstupem dvou týdnů. CV měření opět nepřevýšily hodnotu 10 %. Uvedené výsledky odpovídají požadavkům na kvalitu při validaci metod [14].

Diskuze

V práci jsou prezentovány první zkušenosti s vyšetřením fekálního kalgranulinu C u osob s podezřením na střevní imunopatologie. Studie potvrzuje srovnatelný význam testování kalgranulinu C s dosud šířeji využívaným vyšetřením fekálního kalprotektinu. Fekální kalgranulin C je markerem zánětu střevní sliznice s mírně nižší senzitivitou ve srovnání s kalprotektinem, specificita kalgranulinu C pro diagnózu ­neutrofilního zánětu je naopak vyšší.

Kalgranulin C, známý též jako S100A12 protein, MRP6 nebo EN-RAGE, je vápník vážící prozánětlivý protein produkovaný téměř výhradně v neutrofilních granulocytech [15]. Humánní S100A12 byl poprvé popsán v roce 1995 Guingardem et al [16]. V současné době je znám jako významný biomarker neutrofilního zánětu. S100A12 má významné chemotaktické vlastnosti, aktivuje intracelulární cytokinové kaskády a podílí se na indukci reakcí oxidačního stresu [17]. Jako biomarker byl zkoumán v souvislosti s akutními streptokokovými a hemofilovými lokálními i systémovými infekcemi [18], některými autoimunitními nemocemi typu Behçetovy choroby [19], familiární středomořské horečky [20] nebo Kawasakiho nemoci [21]. Na rozdíl od kalprotektinu, který je produkován nejen neutrofilními granulocyty, ale i buňkami monocytomakrofágového systému nebo střevním epitelem, je S100A12 produkován téměř výhradně v granulocytech. Protein lze proto považovat za velmi specifický marker influxu neutrofilních granulocytů do střevní mukózy. Míra exkrece této bílkoviny do střevního lumen je dle práce německých autorů z roku 2008 [22] přímo úměrná počtu infiltrujících granulocytů a míře jejich aktivace.

Z uvedeného vyplývá, že test fekálního kalprotektinu nám dává odpověď na otázku, zda a do jaké míry je iritována střevní sliznice, přičemž minimální perzistující zánět bez dominance neutrofilů může provázet i neaktivní nebo mírně aktivní IBD, kdežto kalgranulin C je biomarkerem čistě neutrofilní aktivace typické pro aktivní IBD.

Dalším rozdílem mezi kalprotektinem a kalgranulinem C je jejich odlišné chování při průchodu tenkým střevem. Ukazuje se, že u kalprotektinu (heterodimeru MRP8/14) dochází v tenkém střevě k významnější degradaci vlivem enzymů, než je tomu u S100A12 [22]. Kalgranulin C by proto mohl najít uplatnění zejména při diagnostice IBD s postižením jejuna a ilea.

Z praktického hlediska je třeba upozornit na skutečnost, že u fekálního kalprotektinu vídáme při vzplanutí IBD někdy až 50násobné zvýšení koncentrace analytu. Maximální námi naměřená hodnota fekálního kalgranulinu C nepřevýšila 30 µg/g, tj. při normě do 2,8 µg/g lze při zhoršení stavu prokázat cca desetinásobnou elevaci. V klinické praxi jsou markery s vysokou mírou elevace při zánětu užitečnější, protože umožňují přesnější monitorování tíže zánětu a jeho dynamiky.

Předkládaná pilotní studie má své nedostatky. Tím hlavním je fakt, že jsme neměli možnost prozkoumat dynamiku vývoje hladin fekálního kalgranulinu C v průběhu nemoci, srovnat ji s endoskopickými nálezy nebo jinými systémovými či lokálními zánětlivými parametry, prozkoumat vliv terapie na dynamiku jeho hladin, a posoudit tak užitečnost vyšetření S100A12 při dlouhodobém monitorování nemocných s IBD. Podobnou studii se nám nepodařilo najít ani v dostupných medicínských databázích, které však obsahují četné studie na toto téma s fekálním kalprotektinem [5,7,9,23]. Je třeba upozornit také na to, že naše pilotní studie nezkoumala místo, stupeň ani charakter postižení střeva vyšetřených pacientů, nýbrž jen srovnala výstupy dvou enzymových imunoanalýz z jednoho souboru biologických vzorků. Pro stanovení přesnějších hodnot senzitivity, specificity, negativní a pozitivní prediktivní hodnoty testu kalgranulinu C pro diagnózu Crohnovy nemoci a ulcerózní kolitidy bude nezbytné analyzovat větší soubor dobře definovaných pacientů.

Závěrem konstatujeme, že fekální kalgranulin C (S100A12 protein) je novým a slibným biomarkerem neutro­filního zánětu střevní sliznice u nemocných s IBD. Indikace a interpretace tohoto vyšetření by měly být šířeji analyzovány před zavedením tohoto vyšetření do klinické praxe.

Práce byla podpořena Nadačním fondem IBD-Comfort.

Děkujeme RNDr. V. Hrčkové ze společnosti Solupharm Brno za poskytnutí diagnostické soupravy Inflamark F-INFL-ELISA.

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Doručeno: 16. 9. 2013

Přijato: 9. 12. 2013

MUDr. Karin Malíčková

Klinická imunologie a alergologie – laboratoř

Ústav lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN a 1. LF UK

Karlovo nám. 32, 121 11 Praha 2

kmali@lf1.cuni.cz