Vliv koncentrace polyvinylalkoholu na velikost oligoesterových polymerních nanočástic připravených metodou odpařování a rozdělování rozpouštědla

Souhrn

Nanočástice z PDLLA poly-DL kyseliny mléčné byly připraveny emulzní metodou rozdělování a odpařování rozpouštědla. Externí vodná fáze byla složena z 1,5% a 3% roztoku tří nízkomolekulárních polyvinylalkoholů. Tyto polyvinylalkoholy se lišily molekulovou hmotností a stupněm zmýdelnění. Vnitřní fáze byla tvořena 1% roztokem poly-DL mléčné kyseliny rozpuštěné v dichlormethanu, chloroformu nebo směsí dichlormethanu a chloroformu v poměru 1 : 1. Viskozita a povrchové napětí obou fází nebyly významně ovlivněny zvoleným rozpouštědlem ani koncentrací tenzidu. Oproti tomu velikost částic měřená metodou rozptylu světla a zeta potenciál jednotlivých vzorků měřený laserovým Dopplerovým velocimetrem ovlivněny byly. Statistické testování metodou ANOVA prokázalo, že druh rozpouštědla a molekulová hmotnost polyvinylalkoholu jsou statisticky významné faktory ovlivňující velikost vznikajících nanočástic. Koncentrace polyvinylalkoholu a jeho molekulová hmotnost statisticky významně ovlivňuje zeta potenciál částic. Tvorba nanočástic nebyla způsobena čistě emulgačním mechanismem. Proces tvorby částic byl významně zasažen turbulentním mísením obou fází a tuhnutím vnitřní fáze po přerozdělení organické fáze. Měnící se obsah polyvinylalkoholu v nanočásticích svědčil pro malý vliv koalescence na tvorbu nanočástic.

Klíčová slova:
PDLLA nanočástice – emulzní metoda odpařování a rozdělování rozpouštědla – velikost a zeta potenciál nanočástic

Úvod

Polymerní medikované nanočástice jsou předmětem zájmu ve stadiu vývoje a výzkumu, oproti tomu je v medicínské praxi zatím pouze jediný preparát¹⁾ . Nanočástice určené pro biologické použití včetně „drug delivery“ jsou definované jako částice s velikostí pod 1 μm²⁾. Jejich materiálové vlastnosti závislé na velikosti, jsou kvalitativně nové oproti vlastnostem původních surovin³⁾.

Emulzní metoda rozdělování a odpařování rozpouštědla je metoda umožňující využití i v průmyslu. Její velkou výhodou je vysoká kapacita pojmout dovnitř polymerních nanočástic účinnou látku⁴⁾ . Během emulgačního procesu je roztok obsahující rozpouštědlo s polymerem a účinnou látkou dispergován do vodné fáze obsahující tenzid⁵⁾ . Účinnost dispergace je ovlivněna mechanickým mísením, vyjádřeným Weberovým číslem⁶⁾ . Weberovo číslo (We) je poměr mezi LaPlaceovým tlakem a střihovým gradientem na mezifázi dvou vzájemně nemísitelných kapalin.

We = ηDr/γ,      [1]

kde η je viskozita vnější fáze, D rychlostní gradient, r poloměr kapek, γ mezifázové napětí.

LaPlaceův tlak Δp se liší podle zakřivení povrchu. Pro kouli je:

Δp = 2γ/r.          [2]

Tato rovnice vyjadřuje reciproční vztah mezi tlakem a velikostí částic dispergované kapalné fáze. Weberovo číslo je možné přepsat jako:

We = 2 ηD/Δp. [3]

Newtonova rovnice pro viskozitu je:

ηD = τ,               [4]

kde τ je střihové napětí, tj. síla na jednotku povrchu.

Z toho plyne, že Weberovo číslo je bezrozměrná veličina vyjádřená jako jednoduchý vztah mezi tlakem a střihovým napětím:

We = 2 τ/Δp.     [5]

Pro rozbití kapek vnitřní fáze je potřeba přesáhnout Weberovo číslo 1.

Je účinnější použít krátké, ale intenzivní turbulentní proudění⁷⁾ .

Dalším projevem mechaniky kapalin při emulgaci je ztráta kinetické energie vyjádřená koeficientem restituce (obnovení) COR. COR je definovaný jako poměr mezi rychlostí po a před kolizí s povrchem⁸⁾ :

COR = V_f/V_i.        [6]

Mezi We a COR není jednoduchý vzájemný vztah⁹⁾ .

Koalescence jako jev vedoucí ke zvětšování kapek v emulzi se vyskytuje při vyšší energii adheze kolidujících částic, než je energie uvolněná při turbulentním proudění¹⁰⁾ . Extrémně nízké mezipovrchové napětí překvapivě vede k nestabilitě systému¹¹⁾ .

Role tenzidu v mechanismu tvorby emulze je podstatná. Ovlivňuje jak Weberovo číslo, tak stabilizuje emulzi proti koalescenci. Polyvinylalkohol je velmi často používaným tenzidem pro přípravu polymerních nanočástic a mikročástic. Polyvinylalkohol je připravován částečnou hydrolýzou polyvinylacetátu, obvykle je stupeň zmýdelnění SD od 88 % do 97 %. Takové kopolymery s různou molekulovou hmotností jsou hydrofilní a povrchově aktivní. PVA je biokompatibilní a velmi stabilní.

Polyvinylalkohol byl použit nejen jako tenzid, ale zároveň i jako nosič pro nanočástice obsahující peptidové účinné látky. Při takovém složení již nebylo zapotřebí další povrchově aktivní látky¹²⁾ . Také bylo prokázáno, že čím vyšší je koncentrace PVA ve vnější vodné fázi (v rozmezí od 1 % do 5 %), tím menší částice vznikají, z 280 nm se velikost snížila na 200 nm¹³⁾. Murakami dokázal, že povrchová aktivita-emulgační schopnost je založena více na stupni hydrolýzy PVA než na molekulové hmotnosti¹⁴⁾ .

Polyvinylalkohol tvoří na povrchu částic vzájemně propojenou síť s polymerem. To má značný vliv na zeta potenciál částic¹⁵⁾ .  

POKUSNÁ ČÁST 

Materiál

Poly-DL kyselina mléčná (PDLLA) byla syntetizována na pracovišti autora polykondenzační reakcí bez katalyzátorů. Molekulová hmotnost byla Mw 4100 g/mol (Mw hmotnostní), Mw/Mn 2.30 (poměr mezi hmotnostně a číselně zjištěnou molekulovou hmotností) a byla stanovena pomocí SEC-MALLS (Size Exclusion Chomatography – Multi-Angle Laser Light Scattering), teplota skelného přechodu byla stanovena pomocí DSC (diferenciální skenovací kalorimetrií) Tg 17,0 °C. Pro analýzu dodaných vzorků byla použita sestava kapalinového chromatografu sestávající se z čerpadla a autosampleru Alliance 2695 Separations Module (Waters), rozptylového fotometru miniDAWN (Wyatt Technology Corporation), viskozimetru ViscoStar (Wyatt Technology Corporation) a diferenciálního refraktometru 2414 (Waters).

Polyvinylalkohol (PVA10), Mw 9000–10 000, z 80 % hydrolyzovaný, byl dodán firmou Aldrich Chemical Company, Inc.

Polyvinylalkohol (PVA15), Mw 15 000, z 86–89 % hydrolyzovaný, byl dodán firmou Fluka.

Polyvinyalkohol (PVA20), Mw 15 000–23 000, z 87–89 % hydrolyzovaný, byl dodán firmou Aldrich Chemical Company, Inc.

Ostatní rozpouštědla byla v analytické čistotě.

Určení molekulové hmotnosti polyvinylalkoholu pomocí viskozimetrie

Kinematická viskozita vodného roztoku polyvinylalkoholu o koncentraci od 0,10 do 2,00 % byla měřena Ubbelohdeho kapilárním viskozimetrem při 25 °C. Vnitřní viskozita η pro roztok polymeru v rozpouštědle byla vztažena k Mv podle rovnice Kuhn-Mark-Houwink-Sakurada:

η = K (M_v)^a.

Mark-Houwinkova konstanta (K = 2,0 . 10^-4; a = 0,76) pro PVA byla čerpána z práce Tao¹⁶⁾ .

Viskozita jednotlivých fází emulze

Dynamická viskozita 1,5% a 3,0% roztoku polyvinylalkoholu PVA 10, PVA 15, a PVA 20 ve vodné fázi a roztok PDLLA v chloroformu, dichlormethanu a směsi 50 : 50 obou chlorovaných uhlovodíků byla měřena viskozimetrem (Brookfield DV-E, Německo) při 25 °C, vřetenem č. 1, 100 ot./min.

Charakterizace mezipovrchového napětí

Obě fáze organická i vodná byly ponechány 24 hodin při 25 °C k ustálení rovnováhy. Mezipovrchové napětí bylo měřeno Wilhelmovou destičkovou metodou pomocí tenziometru Kruss 100 (Kruss, Německo) při 25 °C.

Formulace nanočástic

Pro přípravu nanočástic byla použita emulzní (o/v) metoda rozdělování a odpařování rozpouštědla. Byl použit 1 g organické fáze obsahující 10 mg PDLLA rozpuštěného v chloroformu, v dichlormethanu nebo jejich směsi v poměru 1 : 1. Organická fáze byla dispergována ve 49 g vodné fáze obsahující 1,5 % nebo 3,0 % PVA. Emulze byla míchána homogenizátorem s rotorem a statorem (Diax 900, Heidolph, Německo) při 26 000 ot./min, po dobu 60 s, při 25 °C. Vzniklá emulze byla smísena se 100 g destilované vody a po dobu 4 hod. byla udržována v pohybu na magnetické míchačce, dokud organické rozpouštědlo nepřešlo do vnější fáze a z větší části se neodpařilo.

Charakterizace nanočástic

Distribuce velikosti částic byla hodnocena metodou rozptylu světla (ZetaSizerem ZS, Malvern Instruments, UK). Každá nanosuspenze byla připravena ve třech vzorcích a byla měřena 3×.

Zeta potenciál byl měřen laserovým Dopplerovým velocimetrem jako elektroforetická mobilita suspenze za použití ZetaSizeru ZS (Malvern Instruments, UK). Měření byla prováděna při teplotě 25 °C.

Obsah PVA v nanočásticích byl analyzován Zwickovou metodou¹⁷⁾ podle Leeho et al.¹⁸⁾ . Nanosuspenze byla třikrát vymyta a centrifugována s 0,005% vodným roztokem dodecyl sulfátu sodného. Následně byly nanočástice hydrolyzovány při 60 °C v 0,5 mol . l^-1 roztoku NaOH. Barevný komplex vznikal po reakci mezi dvěma hydroxylovými skupinami PVA a molekulou jódu z KI₃. Barevný komplex jsme měřili spektrofotometricky při vlnové délce 685 nm (spektrofotometr Hélios Y, Thermo Scientific, USA).  

VÝSLEDKY A DISKUZE 

Při tvorbě nanočástic byla použita nízkomolekulární poly-DL kyselina mléčná. Výhody tohoto oligomerního biodegradabilního modelového nosiče jsou nízká viskozita vnitřní fáze při tvorbě nanoemulze a nízký stupeň bobtnání nanočástic v prvních dnech ve vodné suspenzi.

Polyvinylalkoholy použité v této práci byly vybrány z nízkomolekulárních sloučenin s nízkým stupněm zmýdelnění. Newtonské viskozitní chování všech roztoků polyvinylalkoholů bylo ve shodě se závěry Modaresse et al.¹⁹⁾ .

Mark-Houwinkova konstanta je v malém rozmezí ovlivňována molekulovou hmotností PVA^{20, 21)} . Průměrná molekulová hmotnost deklarovaná výrobcem Mw a viskozitně určená molekulová hmotnost Mv jsou uvedené v tabulce 1. Tabulka odhaluje malé rozdíly ve viskozitně určené molekulové hmotnosti.

V tabulce 2 jsou dva základní parametry (viskozita a povrchové napětí) vnější vodné fáze. Viskozity PVA 10 a PVA 15 si byly vzájemně velmi podobné v obou koncentracích 1,5 % a 3,0 %. PVA 10 se od ostatních vzorků liší nižším stupněm zmýdelnění SD 80 %, pravděpodobně je to způsobeno svinutým uspořádáním konformace a hustoty polymerní struktury.

Byly změřeny prakticky stejné hodnoty pro povrchovou aktivitu vnější fáze pro všechny tři polyvinylalkoholy. Z toho vyplývá, že molekulová hmotnost a koncentrace acetylovaných skupin neovlivňují agregaci molekul.

Dynamická viskozita 1 % roztoku PDLLA ve třech testovaných chlorovaných uhlovodících se lišila pouze v malém rozmezí (tab. 3). Mezipovrchové napětí bylo měřitelné s dobrou reprodukovatelností pouze u roztoku chloroformu. Nízkomolekulární frakce oligomerů migrovala na rozhraní mezi vodnou a organickou fázi. Sytil se vodný roztok což ovlivňovalo reprodukovatelnost měření mezipovrchového napětí. Podmínky na mezifázi mezi organickým roztokem PDLLA a vodným roztokem polyvinylalkoholů nedovolovaly měření viskozity pomocí destičky. Pohyb destičky během měření způsoboval emulgační proces na mezifázi.

Podle Antonovova pravidla vychází mezipovrchové napětí mezi fázemi jako rozdíl povrchových napětí jednotlivých fází.

Při aplikaci tohoto empirického pravidla je možno předpokládat, že budou velmi malé rozdíly v rovnovážných hodnotách mezipovrchového napětí mezi olejovou vnitřní fází obsahující PDLLA a vodnou fází s rozpuštěným polyvinylalkoholem.

Molekuly polyvinylalkoholu nenavázané na částice byly z vnější fáze odstraněny opakovaným vymýváním a centrifugací. V tabulce 4 jsou koncentrace polyvinylalkoholu zabudovaného do nanočástic. Zřetelně nejvyšší koncentrace emulgátoru byla naměřena uvnitř nanočástic připravených z dichlormethanové organické fáze. To je v souladu s prací Raye²²⁾ , který zjistil, že 51,7 % PVA zůstává uvnitř a na povrchu PLGA nanočástic připravených vysokotlakou homogenizací. Jako organická fáze byla použita relativně hydrofilní směs acetonu a dichlormethanu. Signifikantně vyšší koncentraci PVA uvnitř nanočástic z PLGA obsahovaly částice připravené z dichlormethanové organické fáze. Z méně polární chloroformové organické fáze vznikaly částice s nižším obsahem PVA¹⁵⁾. Autoři tento výsledek vysvětlují vhodnějšími podmínkami pro začlenění ve vodě rozpustného PVA do organické fáze, která je polárnější. Lépe se mísí s vodnou fází během dispergačního procesu a v částicích se tak objeví větší množství tenzidu.

Dvojnásobný nárůst koncentrace emulgátoru ve vodné fázi, měl za následek mírné zvýšení obsahu vázané frakce PVA (nepotvrdilo se u částic vzniklých ze vzorku s dichlormethanem). Stejný trend byl pozorován v práci Zambaux et al. Koncentrace polyvinylalkoholu vázaného v částicích mírně rostla se zvyšující se molekulovou hmotností použitého PVA. Polymer s vyšší molekulovou hmotností pravděpodobně tvoří na mezifázi silnější vrstvu, která je během emulgace začleněna do nanočástic. Koncentrace vázaného PVA je dále ovlivněna procesem vlastní emulgace. Důležitými faktory jsou rychlost mísení obou fází, viskozita vnitřní fáze, flexibilita polymerních řetězců a distribuce hydrofobních acetylových skupin v polymerní struktuře²³⁾ .

Zřetelně nejmenší částice byly připraveny z PDLLA rozpuštěném v dichlormethanu (obr. 1). Což je v souladu se závěry Malleta a Craiga²⁴⁾ , kteří stanovili, že lepší stabilizace pigmentových částic je pomocí nízkomolekulárního polyakrylátu sodného, oproti výše molekulárnímu polymeru rozpuštěném v méně polárním rozpouštědle.

Příčina vysoké variability distribuce velikosti částic připravených za pomoci směsi organických rozpouštědel dichlormethanu s chloroformem, je v nekontinuálním procesu distribuce rozpouštědla na mezifázi.

Účinnost 3 % PVA byla vyšší než účinnost systému s 1,5 % koncentrací polymerního tenzidu (obr. 2). Významný byl nárůst velikosti částic z 300 nm na 500 nm při dvojnásobném zvýšení koncentrace PVA 20. S rostoucí molekulovou hmotností PVA roste variabilita výsledků velikosti částic. Zároveň rostla velikost při použití chloroformu jako organického rozpouštědla. Proces solidifikace částic byl zpomalen silnější vrstvou na mezifázi a pomalejší distribucí rozpouštědla. Vznikaly tak částice s vyšší polydisperzitou.

Výsledky analýzy rozptylu potvrdily náš předpoklad (tab. 5). Velmi významný faktor ovlivňující velikost nanočástic je typ rozpouštědla jak PVA, tak PDLLA. Mezi těmito dvěma faktory byla testována interakce prvního řádu, založená hlavně na vlivu použitého rozpouštědla pro systém s různým emulgátorem. Statisticky nevýznamným faktorem se ukázala být koncentrace tenzidu. Byl to překvapivý výsledek, protože viskozita a povrchové napětí se dle PVA koncentrace významně lišily.

Negativní náboj nanočástic (tab. 6) byl způsoben karboxylovými skupinami PDLLA. Adsorpce výše molekulárního polyvinylalkoholu na povrch částic snižovala elektrokinetické vlastnosti částic mechanismem sférického stínění. Nanočástice připravené za použití 1,5 % PVA 10 vykazovaly maximální náboj. Stejný PVA 10 jen ve dvojnásobné koncentraci významně snížil zeta potenciál. PVA 15 a PVA 20 se chovaly kvalitativně stejně. Zeta potenciál nanočástic byl velmi silně ovlivněn změnami koncentrace polymeru. Pravděpodobně je to způsobeno hustotou adsorpční vrstvy na mezifázi. Změny v organickém rozpouštědle neovlivnily elektrokinetické parametry nanočástic.

Konečné výsledky analýzy rozptylu v plném tří faktorovém schématu jsou uvedeny v tabulce 7. Druh organického rozpouštědla PDLLA logicky neovlivnil hodnoty zeta potencionálu. Zatímco oba faktory – druh a koncentrace PVA významně ovlivňují zeta potenciál.

ZÁVĚR 

Byl dokázán významný rozdíl v parametrech distribuce velikosti částic připravených metodou rozdělování a odpařování rozpouštědla v závislosti na složení vnější a vnitřní fáze.

Weberovo číslo založené na vztahu mezi střihovým napětím a silou na mezifázi nepostačuje jako obecná charakteristika disperzního procesu dvou omezeně mísitelných kapalin. Dispergování a solidifikace částic probíhají současně.

Došlo 6. května 2011

Přijato 6. června 2011

Adresa pro korespondenci:

Mgr. Eva Valentová

M. Majerové 283, 533 53 Pardubice

e-mail: valentova.eva@seznam.cz