Současné možnosti preimplantačního genetického screeningu a preimplantační genetické diagnostiky

Souhrn

Cíl studie:
Cílem této práce je shromáždit aktuální informace o možnostech preimplantačního genetického screeningu a diagnostiky.

Typ studie:
Souhrnný článek.

Název a sídlo pracoviště:
Gynekologicko-porodnické oddělení Nemocnice Šternberk, IVF Clinic Olomouc.

Výsledky:
Preimplantační genetické testování představuje soubor genetických a molekulárně cytogenetických vyšetření, s jejichž pomocí můžeme odhalit abnormality embrya ještě před jeho přenosem do dělohy matky. Toto specializované vyšetření vychází z nejnovějších poznatků genetiky a asistované reprodukce. Preimplantační genetické testování je nutně spojeno s metodou in vitro fertilizace a provádí se na izolovaných blastomerách třetí den kultivace embrya. V současnosti však bývá preferováno vyšetření buněk trofoektodermu z pětidenních blastocyst. Obecně lze konstatovat, že po provedení preimplantačního genetického testování lze k transferu do dělohy vybrat pouze embrya bez genetické zátěže.

Závěr:
Preimplantační genetické testování je v současné době důležitou součástí léčby neplodnosti. Komplexní diagnostika a léčba neplodných párů je stále více ovlivňována rozvojem a využitím moderních genomických technologií. Další rozvoj a aplikace těchto metod vyžaduje úzkou spolupráci mezi obory asistované reprodukce a klinické genetiky.

Klíčová slova:
preimplantační genetický screening, preimplantační genetická diagnostika, fluorescenční in situ hybridizace, PGS, PGD, FISH, aCGH, karyomapping, NGS

ÚVOD

Vysoký výskyt chromozomálních aneuploidií u embryí vede ke snížení šance na porod zdravého dítěte. Jedná se o nejčastější a nejvýznamnější příčinu lidské neplodnosti. Tyto aneuploidie vznikají jako důsledek chybné segregace chromozomů v průběhu ženské meiózy, méně často v průběhu mitóz u embrya. Mužská meióza je vzácnou příčinou těchto aneuploidií. Genetické testování embrya před přenosem zvyšuje šanci na otěhotnění, snižuje incidenci potratů a předchází opakovaným IVF cyklům u pacientů s vysokým výskytem aneu­ploidií. První z technik, využívající se dodnes, je mikroskopické posouzení morfologie embrya. Existují však četné vývojové vady, které morfologii embrya nemění. Až 50 % morfologicky normálních blastocyst může být aneuploidní [11].

PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ VYŠETŘOVÁNÍ SE TERMINOLOGICKY ROZDĚLUJE NA DVĚ SKUPINY

1. Preimplantační genetická diagnostika

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) se ve světě provádí zhruba od počátku 90. let 20. století. První klinické výsledky publikovali Handyside et al., kteří prováděli preimplantační stanovení pohlaví embryí u párů s rizikem chorob vázaných na pohlaví [5]. Při PGD provádíme cílené genetické vyšetření, které umožňuje transfer geneticky nepostiženého embrya rodičům, u kterých byla prokázána konkrétní chromozomová aberace (např. reciproká či robertsonovská translokace) nebo konkrétní monogenně dědičná dominantní recesivní či X-vázaná choroba. Cílem PGD je tedy výběr takového embrya, které není postiženo zkoumanou genetickou vadou přítomnou u některého z rodičů. K embryotransferu můžeme rovněž připustit geneticky zatížené embryo – přenašeče. To však vede k narození zdravého dítěte, taktéž přenašeče dané choroby [2, 10, 25].

Mezi indikace k provedení PGD patří:

Strukturní chromozomové aberace (balancované či robertsonská translokace, eventuálně závažné inverze), monogenně podmíněné nemoci s rizikem postižení plodu, a to autozomálně recesivní choroby (spinální muskulární atrofie, cystická fibróza), autozomálně dominantní choroby buď s časným nástupem (skeletální dysplazie, neurofibromatóza, Marfanův syndrom), nebo s pozdním nástupem klinických příznaků (myotonická dystrofie, polycystóza ledvin dospělého typu, Huntingtonova chorea, nádory s hereditární dispozicí, např. karcinom prsu a ovarií, familiární adenomatózní polypóza – FAP), choroby vázané na pohlaví (Duchenneova/Beckerova svalová dystrofie, hemofilie, syndrom fragilního chromozomu X), vyšetření pohlaví u chorob vázaných na pohlaví, kde není možná přímá diagnostika, HLA typizace embrya v přísně indikovaných případech, kdy je v rodině dítě se závažnou chorobou (např. leukemií), které vyžaduje transplantaci buněk kostní dřeně s maximální shodou v HLA znacích.

Ve všech případech preimplantačního genetického vyšetření je nezbytná genetická konzultace s lékařem se specializovanou způsobilostí v oboru lékařská genetika, kde budou vysvětleny principy a potenciální rizika tohoto vyšetření, spolehlivosti preimplantačního genetického testování, možnosti rizik falešně negativních výsledků, rizik neočekávaných nálezů, včetně podpisu informovaného souhlasu v souladu s ustanoveními zákona 373/2011Sb § 28-29 [21].

2. Preimplantační genetický screening

Preimplantační genetický screening (PGS) bývá prováděn párům s normálním karyotypem. Zaměřuje se zejména na vyšetření aneuploidií chromozomů, což umožňuje zvýšit úspěšnost metod asistované reprodukce ženám vyšších věkových skupin nebo ženám s opakovanými aborty či neúspěchy v předchozích IVF cyklech.

Mezi hlavní indikace k PGS patří:

Vyšší věk ženy – nad 35 let v době očekávaného porodu, opakované neúspěchy předchozích cyklů asistované reprodukce, opakované potrácení po vyloučení ostatních možných příčin, početní gonozomové aberace (např. 47,XXX, 47,XYY) a malé gonozomové mozaiky detekované z periferní krve – nad 10 %, andrologický faktor neplodnosti (např. těžká oligo-asteno-teratospermie) nebo použití spermií získaných metodou MESA/TESE v asistované reprodukci, porod nebo potrat dítěte (plodu) s chromozomální aneuploidií, chemoterapie nebo radioterapie u jednoho či obou partnerů v anamnéze [21].

ODBĚR MATERIÁLU

Preimplantační genetické testování je nutně spjato s metodou IVF. Za pomocí laseru se provádí biopsie jedné nebo více buněk embrya. Tuto biopsii lze provést ve stadiu třídenního embrya, které má typicky šest až osm blastomer. Odebírají se jedna až dvě blastomery. Některá embrya však mohou být postižena tzv. chromozomálním mozaicismem. Jedná se o postzygotickou poruchu mitotické disjunkce buněk, kdy jsou z jedné zygoty segregovány dvě nebo více buněčných linií. Při odběru a analýze menšího počtu buněk je pravděpodobné, že se neodhalí případné mozaiky. Mozaiky v embryích mohou způsobit např. spontánní aborty, uniparentální dizomie, gonozomální nebo autozomální trizomie.

V současnosti se stále více pracovišť uchyluje k biopsii pětidenních embryí. Při biopsii pětidenních nebo šestidenních embryí je bioptováno pět až šest buněk trofektodermu z embrya ve stadiu blastocysty. Její výhodou je šetrnost k embryu, protože se odebírá několik buněk trofektodermu, ze kterého později vzniká placenta a plodové obaly. Embryoblast zůstává nedotčen. Embrya jsou následně zamrazena šetrnou vitrifikací. Vzhledem k časové náročnosti následujícího genetického vyšetření se přenos vybraného embrya do dělohy provede až v následujícím cyklu ženy. Odpadá časová tíseň genetiků, protože přenos embrya je plánován až v dalším cyklu. Další výhodou vyšetření blastocysty je eliminace mozaicismu, protože se nevyšetřuje jediná buňka, ale hned několik buněk současně. Mozaicismus je tak možno detekovat a embrya s mozaikou nedoporučit pro přenos [9].

Dalším potřebným krokem je amplifikace získané DNA. Všechny současné metody celogenomové amplifikace jsou založeny na použití polymerázové řetězové reakce (PCR) nebo fungují na principu mnohočetné amplifikace s vytěsňováním řetězce (MDA, multiple diplacement amplicifation).

METODY PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ DIAGNOSTIKY A PREIMPLANTAČNÍHO GENETICKÉHO SCREENINGU

FISH (fluorescenční in situ hybridizace)

První metodou, která se zhruba od devadesátých let 20. století užívala k vyšetření chromozomových odchylek embryí byla interfázní fluorescenční in situ hybridizace (I-FISH). Pro tyto účely byly využívány speciální komerčně dostupné kity se směsí několika centromerických a lokusově specifických DNA sond, pomocí kterých byly vyšetřovány aneuploidie chromozomů v polárních tělíscích a blastomerách. V jedné buňce bylo možné analyzovat početní odchylky 5–15 chromozomů [1, 13].

Pro tento typ diagnostiky se nejčastěji využívaly sondy, které hybridizují k chromozomům 13, 16, 18, 21, 22, X a Y. Za největší nevýhodu této techniky je považováno to, že touto metodou nelze vyšetřit všechny chromozomy buňky. Aneuploidií však může být postižen kterýkoli chromozom v karyotypu. Tento cílený screening aneuploidií rovněž neodhalí segmentální přestavby, jako jsou duplikace či delece části ramen chromozomů. Ze zkušeností mnoha pracovišť a z výsledků retrospektivních analýz vyplývá, že screeningové vyšetření jedné až dvou blastomer odebraných třetí den po IVF založené na technice FISH nezvyšuje úspěšnost implantace a následného otěhotnění [7, 12]. Tento fakt může souviset také s vysokým podílem mozaicismu a mitotické chromozomové nestability přítomné v raných embryích [26].

Metoda I-FISH se tak stává obsolentní v oblasti preimplantačních genetických analýz a nahrazují ji celogenomové technologie založené na DNA mikročipech. Jejich předností je schopnost vyšetřit početní změny všech 23 párů chromozomů embrya. Navíc umožňují odhalit segmentální nebalancované strukturální změny všech chromozomů. Ty mohou vzniknout de novo v důsledku postzygotických mitotických poruch nebo mohou být zděděny v důsledku meiotické segregace od rodičů – nositelů translokačních přestaveb. Nové techniky, které fungují na principu komparativní genomové hybridizace na DNA mikročipech (array-CGH), mohou být proto použity jak pro účely PGD nebalancovaných chromozomových abnormalit, tak pro provádění PGS zaměřeného na vyšetření aneuploidií chromozomů. Prokazuje se, že vyšetření embryí s využitím technologie single cell array-CGH vede ke zvýšení úspěšnosti implantace a následného otěhotnění, snižuje četnost abortů a přináší výrazný klinický benefit z hlediska otěhotnění i u žen vyšších věkových skupin [8, 17, 19].

a-CGH (array komparativní genomová hybridizace)

Techniku array-CGH poprvé popsal v roce 1997 Solinas-Toldo et al. [20]. Díky své vysoké citlivosti a celogenomovému přístupu se tato technika stala hojně využívanou v oblasti postnatální a nádorové cytogenetické diagnostiky. Metody využívající array-CGH jsou založeny na hybridizaci nukleových kyselin k DNA mikročipům, což jsou speciálně upravená mikroskopická skla obsahující desítky až stovky tisíc sekvencí vybraných lidských genů. V principu je tato metoda založena na srovnání počtu kopií DNA sekvencí u dvou genomů – testovaného (pacienta) a referenčního (normální). DNA každého genomu je po izolaci označena odlišným fluorochromem, pak jsou DNA smíchány a hybridizovány na DNA sondy imobilizované na povrchu hybridizačního skla. Výsledek hybridizace je odečítán pomocí čtecího zařízení (scanneru), který hodnotí poměr intenzit zelené a červené fluorescence. Získané údaje jsou zpracovávány speciálními programy, které provádí statistické vyhodnocení naměřených dat. Výsledkem vyšetření je grafický celogenomový profil zkoumaného vzorku, na jehož základě určujeme zisky či ztráty jednotlivých chromozomů (aneuploidie), jejich částí (segmentální změny), nebo dokonce zisky nebo ztráty jednotlivých genů.

Podle druhu použitých sond navázaných na nosném médiu rozlišujeme dva hlavní typy DNA mikročipů – tzv. BAC a oligonukleotidové mikročipy, které se liší zejména v rozlišovací schopnosti [16]. Mikročipy založené na BAC sondách (bacterial arteficial chromosomes) obsahují několik tisíc DNA sond izolovaných z klonů umělých bakteriál­ních chromozomů o velikosti 150–200 kb a rozlišení těchto čipů je omezeno na 50–100 kb [15]. Oligonukleotidové mikročipy obsahují DNA sondy o velikosti 25–85 nukleotidů a jejich rozlišovací schopnost je tak výrazně vyšší.

K dalším stimulům, které umožnily současný rozmach využití mikročipových technologií pro účely preimplantačního genetického testování, patří vyšetření buněk odebíraných ve vyšších embryonálních stadiích a zdokonalení technik kryokonzervace embryí metodou šetrné vitrifikace. V poslední době bylo prokázáno, že biopsie blastomer z třídenního embrya může významně snížit implantační potenciál embrya [18]. Stále více pracovišť se namísto vyšetření jedné až dvou blastomer z třídenního embrya uchyluje k odběrům a následnému genetickému vyšetření pěti až deseti buněk trofoektodermu z blastocysty pátý až šestý den embryonálního vývoje. Vyšetření prováděné z většího množství materiálu buněk poskytuje jednak více DNA, ale vede též ke zpřesnění diagnostiky, a to zejména s ohledem na přítomnost blastocyst s mozaikami. Zdokonalení vitrifikačních metod umožňuje efektivní uchování bioptovaných blastocyst a jejich transfer v následujícím cyklu, což poskytuje dostatek času k provedení genetického vyšetření [10].

Karyomapping

Karyomapping je metoda využívající SNP čipy (single nucleotid polymorfism). Fungují na stejné bázi jako oligonukleotidové čipy, s tou výhodou, že dokážou detekovat i jednonukleotidové polymorfismy. Celá řada lidských monogenně podmíněných onemocnění může vzniknout na podkladě jednonukleotidových variací.

Karyomapping umožňuje nepřímou genetickou diagnostiku z jedné buňky pomocí vazebné analýzy na všech chromozomech současně. Vzniká tzv. karyomapa, která je na rozdíl od karyotypu schopna určit původ každého úseku chromozomu, který je unikátní pro každého jedince a je definovaný nezávislou segregací rodičovských chromozomů [6]. Jako první užil karyomapping v roce 2009 profesor Alan H. Handyside, který je považován za jednoho z nejvýznamnějších průkopníků preimplantační genetické diagnostiky. Touto metodou se jako první zaměřil na diagnostiku monogenních onemocnění, a to konkrétně na mutaci alel transmembránového receptoru pro cystickou fibrózu (CFTR), která způsobuje autozomálně recesivní, život ohrožující onemocnění [6].

Procesu analýzy za pomocí karyomappingu předchází odběr buněk trofektodermu, celogenomová amplifikace metodou MDA a následná hybridizace na SNP čipech. Získaná data z čipů se importují přímo do speciálního softwaru pro karyomapping [14]. Jako referenční vzorek se použije DNA obou rodičů nebo DNA postiženého člena rodiny.

Karyomapping, jakožto univerzální metoda diagnostiky genetických chorob, může teoreticky detekovat všechny známé dědičné mutace. Díky této metodě již bylo v minulosti detekováno mnoho monogenních chorob. Jako další příklad lze uvést výzkum Natesana et al., kteří se zaměřili na detekci mutace pro Praderův-Williho, Angelmanův a Smithův-Lemliův-Opitzův syndrom [14]. Ve svém obsáhlém článku se zabývali identifikací monogenních onemocnění pomocí karyomappingu. Dále se zabývali také Huntingtonovou choreou, β-talasemií, Duchennovou muskulární dystrofií, Gaucherovou chorobou, zohlednili Peutzův-Jeghersův syndrom a Criglerův-Najjarův syndrom. V neposlední řadě se věnovali i detekci genetických predispozic rakoviny, a to konkrétně BRCA1 a BRCA2. Na tuto práci navázal článek o detekci Marfanova syndromu pomocí karyomappingu [23].

S postupem času stále přibývá nových onemocnění, k jejichž detekci lze aplikovat metodu karyomapping.

NGS (next generation sequencing)

V poslední době se do popředí dostávávají i metody NGS. NGS je oproti jiným metodám preimplantačního genetického testování přímou DNA diagnostikou. Stejně jako karyomapping je metoda NGS schopna analyzovat všechny chromozomy najednou. NGS na rozdíl od dřívější metody sekvenace, tzv. Sangerovy metody, umožňuje rychlou sekvenaci celého genomu během jediného dne. Celý proces NGS se skládá z přípravy templátu, sekvenování s detekcí inkorporovaných nukleotidů a analýzou dat. Jednotlivé principy v NGS se liší použitím jiného typu sekvenátoru, kdy se využívá jiných chemických složek. Sdílejí ale společný znak, a to masivně paralelní sekvenování amplikonů nebo jednotlivých molekul DNA [2].

Pokud porovnáme karyomaping a NGS, významně se neliší. Obě metody jsou velmi přesné, téměř stoprocentně, s vysokým rozlišením a mohou detekovat monogenní a chromozomové onemocnění současně. NGS je DNA diagnostikou přímou, zatímco karyomapping DNA diagnostikou nepřímou. Výraznějším omezením karyomappingu oproti NGS je neschopnost detekovat mitochondriální a de novo mutace [24]. Na druhou stranu NGS není způsobilá odhalit balancované translokace a původ vyšetřené mutace [4].

Několik studií rovněž srovnává výsledky aCGHs NGS. Podle dostupných studií jsou výsledky získané na podkladě NGS shodné s vyšetřením metodou aCGH. Studie ukazují, že NGS je vhodnou metodou pro rutinní preimplantační genetické testování [11].

CHYBY PREIMPLANTAČNÍHO GENETICKÉHO TESTOVÁNÍ

Výše uvedené metody jsou velmi přesné. I přesto jsou sporadicky popsány případy, u kterých byly závěry preimplantačního genetického testování chybné. Jako příklad lze uvést nesprávné stanovení pohlaví dítěte nebo neodhalení aneuplodie embrya. Studie, která byla provedena na vzorku 520 embryotransferů od roku 2010 do roku 2014 metodou aCGH, uvádí záchyt pěti chybných diagnóz. Selhání metody bylo 0,9 % na počet transferovaných embryí, 1,5 % u prokázaných intrauterinních gravidit, 0,7 % u živě narozených dětí, 17,6 % u spontánních abortů.

Existuje několik možností, jak vnést do procesu preimplantačního genetického testování chybu. Nejpravděpodobnější z nich je nesprávně provedený odběr. V případě biopsie z trofektodermu zůstává nejasné, zda je odběr malého počtu buněk reprezentativní pro celý trofektoderm. Vzorky mohou být kontaminovány cizí DNA, tuto kontaminaci nelze nikdy zcela eliminovat. Výsledky může rovněž zkreslovat nechráněný pohlavní styk v průběhu preimplantačního genetického testování, který může vést k implantaci nevyšetřeného embrya. De novo chromozomální chyby mohou také vznikat sekundárně jako postzygotické mitotické změny. aCGH využívá technologii PCR, u které může teoreticky dojít k chybné amplifikaci. aCGH je schopno detekovat mozaicismus, jeho míra může být však různá, a proto mozaicismus nelze nikdy zcela vyloučit.

Chybné diagnózy jsou považovány za nežádoucí, zejména pokud vedou k narození postiženého dítěte nebo vedou k ukončení těhotenství. O riziku spjatém s chybným výsledkem vyšetření by měli být pacienti předem poučeni. Těhotným ženám, které využívají metody preimplantačního genetického testování by měla být následně nabídnuta možnost prenatálních diagnostických testů k potvrzení preimplantační diagnostiky [22].

ZÁVĚR

Výsledky léčby ovlivňuje zejména načasování biopsie (preference pětidenních až šestidenních embryí, z buněk trofektodermu) a genetické nástroje (technika). Je zaznamenán jasný odklon od metody FISH s preferencí aCGH, karyomappingu a nově i NGS. Je nutné počítat i s variantou, že na základě testování nebude léčenému páru doporučeno ani jedno embryo k transferu. I přes vynikající citlivost uvedených metod nelze zaručit stoprocentní výsledek. Existují zde určité zdroje chyb, o kterých by pacienti měli být informováni.

Preimplantační genetické testování je v současné době důležitou součástí správné léčby neplodnosti. Komplexní diagnostika a léčba neplodných párů je stále více ovlivněna rozvojem a využitím moderních genomických technologií. Další rozvoj a aplikace těchto moderních metod vyžaduje úzkou spolupráci mezi obory asistované reprodukce a klinické genetiky.

MUDr. Veronika Šimečková

Josefa Beka 484/4

783 01 Olomouc

e-mail: veronika.simeckova@ivfclinic.cz