Preeklampsie a trombin generační test

Souhrn

Cíl studie:
Získání nových informací umožňujících predikci rozvoje chorob spojených s poruchou koagulace. U gravidních žen s preeklampsií a hypertenzí ve srovnání s ženami s normálním těhotenstvím by mohlo docházet k vyšší generaci trombinu v důsledku synergického působení jednotlivých rizikových faktorů. Tato riziková skupina by pak mohla výrazně profitovat z přísnější dispenzarizace a eventuální preventivní terapie profylaktickými dávkami LMWH, a mohlo by tak dojít ke snížení mateřské a perinatální morbidity a mortality.

Typ studie:
Prospektivní studie.

Název a sídlo pracoviště:
Porodnicko-gynekologická klinika LF UP a FN, Olomouc.

Metodika:
Na začátku gravidity - v době standardních těhotenských odběrů (do konce I. trimestru) byla pacientkám odebrána venózní krev a vyplnily informační dotazník. Druhý odběr byl proveden v období 24.–28. týdne, třetí vzorek potom mezi 36.–40. týdnem. Získané krevní vzorky byly následně zpracovány v koagulační laboratoři Hemato-onkologické kliniky FN a LF UP Olomouc. Z krevních vzorků byl vyšetřován protein C a S, antitrombin, hladina FVIII, FII, leidenská mutace, plazmatické a endoteliální mikropartikule, a dále lupus antikoagulans a APC rezistence standardizovanými metodikami. Generace trombinu byla stanovena trombin generačním testem plně automaticky pomocí kitu (Technothrombin TGA, Technoclone, Vienna, Austria) a analyzátoru Ceveron Alpha (Technoclone, Vienna, Austria) s automatickým vyhodnocovacím softwarem. Jako hlavní parametr je vyhodnocováno maximum generace trombinu, současně však bylo detekováno také celkové množství trombinu a doba do počátku tvorby trombinu.

Výsledky:
V letech 2008–2011 byly analyzovány krevní vzorky 303 zdravých těhotných. Celkem 215 žen, tj. 71 %, byly primipary, 60 žen, tj. 19,8 %, byly sekundipary, 28 žen, tj. 9,2 %, byly tercipary. Průměrný věk těhotných žen byl 28,6 let (± 3,8 let). Průměrná hmotnost rodiček na začátku gravidity byla 63,6 kg (± 7,8 kg). Z celkového počtu 303 žen se u 18 (6 %) vyvinul lehčí až středně těžký stupeň preeklampsie nebo HELLP syndrom s různou tíží klinické manifestace. Dvacet tři rodiček bylo zařazeno do studie ve III. trimestru při manifestaci preeklampsie. Dvacet rodiček (6,6 %) porodilo předčasně před ukončeným 37. týdnem gravidity. Tři těhotenství (0,9 %) byla ukončena z genetické indikace pro vrozenou vadu plodu. Kompletní protokol studie (odběry ve všech třech trimestrech) tedy absolvovalo 280 těhotných. Ze tří hodnocených paramentrů Lag time, ETP a peak jsme zaznamenali signifikantní rozdíly při porovnání fyziologických těhotenství a těhotenství s preeklampsií při statistické hladině p < 0,01, u těhotenství s chronickou hypertenzí však tyto rozdíly významné nebyly. Porovnání 18 těhotných, u nichž se ve III. trimestru vyvinula preeklampsie, s ostatními těhotnými s fyziologickou graviditou neprokázalo statisticky významné rozdíly v I. a II. trimestru. Výsledky svědčí pro aktivaci koagulace až v pozdních fázích těhotenství. Výsledky jsou však ovlivněny výraznou klinickou variabilitou onemocnění. U těžkých, resp. časných preeklampsií tato aktivace i signifikantní rozdíly nastupují podstatně dříve.

Závěr:
Potvrdili jsme signifikantně vyšší aktivaci generace trombinu u těhotných s preeklampsií [10]. Změny u preeklampsie jsou tedy charakterizovány zvýšenou generací trombinu v plazmě.Tento fakt může vysvětlit částečný klinický úspěch podávání kyseliny acetylosalicylové u preeklampsie. Ve třetím trimestru v době manifestního onemocnění mají preeklamptičky signifikantně vyšší ETP v porovnání s fyziologickým těhotenstvím a normotenzí. Těhotné s chronickou hypertenzí rovněž vykazují mírný nárůst aktivace trombinu. Tyto výsledky však nejsou statisticky signifikantní. Vyšetření koagulace v prvním a druhém trimestru u žen, u nichž se později vyvinula preeklampsie, nevykázalo statisticky významné rozdíly, a nelze jej tedy využít v tomto případě jako prediktivní, ale jako pouze diagnostický test.

Kľúčové slová:
trombin generační test – těhotenství – koagulace – preeklampsie

ÚVOD

Dobře fungující hemostáza je závislá na vzájemném fungování prokoagulačních faktorů a zároveň na činnosti inhibitorů koagulačního a fibrinolytických sytémů [3]. Ve fyziologicky probíhající graviditě je rovnováha těchto systémů posunuta směrem k hyperkoagulaci, což je nejmarkantnější v době těsně před porodem a po porodu. Návrat k normálu nastává nejdříve za 4 týdny po porodu. Během těhotenství dochází k progresivnímu nárůstu hladiny faktoru IX, X, XII, von Willebrandova faktoru, faktoru VIII. Faktor V stoupá v rané graviditě a poté dochází k jeho poklesu a stabilizaci, zatímco faktor XI klesá během celého těhotenství.

TRADIČNÍ HODNOCENÍ FUNKCE HEMOSTÁZY

Dosud užívané hodnocení funkce koagulačního systému je založeno na měření tradičních koagulačních časů, jako je aktivovaný parciální tromboplastinový čas (aPTT), protrombinový test (PT, Quickův test), trombinový čas (TT) nebo jejich alternativy, které sledují v laboratorních podmínkách dobu od zahájení koagulační reakce do vytvoření fibrinové sraženiny. Tyto testy jsou vhodné k orientačnímu zhodnocení případného rizika krvácení nebo k monitorování příslušné antikoagulační terapie. K hodnocení trombotického stavu je užít nelze. Další širokou skupinou laboratorních vyšetření představují testy sloužící ke kvantitativnímu, popř. kvalitativnímu stanovení jednotlivých koagulačních faktorů nebo inhibitorů, složek fibrinolytického systému a přítomnosti nespecifických (antifosfolipidové protilátky) nebo specifických inhibitorů krevního srážení. Moderní molekulárně genetické testy již rutinně umožňují vyšetření vrozených trombofilních dispozic, jako jsou mutace faktoru V Leiden nebo protrombinová mutace [1, 2, 13]. K vyšetření funkce krevních destiček je k dispozici několik možností. Mezi klinicky nejužívanější patří vyšetření agregace trombocytů nebo funkční test PFA-100; měření času krvácení (krvácivost) patří mezi testy hrubě orientační. Zavedené laboratorní koagulační metody vždy postihují pouze část hemostatického systému a vůbec neodrážejí vztah plazmatických a buněčných složek. Přes nesporné pokroky v laboratorní hemostazeologii ale stále zůstává část pacientů, u kterých závažný klinický průběh nekoreluje s výsledky dostupných vyšetření. Jde především o idiopatické či recidivující tromboembolické komplikace bez laboratorního průkazu trombofilního stavu.

MĚŘENÍ GENERACE TROMBINU

Filozofie měření trombinové generace vychází z postavení trombinu v koagulačním procesu, kde představuje centrální enzym. Trombin zajišťuje aktivaci krevního srážení, zároveň ale v pokročilých fázích procesu zprostředkovává samotnou inhibici hemostatických pochodů, hraje významnou roli v mezibuněčné signalizaci, ovlivňuje fibrinolýzu a zánětlivé procesy. Uvedené funkce jsou realizovány skrze plejádu enzymatických reakcí, které vyžadují těsnou koordinaci. V řadě reakcí vystupuje trombin jako enzymatický substrát, jindy působí jako kofaktor. Jeho úloha v hemostáze je multifunkční, občas i bivalentní. Monitorování tvorby trombinu se jeví jako vhodný postup pro globální vyšetření funkce hemostázy.

Laboratorní sledování generace trombinu jednoduchým testem bylo poprvé popsáno Macfarlanem a Pitneym již v roce 1953 [11, 12]. Principem dnes používaných automatizovaných měření je in vitro monitorace vzniku trombinu v plazmě po aktivaci koagulační kaskády tkáňovým faktorem (TF). Reakce probíhá za účasti negativně nabitých fosfolipidů a Ca²⁺. TF a koncentrace fosfolipidů se používá v různých koncentracích v závislosti na typu používané plazmy a charakteru vyšetření (by-passová léčba u hemofiliků, trombofilní stav, antikoagulační léčba). Generovaný trombin štěpí chromogenní nebo fluorogenní substrát, který je odpovídající metodou detekován. Nevýhodou chromogenních substrátů je jejich pomalejší štěpení trombinem, nižší afinita k trombinu a potřeba blokace vzniku fibrinu ve vyšetřované plazmě. Použití fluorogenního substrátu je vhodnější navíc i proto, že generovaný fluorogenní signál není rušen vznikající sraženinou ani přítomností trombocytů. 

Výsledkem měření je křivka odrážející aktuální kapacitu systému pro generaci trombinu, která je charakterizována třemi hlavními parametry: dobou do nástupu generace trombinu (lag fáze), maximální koncentrací trombinu (peak) a plochou pod křivkou, odrážející celkové množství vzniklého trombinu (endogenní trombinový potenciál, ETP). K vyšetření lze použít plazmu chudou na destičky (PPP) nebo plazmu na destičky bohatou (PRP). Z technického hlediska během vývoje vznikla řada variant testu, používajících různé koncentrace tkáňového faktoru a fosfolipidů, přidání inhibitoru kontaktní fáze nebo trombomodulinu [4–6, 8, 15, 16].

Cílem naší práce bylo porovnání generace trombinu u žen s preeklampsií a žen s fyziologickým těhotenstvím. Mělo by docházet ke zvýšení TGT vlivem synergického působení jednotlivých trombofilních rizikových faktorů.

V období let 2008–2011 byly analyzovány krevní vzorky celkem 303 zdravých těhotných. Rodičky zařazené do této skupiny měly negativní osobní a bezvýznamnou rodinnou anamnézu. Celkem 215 žen, tj. 71 %, byly primipary, 60 žen, tj. 20 %, byly sekundipary, 28 žen, tj. 9,2 %, byly tercipary. Průměrný věk těhotných žen byl 28,6 let (± 3,8 let). Průměrná hmotnost rodiček na začátku gravidity byla 63,6 kg (± 7,8 kg). Průměrný váhový přírůstek činil 12,03 kg (± 3,4 kg), průměrná výška rodiček byla 168 cm (± 4,6 cm).

Z celkového počtu 303 žen se u 18 (6 %) vyvinul lehčí až středně těžký stupeň preeklampsie nebo HELLP syndrom s různou tíží klinické manifestace. Dvacet tři rodiček bylo zařazeno do studie ve III. trimestru při manifestaci preeklampsie. Dvacet rodiček (6,6 %) porodilo předčasně před ukončeným 37. týdnem gravidity. Tři těhotenství (0,9 %) byla ukončena z genetické indikace pro vrozenou vadu plodu. Kompletní protokol studie (odběry ve všech třech trimestrech) tedy absolvovalo 280 těhotných. Dále jsme vyšetřili v jednotlivých trimestrech 15 těhotných s chronickou hypertenzí, 40 gestačních diabetiček a 30 těhotných žen s diabetem I. typu.

LABORATORNÍ VÝSLEDKY

shrnují tabulky 1 a 2 a grafy 1–4.

Výsledky hodnocení generace trombinu u fyziologických gravidit odpovídají údajům v literatuře. Lag time, tedy doba do začátku tvorby trombinu zůstává po celou dobu těhotenství stabilní a výsledky, resp. rozdíly nejsou statisticky signifikantní. ETP (endogenní potenciál trombinu neboli plocha pod křivkou) odpovídající množství aktivovaného trombinu v průběhu těhotenství roste. Signifikantní nárůst jsme pozorovali v rozdílech mezi I. a III. trimestrem. Podobně peak, neboli maximální hodnota koncentrace trombinu, vytváří signifikantní rozdíl mezi I. a III. trimestrem

ETP a peak tedy v průběhu těhotenství signifikantně narůstají, lag time se nemění.

Hodnoty ostatních koagulačních parametrů jsou uvedeny v tabulce 2 a grafu 4. Pozorovali jsme signifikantní nárůst faktoru II a VIII a dále pokles volného proteinu S. U proteinu C došlo rovněž k poklesu, rozdíl však nebyl signifikantní, podobné výsledky jsme zaznamenali u antitrombinu.

LABORATORNÍ HODNOTY U RIZIKOVÝCH SKUPIN

Laboratorní hodnoty u rizikových skupin preeklampsie a chronická hypertenze ukazují tabulky 3–5 a grafy 5–8.

Ze tří hodnocených paramentrů lag time, ETP a peak jsme zaznamenali signifikantní rozdíly při porovnání fyziologických těhotenství a těhotenství s preeklampsií (tab. 3 a grafy 5–7) při statistické hladině p < 0,01, u těhotenství s chronickou hypertenzí však tyto rozdíly významné nebyly. Zajímavé porovnání 18 těhotných, u nichž se ve III. trimestru vyvinula preeklampsie, s ostatními těhotnými s fyziologickou graviditou neprokázalo statisticky významné rozdíly v I. a II. trimestru (tab. 5). Výsledky svědčí pro aktivaci koagulace až v pozdních fázích těhotenství. Výsledky jsou však ovlivněny výraznou klinickou variabilitou onemocnění. U těžkých, resp. časných preeklampsií tato aktivace i signifikantní rozdíly nastupují podstatně dříve. Výsledky tedy svědčí pro aktivaci koagulace až v pozdních fázích těhotenství. Tyto změny v koagulačním systému jsou signálními procesy pro ischemické procesy porušení endotelu, jež následně aktivují další patofyziologické procesy.

Příčina aktivace koagulace je komplexní. Z ostatních parametrů jsme při srovnání fyziologických těhotenství a preeklampsií ve III. trimestru zaznamenali významný vzestup faktorů II a VIII, pokles volného proteinu S i antitrombinu(p < 0,01). U chronické hypertenze došlo k podobným změnám, výsledky však kromě proteinu S nebyly statisticky významné.

ZÁVĚR

Preeklampsie představuje multisystémové onemocnění neznámé příčiny, které se objevuje ve druhé polovině těhotenství a je charakterizováno abnormální cévní odpovědí na patologickou invazi trofoblastů. Tato interakce s deciduálními buňkami, které exprimují tkáňový faktor (TF), vede k rychlé aktivaci zevní koagulační cesty [9, 14]. TF je také exprimován na placentárních trofoblastech, kde je však za fyziologických podmínek inhibován proteinem C aktivovaným vazbou na ePCR [7]. Zvýšený cévní odpor a dysfunkce endotelu jsou hlavním patofyziologickým důsledkem této abnormální placentace. Komplikace postihuje zhruba 2–7 % těhotných a je jednou z hlavních příčin mateřských úmrtí na celém světě. Ve srovnání s fyziologickým těhotenstvím dochází u pacientek s preeklampsií k další aktivaci hemostatického systému, a to včetně zvýšené generace trombinu. V naší studii jsme porovnávali výsledky trombin generačního testu u skupiny těhotných s původně fyziologickým těhotenstvím, u nichž se vyvinula preeklampsie a také výsledky těhotných preeklamptiček zařazených až ve třetím trimestru. Rovněž jsme porovnávali výsledky testu u skupiny těhotných s chronickou formou hypertenze bez přítomnosti protein-urie. Při porovnání obou skupin jsme zachytili statisticky významně vyšší počet prvorodiček ve skupině preeklampsie a také vyšší průměrný věk rodiček u této komplikace. Ve shodě s literaturou jsme potvrdili signifikantně vyšší aktivaci generace trombinu u těhotných s preeklampsií [10]. Změny u preeklampsie jsou tedy charakterizovány zvýšenou generací trombinu v plazmě, avšak na rozdíl od fyziologického těhotenství dochází také k aktivaci trombocytů a formaci mikropartikulí [10]. Tento fakt může vysvětlit částečný klinický úspěch podávání kyseliny acetylosalicylové u preeklampsie. Lze tedy shrnout, že ve třetím trimestru v době manifestního onemocnění mají preeklamptičky signifikantně vyšší ETP v porovnání s fyziologickým těhotenstvím a normotenzí. Těhotné s chronickou hypertenzí rovněž vykazují mírný nárůst aktivace trombinu. Tyto výsledky však nejsou statisticky signifikantní. Vyšetření koagulace v prvním a druhém trimestru u žen, u nichž se později vyvinula preeklampsie, nevykázalo statisticky významné rozdíly a nelze jej tedy využít v tomto případě jako prediktivní, ale jako pouze diagnostický test.

Práce byla podpořena grantem NT 14394-3/2013.

MUDr. Veronika Lattová

Porodnicko-gynekologická klinika

LF UP a FN

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: vlattova@post.cz