Vývoj metod založených na PCR a jejich aplikace v onkologickém výzkumu a praxi

Overview

PCR metoda se velmi krátce od svého objevení stala rutinní metodou molekulárně bio­logických výzkumných laboratoří a nepostradatelným nástrojem dia­gnostické medicíny. Za dobu svého využívání byla rozvinuta do řady variant, které specificky reagují na potřeby výzkumu a dia­gnostiky co do použitého vstupního materiálu a jeho množství, podmínek reakce a nově vyvinutých technologií. Předložená práce stručně shrnuje jednotlivé PCR přístupy s důrazem na jejich využití v onkologickém výzkumu a praxi.

Klíčová slova:
polymerázová řetězová reakce (PCR) –  PCR v reálném čase –  digitální PCR – klinická onkologie

Úvod

Prvním zásadním krokem vedoucím k objevu a následnému zavedení polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction –  PCR) byla práce publikovaná na konci 60. let minulého století popisující nový druh termofilní bakterie tehdy nazvané Thermus aquaticus. Krátce na to byla z tohoto mikroorga­nizmu izolována termostabilní polymeráza nazvaná „Taq polymeráza“ a v polovině 80. let minulého století pak americký chemik K. Mullis objevil PCR, za což byl v roce 1993 oceněn Nobelovou cenou za chemii. Význam a originalitu tohoto objevu podtrhuje článek otištěný v amerických novinách The New York Times, který na základě tohoto objevu rozděluje bio­logii do dvou epoch –  „před PCR“ a „po PCR“. Zavedení PCR do praxe tak odstartovalo obrovský rozmach molekulární bio­logie a významně rozšířilo do té doby relativně omezené portfolio molekulárně-bio­logických metod.

Polymerázová řetězová reakce je metoda umožňující amplifikaci (tj. zmnožení) specifického úseku nukleové kyseliny, přičemž využívá obecných rysů replikace DNA. Podstatou metody je mnohonásobná syntéza komplementárního řetězce pomocí příslušné DNA polymerázy, a to v rámci sekvence vymezené krátkými syntetickými oligonukleotidy (ssDNA,15– 30 b), tzv. primery, které jsou odvozeny od dané sekvence. Teoreticky lze z jedné molekuly templátu získat 2n kopií dané sekvence při n cyklech. Toto zmnožení následně umožňuje vizualizaci amplifikovaného produktu, jenž nejčastěji probíhá s využitím agarózové gelové elektroforézy (obr. 1A). PCR reakce byla za dobu jejího využívání rozvinuta do řady variant, které specificky reagují na potřeby výzkumu a dia­gnostiky co do použitého vstupního materiálu a jeho množství, podmínek reakce a nově vyvinutých technologií.

Využití PCR v onkologii

PCR je stejně jako mnoho dalších molekulárně-bio­logických analýz díky svým přednostem, jako je časová a materiálová úspora, možnost automatizace a dobrá reprodukovatelnost, využívána ve stále širším měřítku v rámci preventivních programů zaměřených na stanovení rizika vzniku onemocnění, při dia­gnostice patologických stavů i určení prognózy onemocnění. PCR se rovněž uplatňuje v rámci tzv. farmakogenetických vyšetření, při nichž je sledována genetická predispozice pro lékovou odpověď, tj. predikována bezpečnost či toxicita a účinnost terapeutické látky pro konkrétního pacienta.

PCR, obvykle ve spojení s dalšími molekulárně-bio­logickými technikami (elektroforéza, RFLP, sekvencování), umožňuje detekovat různé typy mutací spojené s vyšším rizikem vzniku nádoru a pomáhá tak zlepšit preventivní screen­ingové programy nádorových onemocnění či podrobněji charakterizovat typ nádoru pro následnou volbu účinnější terapie. Příkladem vyšetření prováděných v Masarykově onkologickém ústavu mohou být detekce mutací specifických genů spojených s genetickou predispozicí ke vzniku nádoru, kdy příslušná sekvence genu je nejprve amplifikována pomocí PCR a získané amplikony následně sekvencovány. Jedná se např. o geny BRCA1, BRCA2 u hereditárního syndromu nádoru prsu a/ nebo vaječníku; geny MLH1, MSH2, MSH6 u hereditárního nepolypózního karcinomu tlustého střeva –  tzv. Lynchova syndromu; transkripční varianty p16/ INK4a a p14/ ARF genu CDKN2A u familiárního maligního melanomu; gen TP53 u Li‑ Fraumeniho syndromu; nebo gen CDH1 u hereditární formy difúzního karcinomu žaludku. Dalším příkladem je vývoj metod detekce volných nádorových buněk v krevním řečišti či lymfatických uzlinách na principu PCR, který má zásadní význam pro hodnocení metastatického potenciálu buněk a vývoje onemocnění a tím i volby příslušné terapie. Analogicky se PCR případně RT‑PCR (reverse transcription PCR) využívá při sledování minimální reziduální nemoci zejména u hematologických malignit, při níž se hodnotí počet přítomných nádorových buněk, např. detekcí transkriptu fúzního genu bcl‑ abl v případě chronické myeloidní leukemie (chronic myeloid leukaemia –  CML). Kromě identifikace vlastních nádorových markerů je PCR, zejména pak kvantitativní PCR (viz dále), významným nástrojem při stanovení přítomnosti patogenních organizmů u onkologických pacientů při septických stavech. Základem testu je amplifikace specifické sekvence patogenu v odebraném bio­logickém vzorku a oproti klasické mikrobio­logické kultivaci představuje značnou časovou úsporu a pro pacienta tedy rychlejší nasazení účinné léčby.

V rámci experimentální onkologie se PCR využívá především při technikách klonování, tj. vnášení cizorodé DNA do vektorových systémů, kdy současně představuje i základní nástroj pro ověřování přítomnosti specifických sekvencí ve sledovaném genomu. PCR je využívána i v případě čipových technologií, při nichž je analyzována úroveň transkripce několika až stovek genů současně a sledovány reakce buněk na specifické podmínky indukcí vybraných signálních drah, expresí specifických genů a syntézou specifických proteinů.

PCR v reálném čase (kvantitativní)

Dalším revolučním krokem bylo zavedení kvantitativní PCR (quantitative PCR –  qPCR) neboli PCR v reálném čase (real‑ time PCR). Oproti tradiční PCR, kdy konečný produkt (amplikon) je detekován až po ukončení reakce, PCR v reálném čase umožňuje stanovit tvorbu produktu v průběhu reakce, a to i v raných fázích, kdy přírůstek intenzity fluo­rescence je úměrný množství stanovovaného templátu (obr. 1B). Právě měření kinetiky v brzkých fázích reakce představuje zásadní výhodu v porovnání s tradiční PCR. Postup tradiční PCR včetně jejího vyhodnocení je v porovnání s kvantitativní PCR časově náročnější a vyznačuje se nižší citlivostí detekce, amplifikované produkty jsou rozlišovány především na základě velikosti, a poskytují tak výsledky především kvalitativního charakteru. V případě qPCR je však potřeba počítat s podstatně vyšší pořizovací hodnotou přístrojového vybavení a vyššími náklady na analýzu vzorku.

Obecně lze průběh qPCR reakci rozdělit do tří fází. V první, tzv. exponenciální fázi, je reakce vysoce specifická, v případě 100% efektivity dochází k přesnému zdvojnásobení množství očekávaného produktu, data jsou tudíž maximálně přesná. Druhou fázi označujeme jako lineární. Tato fáze může být poměrně variabilní, dochází při ní ke zpomalování reakce, spotřebě jednotlivých komponent reakce, může začít docházet i k degradaci vzniklých produktů. Ve třetí, tzv. plateau fázi, je reakce zastavena, nedochází k syntéze dalšího produktu, naopak může nastat jeho degradace. K přesné kvantifikaci jsou využívány sondy obvykle značené fluorescenčním barvivem. Rozlišujeme dva hlavní typy sond: 1. nespecifické –  typickým příkladem jsou fluorescenční kyaninová barviva SYBR Green, která fluo­reskují při vazbě do menšího žlábku dsDNA, a 2. specifické, fluorescenčně značené sondy. Specifické sondy jsou navrženy tak, aby hybridizovaly s templátovou DNA za stejných podmínek jako primery v místě vymezeném protisměrně orientovanými primery. Existuje řada variant specifických sond, nejčastěji se používají tzv. hydrolyzační (TaqMan) sondy, které nesou na svém 5’ konci fluo­rescenční značku a na 3‘ konci tzv. zhášeč. Při hydrolýze sondy DNA‑ polymerázou dochází k oddělení fluorescenční značky od zhášeče a následné emisi fluo­rescence (obr. 2).

V praxi se nejčastěji využívají dvě základní vyhodnocovací metody. První varianta je absolutní kvantifikace, tzv. metoda absolutní standardní křivky, která umožňuje zjištění přesného množství kopií templátu ve vzorku. Získáváme tak výsledek v kopiích vzhledem k celkovému množství standardu (např. plazmidové DNA). Druhá varianta je relativní kvantifikace využívající buď relativní standardní křivku, nebo se provádí tzv. komparativní C_T metoda. Přístup založený na konstrukci relativní standardní křivky umožňuje zjištění změn množství templátu mezi vzorky vzhledem k interní kontrole (tzv. kalibrátoru). Komparativní C_T metoda využívá aritmetický vzorec (2^{– ∆∆CT}) definující množství cílového templátu normalizovaný na základě množství endogenních referenčních sekvencí a kvantifikovaný relativně, tedy vzhledem ke kalibrátoru (jinému vzorku –  obvykle kontrole).

Využití PCR v reálném čase v onkologii

PCR v reálném čase patří mezi důležité dia­gnostické nástroje umožňující nejen kvantitativní analýzu zaměřenou na stanovení exprese vybraných genů, ale i kvalitativní, běžně používanou při stanovení mutací či polymorfizmů. V případě kvalitativních analýz (genotypizace) se velmi často používá vysokorozlišovací analýza křivek tání tzv. HRM (high resolution melting) analýza. V principu je tato metoda založena na heteroduplexní analýze, v rámci které jsou detekovány rozdíly v teplotách tání PCR disociačních křivek. Kromě stanovení rozdílů v analyzovaných sekvencích, především přítomnosti specifických mutací, lze HRM použít i k detekci metylací. Typickým příkladem využití HRM v onkologii je dia­gnostika hereditárních nádorových syndromů. Patří sem např. přímé vyšetření přítomnosti mutace v genech BRCA1, BRCA2 (hereditární syndrom nádoru prsu a/nebo vaječníků); MLH1, MSH2, MSH6 (hereditární nepolypózní kolorektální karcinom, Lynchův syndrom); TP53 (Li‑ Fraumeniho syndrom) a řada dalších. Dále se PCR v reálném čase používá i k detekci mutací vzhledem k indikaci vhodné léčby. Klasickým příkladem je vyšetření na přítomnost bodové záměny v kodonech 12 a 13 genu KRAS, kdy se opět používá HRM analýza nebo se využívá technologie ARMS (amplification refractory mutation system), jenž spočívá v použití alelicky, v tomto případě mutant specifických primerů specificky rozpoznávajících jednotlivé mutanty. Není‑li mutace genu KRAS prokázána, je vhodné nasadit bio­logickou léčbu založenou na aplikaci rekombinantních protilátek inhibujících EGFR (epidermal growth factor receptor). Vychází se z předpokladu, že v nádorech s wild type KRAS je exprese KRAS proteinu aktivována pouze přechodně signalizací prostřednictvím EGFR, zatímco v případech mutovaného genu KRAS dochází k jeho konstitutivní aktivaci a takové nádory vykazují výrazně sníženou odpověď na EGFR inhibici.

Jedním z nejvýznamnějších farmakogenetických vyšetření v případě hematologických malignit je stanovení polymorfizmu a aktivity enzymu thiopurin S‑ metyltransferázy (TPMT), enzymu zásadního při odbourávání thiopurinových léčiv využívaných v onkologické terapii a jako imunosupresiv. Snížená aktivita enzymu je důsledkem řady polymorfizmů v kódující oblasti genu TPMT a vede k nežádoucím účinkům při léčbě thiopuriny, jako jsou neurotoxicita, hepatotoxicita atd. Stanovení nejčastějších typů polymorfizmů je prováděno pomocí kvantitativní PCR a je doprovázeno stanovením aktivity TPMT v erytrocytech pomocí HPLC.

Hlavní výhoda PCR v reálném čase v porovnání s klasickou (end‑point PCR) však spočívá v možnosti kvantifikovat množství výchozího templátu podle dynamiky amplifikační reakce, především tedy stanovení exprese vybraných genů. Této skutečnosti lze využít i v experimentální onkologii při sledování hladin exprese vybraných genů na úrovni mRNA za definovaných podmínek. Jedním z možných příkladů praktického využití je predikce vhodnosti nasazení fluorovaných pirimidinů při léčbě nádorů gastrointestinálního traktu, a to v rámci paliativní i adjuvantní terapie. V těchto případech je vhodné stanovit hladinu mRNA pro thymidylát syntázu (TS), thymidin fosforylázu (TP) a dihydropyrimidin dehydrogenázu (DPD), tedy enzymů účastnících se v metabolizmu 5- fluorouracilu (5- FU). mRNA může být izolována z bio­psií primárního nádoru i metastázy pacienta. V případě zvýšené hladiny exprese genů lze předpokládat rezistenci nádoru k fluoropyrimidinovým cytostatikům.

Digitální PCR

Digitální PCR je někdy též označována jako tzv. třetí generace PCR (obr. 1C). Hlavní výhodou tohoto přístupu je absolutní kvantifikace, aniž musí být sestrojena kalibrační křivka. V podstatě se jedná o „upgrade“ tradiční PCR umožňující klonální amplifikaci a přímou kvantifikaci nukleových kyselin. Je třeba si však uvědomit, že se nejedná o metodu zcela nahrazující stávající PCR přístupy, ale spíše o komplementární metodu zaměřenou především na detekci vzácněji se vyskytujících cílových molekul.

Podstata digitální PCR spočívá v rozdělení analyzovaného vzorku, tedy i vlastních cílových sekvencí, do velkého množství dílčích vzorků. To se provádí buď pomocí miniaturních čipů, kdy je vzorek pomocí mikrokapilár rozdělen do řady malých segmentů (komůrek), nebo je ze vzorku vytvořena emulze olejových mikrokapek. Následně probíhá v každé mikrokapce či komůrce čipu standardní PCR, takže v závislosti na počtu mikrokapek/ kapacitě čipu získáváme tisíce až několik desítek tisíc parciálních kvalitativních výsledků na bázi fluorescence (pozitivní/ negativní) pro analyzovaný vzorek. Vzhledem k možné přítomnosti dvou a více cílových molekul současně (v jedné mikrokapce/ segmentu čipu) je v rámci celkového vyhodnocování tato skutečnost brána v potaz a výsledky jsou korigovány na základě Poissonova rozdělení. Na rozdíl od tradiční PCR, kdy množství amplifikovaného produktu pouze přibližně odpovídá množství templátu a je značně ovlivněno počtem PCR cyklů, kvantifikace cílové sekvence v případě digitální PCR prakticky nezávisí na počtu amplifikačních cyklů, což významně eliminuje závislost na exponenciálním nárůstu množství výsledného PCR produktu, jako je tomu u konvenční PCR či PCR v reálném čase, a umožňuje tak zcela absolutní kvantifikaci (obr. 1D).

Mezi nejvýznamnější aplikace digitální PCR patří:

1. Detekce amplifikací genů spojených s maligní transformací. Genomové amplifikace jsou běžnou součástí genomu nádorových buněk. Tyto amplifikace často vedou ke zvýšené expresi specifických onkogenů a zásadním způsobem ovlivňují bio­logii nádoru. Přesná a citlivá detekce amplifikací je proto žádoucí v rámci dia­gnostiky nádorů a může mít prognostický a/ nebo prediktivní význam. Tento přístup by mohl v budoucnu sloužit i jako alternativa k v současnosti prováděným FISH analýzám. Hlavní výhoda digitální PCR je robustnost, senzitivita a finanční nenáročnost v porovnání se standardně prováděnými FISH stanoveními.
2. Detekce alterací nukleových kyselin přítomných ve vzorku s nízkou četností, tedy minoritně zastoupených v analyzovaném vzorku. Stanovení přítomnosti mutací v homogenních vzorcích je obecně snadno proveditelné a velmi dobře realizovatelné běžnými metodami, neboť se pracuje s velkým množstvím genetického materiálu a mutace je obvykle přítomna v 50 % všech cílových sekvencí (1 mutovaná alela ze 2). Situace se však komplikuje v případě zpracování heterogenního vzorku, v němž je přítomnost mutovaných sekvencí významně snížená. V onkologii jsou typickým příkladem punkční bio­psie obecně obsahující velké množství normální/ zdravé tkáně nebo krevní vzorky, kde jsou aberantní buňky značně naředěny.
3. Stanovení hladiny miRNA. Tento přístup umožňuje absolutní kvantifikaci miRNA a prokazuje vynikající reprodukovatelnost i v případě nízkých hladin miRNA. Digitální PCR je tedy ideální pro detekci cirkulujících miRNA jako potenciálních dia­gnostických bio­makerů poukazujících na přítomnost onkologického onemocnění.
4. Mezi další aplikace, pro něž je vhodné uvažovat o použití digitální PCR, patří absolutní kvantifikace patogenů, detekce onkogenních alel ve vzorcích uchovávaných ve formě parafinových bloků, absolutní kvantifikace standardů pro další aplikace, kvantifikace vzorků v rámci jejich přípravy pro NGS (nová generace sekvencování; pro více informací viz článek Koubková et al v rámci tohoto Supplementa, str. 61–68) či validace výsledků NGS díky absolutní kvantifikaci.

Závěr

Polymerázová řetězová reakce se řadí mezi základní metody molekulární bio­logie a v dnešní době představuje nepostradatelný nástroj pro manipulaci s genetickou informací v mnoha oblastech bio­medicínského výzkumu. S objevem PCR také došlo k obrovskému rozvoji molekulární dia­gnostiky, který byl ještě umocněn možností kvantifikace cílových molekul díky PCR v reálném čase a následně pak vývojem digitální PCR. Přehled jednotlivých PCR přístupů, jejich porovnání včetně výhod a nedostatků je pro větší přehlednost a srozumitelnost shrnut do tab. 1.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO, CZ.1.05/2.1.00/03.0101), BBMRI_CZ (LM2010004), GAČR 13-00956S a MZ ČR –RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.

Mgr. Roman Hrstka, Ph.D.

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e-mail: hrstka@mou.cz

Obdrženo: 10. 2. 2014

Přijato: 1. 4. 2014