Exprese a purifikace proteinů

Metody exprese a purifikace rekombinantních proteinů umožňují produkci a detailní charakterizaci proteinů v základním výzkumu během in vitro experimentů, ale také přípravu proteinů s terapeutickým využitím. Publikace shrnuje základní postupy od přípravy expresních vektorů až po techniku afinitní purifikace. Dále pojednává o vlastnostech různých prokaryotických a eukaryotických expresních systémů a možnostech jejich využití. Molekulární klonování, které slouží k přípravě expresních vektorů pro rekombinantní proteiny, umožňuje cíleně modifikovat vlastnosti těchto proteinů tak, aby byla usnadněna jejich purifikace a také pozměněna jejich stabilita, aktivita nebo funkce. V současné době je k dispozici široká škála metodických přístupů, jež umožňují rychlou a efektivní přípravu expresních vektorů. Zvolený produkční organizmus a způsob purifikace rekombinantního proteinu určují výběr expresního vektoru. První volbou často bývá expresní systém využívající bakterii Escherichia coli, jehož přednostmi jsou zejména technická, časová i finanční nenáročnost. Tento expresní systém není příliš vhodný pro produkci komplexních savčích proteinů, pro které jsou optimální expresní systémy založené na využití eukaryotických organizmů (kvasinky, hmyzí buňky nebo savčí buňky). Kultivace hmyzích a savčích buněk je však technicky i finančně náročná. Rekombinantní proteiny jsou purifikovány nejčastěji metodou afinitní chromatografie využívající specifickou interakci peptidu nebo proteinu s afinitní matricí. Tyto peptidy či proteiny jsou fúzovány s N‑  nebo C‑ koncem purifikovaného proteinu. Purifikace probíhá ve třech krocích, kdy je rekombinantní protein prostřednictvím afinitních značek specificky zachycen na matrici chromatografické kolony, dále následuje promývací krok, po kterém je uvolněn z kolony čistý protein.

Klíčová slova:
rekombinantní protein –  molekulární klonování –  purifikace –  expresní systém

Úvod

Purifikované proteiny mají v současné době široké využití nejen v základním výzkumu, ale i v aplikovaném výzkumu jako terapeutické látky pro léčbu různých onemocnění od hemofilie po komplexní protinádorovou terapii nebo výrobu vakcín. Proteiny využívané v medicíně musí splňovat přísná kritéria (např. je omezeno použití antibio­tik a jiných toxických látek), a proto jsou pro jejich produkci vyvíjeny speciální expresní systémy. Předkládaná publikace je tudíž zaměřena na popis obecných metod purifikace proteinů využívaných v základním výzkumu.

Purifikace proteinů je obecně sled procesů vedoucích k získání jediného proteinu z komplexní směsi. Izolovat čisté proteiny je nezbytné pro řadu in vitro experimentů, mezi něž patří charakterizace jejich funkce, struktury a vzájemných interakcí, a které dále dovolují objasnit jejich úlohu v bio­logických systémech. Ve většině případů jsou pro účely purifikace připravovány rekombinantní proteiny metodou molekulárního klonování, která umožňuje protein podle potřeby modifikovat. Geny kódující požadované proteiny jsou vloženy do expresních vektorů a ty jsou vpraveny do různých prokaryotických nebo eukaryotických buněk, jež poté zajistí syntézu rekombinantních proteinů. Purifikaci těchto proteinů usnadňuje připojení afinitních značek (tagů) a použití metod afinitní chromatografie, které jsou založeny na specifické vazbě těchto značek na chromatografickou kolonu. Na kvalitu i kvantitu purifikovaných proteinů jsou kladeny vysoké nároky, a proto jsou neustále vyvíjeny nové metodické přístupy.

Historický přehled

Proteiny jsou studovány a purifikovány už více než 200 let. Již v roce 1789 izoloval Antoine Fourcroy z rostlin látky, které se svými vlastnostmi podobaly vaječnému bílku. Avšak až o téměř 50 let později, v roce 1838, tyto látky blíže popsal chemik Gerhardus Johannes Mulder a v témže roce pro ně navrhl Jöns Jacob Berzelius název protein (vycházející z řeckého slova proteos –  první v řadě). Do začátku 20. století byly jediné známé metody separace proteinů filtrace, precipitace či krystalizace, přičemž ně­kte­ré z těchto technik jsou používány dodnes. Takto např. Felix Hoppe‑ Seyler v roce 1840 připravil první krystaly hemoglobinu nebo Franz Hofmeister v roce 1889 opakovanou krystalizací purifikoval ovalbumin. První separace proteinů na koloně byla provedena v roce 1903 botanikem Mikhailem Tswettem, který na matrici z uhličitanu vápenatého separoval rostlinné pigmenty a následně v roce 1906 pro tuto metodu zavedl pojem chromatografie. Další technika separace proteinů, centrifugace, byla vyvinuta Theodorem Svedbergem v roce 1924. V následujících letech byl vynalezen princip elektroforézy, afinitní chromatografie a iontově výměnné chromatografie (ion exchange chromatography – IEX). Od 50. let 20. století následoval intenzivní vývoj různých typů hydrofilních chromatografických matricí. Nejprve byl využit škrob či upravený dextran Sephadex pro rozlišení proteinů podle velikosti [1]. Později byly připraveny další hydrofilní materiály pro elektroforézu a chromatografii, jako např. polyakrylamid [2], metakrylát [3], agaróza [4] nebo porézní křemík [5]. Výrobu moderních matricí pro afinitní chromatografii umožnil objev metody navázání ligandů k polysacharidům (např. v agaróze) kovalentní vazbou [6]. V průběhu následujících let byl vyvinut velký počet chromatografických médií a souběžně také různé techniky purifikace proteinů včetně automatizovaných chromatografických systémů, jako třeba FPLC (fast protein liquid chromatography).

Zpočátku byly proteiny purifikovány z jejich přirozených zdrojů, což bylo technicky i finančně náročné. Proto se počáteční analýzy soustředily na proteiny, které mohou být purifikovány ve velkých množstvích, a to např. z krve, vaječného bílku, nebo trávicí enzymy získané ze zvířat na jatkách. Takto byl koncem 50. let firmou Armour & Co., jež působila v masném průmyslu, purifikován kilogram bovinní pankreatické ribonukleázy (RNázaA), který byl věnován pro vědecké účely. Snadno a rychle dostupná RNázaA se stala základním proteinem pro bio­chemické analýzy, na jejichž základě byla dokonce Christianu Anfinsenovi, Stanfordu Mooreovi a Williamu H. Steinovi udělena v roce 1972 Nobelova cena za chemii.

Mohutný nárůst technologií purifikace proteinů nastal po objevu metody přípravy rekombinantní DNA na počátku 70. let 20. století [7– 9]. Molekulární klonování tak umožnilo heterologní expresi zvoleného proteinu v hostitelském organizmu (expresním systému), nejčastěji v bakterii Escherichia coli (E. coli). Touto technologií lze vytvářet také fúzní (chimérické) proteiny s přidanými afinitními značkami (tagy), které výrazně usnadňují purifikaci a zvyšují výtěžek a čistotu za použití univerzálních purifikačních postupů. Dále lze přidávat reportérové sekvence, např. fluorescenční proteiny, jež umožňují sledovat expresi proteinů in vivo přímo v buňce. Díky těmto expresním systémům je dosažena mnohem vyšší koncentrace studovaného proteinu, než jaká se v buňce přirozeně nachází.

Příprava expresních vektorů

Vektory v molekulární bio­logii slouží k přepravě cizorodé DNA do hostitelské buňky, kde je tato DNA replikována a/ nebo exprimována. Nejběžnější typ vektoru jsou plazmidy, cirkulární molekuly extrachromozomální DNA, které se v bakteriální buňce autonomně množí a přenášejí se při dělení do následujících generací. Často jsou využívány také virové vektory, což jsou rekombinantní viry, jež mají část genomu nahrazenu expresní kazetou, která po infekci (transdukci) hostitelských buněk zajistí produkci rekombinantního proteinu. Alternativou ke klasickým klonovacím systémům, ve kterých je vložení cizorodé DNA založeno na restrikčním štěpení a následné ligaci, jsou systémy založené na rekombinaci, jež umožňují snadné a efektivní klonování požadovaných genů. K dispozici je několik komerčně dostupných expresních systémů využívajících rekombinaci, třeba Gateway (Life Technologies, USA) a Creator (Clontech, USA). Expresní systém Gateway využívá rekombinaci mezi dvěma heterologními sekvencemi, která je zprostředkována enzymy pocházejícími z bakteriofága lambda. Ty rozeznávají specifické signální sekvence ohraničující cílový gen (nazývané att sekvence) [10]. V prvním kroku je připraven univerzální vstupní vektor, který slouží jako základ pro vytvoření libovolných expresních vektorů (obr. 1). Mezi další mechanizmy klonování náleží např. TOPO klonování (Life Technologies, USA) nebo klonování nezávislé na ligaci LIC (ligation independent cloning) (dodávají různé firmy, jako třeba New England Biolabs, USA nebo Merck, Germany).

Typy expresních systémů

Obecně je prvním krokem pro expresi v prokaryotických i eukaryotických buňkách vpravení vektoru, který obsahuje gen pro syntézu rekombinantního proteinu, do buňky. Dále následuje kultivace, během níž dochází k transkripci a translaci kódující DNA. Buňky jsou následně lyzovány a protein je purifikován. Vlastnosti jednotlivých expresních systémů jsou shrnuty v tab. 1.

Nejčastěji používaným expresním systémem jsou bakterie E. coli, protože se snadno kultivují, rychle se množí a umožňují získat vysoké výtěžky rekombinantních proteinů. Velkou výhodou jsou nízké náklady na kultivační média. Pro expresi proteinů existuje široký výběr komerčních expresních vektorů, které umožňují použití řady N‑  i C‑ koncových tagů, stejně jako dostatek různých expresních kmenů optimalizovaných pro speciální aplikace. Exprese rekombinantních proteinů může být u E. coli řízena několika promotory. Nejčastěji je využíván silný promotor T7,dále pak lambda P1, trc nebo arabinózový promotor. Bakteriální expresní systém má však také mnoho nevýhod. Například problém s nedostatkem tRNA pro ně­kte­ré kodony převažující u eukaryotické mRNA byl vyřešen vytvořením expresních kmenů bakterií, které nesou plazmidy kódující tyto vzácné tRNA. Jedná se např. o kmeny BL21(DE3) CodonPlus (Stratagene, USA) nebo Ro­setta (Merck, Germany). Závažnější omezení jako neexistující posttranslační úpravy a aparát molekulárních chaperonů, jež eukaryotickým proteinům zajišťují bio­logickou aktivitu, lze zatím řešit pouze částečně. Pracuje se na vytvoření kmenů, které zprostředkovávají alespoň jednoduchou glykosylaci [11,12] a chybějící chaperony je možno doplnit jejich ko‑ expresí s požadovaným proteinem (Clontech, USA). Přes veškeré úsilí jsou zvláště velké multi‑doménové eukaryotické proteiny náchylné k denaturaci a vytváří nerozpustná inkluzní tělíska. Pro jejich solubilizaci jsou vyžadovány speciální postupy, mezi které patří úplná denaturace a následná renaturace.

Nejjednodušší eukaryotický expresní systém využívá kvasinky, jednobuněčné organizmy, které lze snadno kultivovat v suspenzi podobně jako E. coli. Jejich výhodou je schopnost provádět jednoduché posttranslační modifikace, možnost kultivace do vysokých hustot a nízké náklady na kultivační média. Nejčastěji jsou využívány kmeny Saccharomyces cerevisiae a Pichia pastoris.

Expresní systém využívající hmyzí buňky infikované bakuloviry poskytuje proteiny, které jsou posttranslačně modifikovány podobně jako v savčích buňkách. Replikace bakulovirů není závislá na pomocném viru, mohou být kultivovány i v suspenzních hmyzích buňkách a lze dosáhnout vysoké multiplicity infekce. Nevýhodou hmyzích buněk jsou ale vyšší náklady na kultivaci a větší náročnost na čas i odbornou manipulaci. Existuje několik typů expresních systémů lišících se ve způsobu přípravy rekombinantního bakuloviru, např. homologní rekombinací, transpozicí nebo technologií Gateway. Posledně jmenovaná metoda je využita v systému BaculoDirect (Life Technologies, USA), který umožňuje vložení požadovaného genu přímo do virového genomu, čímž se výrazně zkracuje doba pro vytvoření infekčního viru. Exprese genu je řízena silným polyhedrinovým promotorem, jenž zajišťuje vysokou hladinu rekombinantního proteinu.

Savčí buňky produkují rekombinantní proteiny, které jsou ve většině případů plně funkční a posttranslačně modifikované. Tento systém nabízí velkou metodickou variabilitu ve výběru produkční linie i ve způsobu vnesení expresního vektoru do buňky. Mezi často používané linie patří třeba HEK 293 (human embryonal kidney) a CHO (chinese hamster ovary), které se vyznačují vysokou rychlostí růstu a schopností snadno přijímat heterologní DNA. Exprese rekombinantních proteinů je řízena konstitutivně aktivními promotory. Nejčastěji se jedná o promotory odvozené z viru SV40 (simian virus 40) nebo CMV (cytomegalovirus) a méně jsou využívány nevirové promotory např. elongačního faktoru EF‑ 1 α. Vyšší hladiny exprese lze dosáhnout u sekretovaných proteinů, zatímco exprese vnitrobuněčných proteinů je výrazně nižší. Využití plazmidových vektorů pro tranzientní expresi je nejrychlejší metoda produkce rekombinantních proteinů, neboť k jejich syntéze dochází ihned po vnesení vektoru do jádra. Plazmidové vektory lze také využít pro přípravu stabilních buněčných linií, které mají cizorodou DNA začleněnu ve své genomové DNA, a tudíž trvale exprimují rekombinantní protein. Příprava virových vektorů je časově i technicky náročná a navíc podléhá vyššímu stupni bezpečnostní kontroly. Výhodou jsou pak vysoké výtěžky rekombinantních proteinů a možnost použití pro velkoobjemové kultivace.

Adenovirové vektory [13] patří mezi oblíbené expresní systémy, které jsou dostupné v mnoha modifikacích metody přípravy rekombinantního virového genomu. Jedná se např. o komerčně dostupné systémy ViraPower (Life Technologies, USA), jenž je kompatibilní s klonovacím systémem Gateway, AdEasy (Agilent Technologies, USA) nebo AdenoX (Clontech, USA). Adenoviry jsou jednoduché viry s neobalenou ikozaedrální kapsidou a jejich genom je tvořen dvouřetězcovou lineární DNA. Genom adenovirů bylo možno upravit na klonovací vektor tak, že skupiny genů rané fáze exprese E1 a E3 byly deletovány a na místo genů E1 byla vložena expresní kazeta. Delecí genů E1 a E3 ztratil adenovirus schopnost replikace a pro vytvoření virového potomstva musí být tato funkce komplementována tzv. pomocnými buňkami. Jako pomocná linie je využívána třeba buněčná linie HEK 293,která tyto geny získala díky tomu, že byla vytvořena transformací embryonálních buněk ledvin adenovirovou DNA [14]. Pro expresi rekombinantního proteinu je vhodná jakákoli buněčná linie, jež neobsahuje geny E1 a E3. Po transdukci tak nedochází k replikaci viru a následné lýze hostitelské buňky, a produkce rekombinantního proteinu proto může v buňce neomezeně probíhat.

Expresní vektory vycházející z retrovirů [15], a zejména z rodu Lentivirus, umožňují vkládat cizorodé geny do genomu hostitelských buněk a zajistit tak stabilní expresi rekombinantního proteinu. Retroviry jsou RNA viry, avšak v průběhu jejich životního cyklu vzniká intermediát tvořený dvouřetězcovou DNA, který je následně začleněn do genomu hostitelské buňky. Využití retrovirových a lentivirových vektorů sahá od základního výzkumu až po genovou terapii [16].

In vitro (bezbuněčná) syntéza proteinů využívá schopnost buněčných extraktů syntetizovat proteiny, neboť obsahují složky nutné pro transkripci, translaci a dokonce posttranslační modifikace. Mezi tyto složky patří hlavně RNA polymeráza, transkripční faktory, ribozomy a tRNA. Po přidání templátu (a kofaktorů a nukleotidů) je protein během několika hodin syntetizován. Přestože jsou výtěžky proteinů nízké, má tento systém několik výhod, např. pro značení proteinů modifikovanými aminokyselinami nebo pro syntézu proteinů toxických pro bio­logické systémy. Také odpadá zdlouhavá kultivace hostitelských organizmů, což usnadňuje expresi mnoha různých proteinů zároveň (třeba pro screening mutací).

Chemická syntéza proteinů je využívána např. pro inkorporaci nepřírodních aminokyselin nebo značení proteinů na specifických místech. Syntetizovaný protein je velmi čistý, ale metoda je limitována počtem aminokyselin, nízkým výtěžkem a rovněž vysokými náklady.

Metody purifikace proteinů

Proces purifikace je výrazně usnadněn, pokud je cílový protein opatřen afinitní značkou. Prvním krokem je v tom případě afinitní chromatografie, při níž je protein díky své afinitní značce specificky zachycen na chromatografické koloně. Nenavázané proteiny jsou v promývacím kroku odmyty a čistý protein uvolněn specificky přidáním kompetitivního ligandu nebo nespecificky změnou pH, iontové síly či polarity (obr. 2).

Purifikační metoda je určena výběrem afinitní značky, tagu. Tyto afinitní tagy umožňují použití univerzálních purifikačních metod, neboť na chromatografické koloně je protein zachycen právě svou afinitní značkou. Mezi nejpoužívanější afinitní značky patří glutathion S‑ transferáza (GST) [17] a polyhistidin (His6) [18], dále se využívají např. Strep‑ tag [19], SBP‑ tag (streptavidin bind­ing peptide) [20] a MBP‑ tag (maltose binding protein) [21]. GST‑tag je proteinová afinitní značka o velikosti 27 kDa, což může negativně ovlivňovat hladinu exprese rekombinantních proteinů. Na druhou stranu však byl pozorován pozitivní vliv na solubilitu ně­kte­rých rekombinantních proteinů [22]. Vazebná kinetika GST‑tagu ke glutathionové chromatografické matrici je pomalá, a proto se prodlužuje nanášení vzorku na kolonu, což je limitující faktor pro purifikaci proteinu z velkých objemů. His‑ tag je naopak velmi malý, neovlivňuje sekundární strukturu rekombinantních proteinů a jeho vazba ke chromatografické matrici IMAC (immobilised metal affinity chromatography) je rychlá, avšak méně specifická než v případě GST‑tagu. Pro dosažení vysoké čistoty proteinu je často využíváno tandemové zařazení afinitních značek pro purifikaci ve dvou následných krocích. Přítomnost afinitní značky může v mnoha směrech ovlivnit vlastnosti rekombinantního proteinu, a proto se hojně využívá jeho enzymatického odštěpení. Na trhu je k dispozici několik proteáz (např. TEV proteáza, PreScis­sion proteáza, Enterokináza, Faktor Xa nebo trombin), jejichž cílové rozpoznávací sekvence mohou být vloženy mezi afinitní značku a vlastní protein. Štěpení může být provedeno v roztoku proteinu, nebo přímo na chromatografické koloně. Proteáza může být také označena afinitní značkou a po ukončení inkubace spolu s odštěpenou značkou odstraněna na chromatografické koloně.

V případě nedostatečné čistoty proteinu po afinitní purifikaci je možné zahrnout dodatečné purifikační kroky, které separují proteiny podle specifických vlastností. Metoda gelové filtrace (GF)dokáže separovat molekuly podle velikosti, hydrofobní interakční chromatografie (HIC) a reverzně fázová chromatografie (RPC) podle rozdílů jejich hydrofobicity, iontově výměnná chromatografie (IEX) podle povrchového náboje nebo chromatofokusace podle izoelektrického bodu.

Metoda afinitní chromatografie, která využívá schopnosti bakteriálních receptorů nazvaných Protein A a Protein G vázat imunoglobuliny, začala být intenzivně používána po objevu technologie přípravy monoklonálních protilátek. Tato technologie umožňuje vytvoření stabilních fúzních buněčných linií, jež produkují jeden typ selektované protilátky [23]. Tak bylo získáno velké množství specifických protilátek, které se následně staly významným nástrojem pro vědu i farmaceutický průmysl.

Závěr

Díky neustále se zvyšujícím požadavkům na kvalitu i kvantitu purifikovaných proteinů a také na zjednodušení a zrychlení procesu jejich přípravy dochází k dynamickému rozvoji technologií pro expresi a purifikaci rekombinantních proteinů. Široká škála expresních systémů využívajících prokaryotické i eukaryotické produkční organizmy umožňuje zvolit systém pro produkci proteinu splňujícího požadovaná kritéria. Při výběru vhodného expresního systému je potřeba zohlednit několik faktorů. V prvé řadě záleží na tom, zda je zvolený protein eukaryotického nebo prokaryotického původu. V případě exprese savčího proteinu v expresních systémech jiných organizmů musíme počítat s rizikem nesolubility proteinu a možností odlišných nebo dokonce chybějících posttranslačních modifikací. Dále je potřeba zvážit požadované množství purifikovaného proteinu, časovou náročnost metody, finanční hledisko a v případě virových expresních systémů také legislativní a bezpečnostní požadavky.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI –  RECAMO, CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101) a MZ ČR –  RVO (MOÚ, 00209805).

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do bio­medicínských časopisů.

Mgr. Eva Růčková

Regionální centrum aplikované molekulární onkologie

Masarykův onkologický ústav

Žlutý kopec 7

656 53 Brno

e‑mail: ruckova@mou.cz

Obdrženo: 22. 1. 2014

Přijato: 20. 3. 2014