Heterogenita dětského diabetu a její terapeutické implikace

Souhrn

Diabetes se u českých dětí a adolescentů vyskytuje s prevalencí 1 : 500–1 000 dětí. V posledních 25 letech jeho incidence stoupla přibližně 3krát. Nejčastěji se v této věkové kategorii vyskytuje diabetes 1. typu, stále častěji se setkáváme též s monogenními formami diabetu, diabetes 2. typu je u dětí na rozdíl od dospělých marginální. Etiologická diagnostika představuje nezbytný předpoklad efektivní terapie. Článek shrnuje současné poznatky o etiologii a léčbě diabetu manifestovaného do 18 let věku.

Klíčová slova:
děti – diabetes mellitus – etiopatogeneze – terapie

Úvod

Vývoj molekulární genetiky a medicíny obecně si v posledních dekádách vynutil kromě jiného také přepsání kapitol o etiopatogenezi diabetu diagnostikovaného v dětství. Dětský diabetes je daleko barevnější, než jsme předpokládali, a rozhodně již automaticky neznamená diabetes 1. typu (DM1T). Ten sice představuje nejčastější typ (přibližně 95 % případů), nicméně genetická diagnostika potvrzuje výskyt monogenních forem u 3–4 % dětí, což je bezesporu signifikantní proporce pacientů. Etiologicky výhradně monogenním, ale stále poměrně heterogenním je novorozenecký diabetes (NDM) s manifestací do 6 měsíců věku. Relativní výskyt diabetu 2. typu (DM2T) u dětí se liší mezi jednotlivými etniky a populacemi, u Evropanů kavkazského etnika je výskyt dětských diabetiků 2. typu stále pouze okolo 1 %, u Asiatů či Afroameričanů jsou však tato čísla mnohonásobně vyšší a představují až 90 % všech případů, a to při podobném BMI. Správná diagnostika jednotlivých typů dětského diabetu založená zejména na kombinaci klinických, biochemických, genetických a imunologických parametrů představuje základní předpoklad pro volbu adekvátní terapie vedoucí ke zlepšení dlouhodobé prognózy a kvality života dnešních diabetických dětí. Následující článek shrnuje současné poznatky o etiologii a léčbě diabetu manifestovaného do 18 let věku.

Novorozenecký diabetes (NDM)

Novorozenecký a časně kojenecký věk je z diabetologického hlediska naprosto unikátním obdobím, proto byla pro manifestaci novorozeneckého diabetu stanovena věková hranice 6 měsíců, která přesahuje období klasicky označované jako novorozenecké (tedy 28 dní). Podle průběhu rozlišujeme 2 skupiny NDM:

• tranzientní novorozenecký diabetes mellitus (TNDM), který vymizí během prvních měsíců života a dále nevyžaduje léčbu, ale až v 50 % případů později relabuje, a 
• permanentní novorozenecký diabetes mellitus (PNDM), který vyžaduje celoživotní léčbu

NDM je vzácné onemocnění s incidencí přibližně 1 : 200 000, které vzniká výhradně v důsledku mutace jediného genu ovlivňujícího funkci B-buňky [1,2]. V současné době je známo 20 genů způsobujících NDM (tab. 1).

Nejčastějšími z nich jsou geny KCNJ11 a ABCC8 kódující Kir6.2, respektive SUR1 podjednotky napěťově řízeného kaliového kanálu (K_ATP) B-buňky [1,3], tedy organely klíčové pro spuštění sekrece inzulinu z B-buňky. Pankreatický K_ATP má 8 podjednotek – 4 podjednotky SUR1 (sulfonylureový receptor typu 1, kódován genem ABCC8) a 4 podjednotky tzv. B-cell inward rectifier (Kir6.2, kódovaný genem KCNJ11). Zatímco podjednotky Kir6.2 tvoří póry a představují část kanálu závislého na hladině ATP, regulační podjednotky SUR1 jsou řízeny kromě ADP také sloučeninami ze skupiny derivátů sulfonylurey. Snížení toku kaliových iontů K_ATP kanálem způsobí depolarizaci membrány, která spouští vstup kalciových iontů přes napěťově řízený Ca²⁺ kanál, a tím stimuluje uvolnění sekrečních granul obsahujících inzulin. Aktivační mutace v některém z uvedených genů způsobí nedostatečnou produkci inzulinu vedoucí k časnému rozvoji diabetu, leckdy doprovázenému život ohrožující diabetickou ketoacidózou a metabolickým rozvratem [3]. Inaktivační mutace vedou naopak k neonatálnímu hyperinzulinizmu [4], jak je popsáno v článku prof. Lebla v tomto čísle [5]. Třetí nejčastější příčinou NDM je mutace v genu pro inzulin (INS). Mutace v těchto 3 genech (typicky v heterozygotním stavu) jsou zodpovědné za 90 % případů NDM, ostatní jsou výrazně vzácnější [6]. Rychlá DNA analýza, která dnes již patří mezi standardy péče o děti s NDM, proto preferenčně zahrnuje právě tyto geny. Většina pacientů s TNDM má abnormality imprintingu genu PLAGL1 na chromozomu 6q charakteru uniparentální disomie, paternální duplikatury nebo maternální hypometylace.

Děti s novorozeneckým diabetem se častěji rodí předčasně nebo s nižší porodní hmotností a délkou. Obojí je projevem deficitu inzulinu jako dominantního prenatálního růstového faktoru. K hlavním postnatálním projevům diabetu patří neprospívání, ubývání na hmotnosti, polyurie a rychlý rozvoj dehydratace. Zvláště nedonošené děti mají vysoké riziko metabolického rozvratu s rychlým nástupem i progresí. Laboratorně zjišťujeme hyperglykemii, u 30 % případů je přítomna ketoacidóza. Většina dětí s NDM nemá v séru detekovatelný C-peptid [6].

Léčbu NDM zahajujeme většinou inzulinem, vždy v případě rozvinuté diabetické ketoacidózy. Po zvládnutí akutního stavu terapii modifikujeme podle genetické diagnostiky a předpokládané reakce na alternativní terapii. V případě mutací v některé z podjednotek K_ATP kanálu jsou lékem první volby antidiabetika ze skupiny derivátů sulfonylurey (nejvíce zkušeností je s glibenklamidem a gliklazidem), většina dětí na tuto terapii dobře zareaguje vyplavením inzulinu s následnou korekcí hyperglykemie [6]. Přechod z terapie inzulinem na léčbu deriváty sulfonylurey je možný v jakémkoli věku, citlivost B-buněk na tuto léčbu přetrvává i po dlouhodobé inzulinové terapii. Podle nedávné studie však u pacientů převedených v nižším věku dosáhneme lepší odpovědi v produkci inzulinu [7], což ukazuje na důležitost časné diagnostiky. Děti s nejtěžšími mutacemi K_ATP kanálu však na tuto terapii nereagují a je nutné se vrátit k podávání inzulinu.

Část dětí s novorozeneckým diabetem má navíc závažné neurologické příznaky (opožďování psychomotorického vývoje, epilepsie). Tento stav označujeme jako DEND syndrom (z anglického developmental delay, epilepsy, neonatal diabetes) [3]. Tyto děti většinou léčíme inzulinem, protože charakter postižení kaliového kanálu neumožní reakci na léčbu perorálními antidiabetiky [8]. Několik kazuistik však doložilo parciální zlepšení psychomotorického vývoje po podávání glibenklamidu u dětí s neurologickým deficitem, ale bez přítomnosti epilepsie [9,10]. Tento stav nazýváme i-DEND (intermediate DEND). V terapii využíváme kombinace inzulinu a vysokých dávek derivátů sulfonylurey. Efektivitu perorální terapie je třeba kriticky zhodnotit ve spolupráci s dětským neurologem v prvních letech života.

Pokud diagnostikujeme mutace v ostatních genech způsobujících NDM, např. genu INS, není zpravidla jiná možnost léčby než inzulin. Obecně pro novorozence platí, že nejčastěji využíváme depotní inzulinová analoga, po zvýšení množství sacharidů ve stravě přidáváme standardně rychlé inzuliny preprandiálně. Vhodnou alternativou je léčba inzulinovou pumpou, jejíž výhodou je možnost flexibilnější aplikace inzulinu podle času a množství přijatých sacharidů.

Diabetes 1. typu u dětí

Pokud se diabetes mellitus manifestuje ve 2. půlroce života a později v dětství a adolescenci, jedná se nejčastěji o DM1T, autoimunitní onemocnění multifaktoriální etiologie, v jehož patogenezi se přibližně stejnou měrou uplatňují vlivy genetické a faktory prostředí.

Epidemiologie

Epidemiologická data o výskytu diabetu v ČR čerpáme již od roku 1989 z údajů Českého registru dětského diabetu [11–13]. Z jeho údajů je zřejmé, že incidence diabetu se za minulých 25 let vyšplhala z 6,8/100 000/rok 1989 až na 24,8/100 000/rok 2012 (graf). Absolutní počet případů diagnostikovaných každým rokem roste navzdory změnám velikosti dětské populace. Změny incidence se odrážejí v prevalenci pouze zvolna. Prevalence DM1T je velmi nízká u nejmenších dětí (0,2–0,4/1 000) a postupně vzrůstá do puberty, během níž dosahuje hodnot 1,6–1,8/1 000. Prevalence je kromě incidence ovlivněna též úmrtností a strukturou populace. Zatímco úmrtnost dětských diabetických pacientů je u nás zanedbatelná, dva zbývající parametry se rychle mění. Příčina změn incidence DM1T není známa, ale je zřejmé, že není způsobena genetickými vlivy. Během posledních několika desítek let se nejspíše změnil nějaký negenetický faktor nebo faktory a tato změna měla za následek buďto vzestup výskytu autoimunitní inzulitidy, nebo – méně pravděpodobně – přesun jejího začátku do dětského věku.

Genetika diabetu 1. typu

Genetické faktory hrají v patogenezi DM1T nezpochybnitelnou roli. Konkordance mezi jednovaječnými dvojčaty se pohybuje v různých studiích od 23 % do 53 %, zatímco u dizygotních dvojčat je to pouze 2,5 % až 11 % [14]. Podobně nejbližší příbuzní diabetických pacientů mají vyšší riziko vzniku DM1T než běžná populace. Zatímco prevalence DM1T se v naší populaci pohybuje kolem 1 : 500–1 000, děti diabetických matek a sourozenci dětí s DM1T mají celoživotní riziko přibližně 3–5 % a děti diabetických otců přibližně 5–7 %.

Míra rizika DM1T je determinována polygenně. Je však zřejmé, že jeden z genových komplexů, HLA (human leucocyte antigen, hlavní histokompatibilní systém člověka), hraje hlavní roli s podílem přibližně 50 %. Podíl HLA na genetické etiologii diabetu byl odhadnut z podílu na familiárním výskytu v rodinách s více než jedním diabetickým dítětem. Jedním z důkazů pro vedoucí roli HLA je, že riziko diabetu u HLA identického (nesoucí stejnou kombinaci HLA) sourozence diabetického dítěte je 12,9 %, zatímco u HLA haploidentického (mající jen část kombinace HLA stejnou jako dítě s diabetem) sourozence je to 4,7 % a u neidentického pouze 1,8 % [15]. V lidském genomu neexistuje žádná jiná oblast s tak velkým vlivem na riziko DM1T, jako má HLA. Schopnost vazby HLA na autoantigen a její síla jsou zásadní pro vznik a rozvoj autoimunitních chorob včetně DM1T. O zbytek genetického rizika se dělí několik desítek minoritních genových polymorfizmů souhrnně nazývaných non-HLA geny. Nejdůležitějšími z nich jsou gen pro inzulin [16] a gen PTPN22 [17].

Proporce genetického a negenetického rizika se mění v čase. Ukázalo se, že vliv genetických faktorů za léta oslabil: k tomu, aby člověk dostal diabetes, je nyní třeba méně genetických predisponujících faktorů než v minulosti; analogicky, diabetes dostávají ve zvýšené míře i lidé nesoucí ochranné genetické faktory. Rizikové haplotypy tedy v posledních desetiletích patrně ztratily kus své rizikovosti, a možná i protektivní ztratily část své protektivity [18]. Vzestup incidence diabetu je tedy příliš rychlý na to, aby se dal objasnit změnou genetického podkladu v populaci, ale je pravděpodobně způsoben změnou expozice nějakému negenetickému faktoru. Liší se též rozložení rizikových HLA haplotypů podle věku při manifestaci. Nejrizikovější genotyp mají děti diagnostikované v prvních letech života, naopak adolescenti mají častěji genotypy neutrální či dokonce mírně protektivní [19]. To ukazuje na postupně klesající podíl rizika daného genetickými faktory a naopak stoupající vliv faktorů prostředí s rostoucím věkem při manifestaci diabetu.

Distribuce jednotlivých HLA haplotypů neovlivňuje pouze riziko DM1T, ale také jeho průběh. Přítomnost genotypů rizikových pro DM1T je asociována jednak s rychlejší progresí z prediabetické fáze do klinického diabetu [20] a také s kratším obdobím postiniciální remise, tedy rychlejší ztrátou reziduálních B-buněk [21]. Vzhledem ke známému překryvu rizikových genotypů mezi DM1T, celiakií a autoimunitní tyreoiditidou není překvapivé, že diabetické děti s HLA-DQ2 či HLA-DQ8 mají několikanásobně vyšší pravděpodobnost rozvoje těchto tzv. sdružených autoimunit [22,23].

Negenetické příčiny diabetu 1. typu

Pro zásadní úlohu negenetických faktorů v patogenezi diabetu mluví několik faktů:

• konkordance monozygotních dvojčat je neúplná, dosahuje maximálně 50 %
• existují lokální epidemie DM1T
• incidence DM1T u mnoha geneticky stabilních populací setrvale stoupá a zdá se, že podíl genetických faktorů na etiologii diabetu s časem klesá

Mezi další nepřímé důkazy patří též místní a časové hromadění případů DM1T. Pozorujeme, že nově manifestovaní přicházejí častěji v určitých fázích roku (sezonalita diagnózy) i místě diagnózy (lokální epidemie diabetu), clustering je ovšem vidět i mnoho let před nástupem diabetu – v době školní docházky a dokonce v místě a čase narození [24,25]. Existují četné negenetické faktory s prokázaným nebo alespoň diskutovaným vlivem na riziko DM1T – přehled uvádíme v tab. 2. Většina z těchto faktorů je asociována sekundárně, nejsou to tedy přímí etiologičtí činitelé, ale indikátory (tzv. proxy measures), měřítka nějaké další expozice, která je v kauzálním vztahu k DM1T. Negenetické rizikové faktory jsou jednotlivě slabé, je jich nicméně velké množství. Riziko je rozdrobeno mezi špatně definované faktory, jejichž jednotlivý příspěvek je nízký – riziko asociované s přítomností nebo nepřítomností faktoru se zřídka liší více než 2–5krát, u většiny expozic je to však ještě mnohem méně [26].

Monogenní typy diabetu

Monogenní diabetes vzniká na podkladě nosičství jedné mutace nebo více mutací v jednom genu. U dětí je většina případů monogenního diabetu způsobena mutacemi v genech regulujících funkci B-buněk [6]. Vzácně může diabetes vzniknout i díky mutaci vedoucí k velmi těžké inzulinové rezistenci. Mezi monogenní typy diabetu řadíme i diabetes vzniklý jako součást jiné geneticky podmíněné nemoci, např. diabetes při cystické fibróze.

Monogenní diabetes mají přibližně 3–4 % dětí s diabetem. Velmi často je zaměněn za většinové typy diabetu (DM1T nebo DM2T) [27], přitom stanovení správné diagnózy umožní výběr optimální terapie, která je v mnohých aspektech odlišná od doporučení pro běžnější typy diabetu.

V klasickém pojetí se jedná o autozomálně dominantně dědičné onemocnění, které je typické výskytem diabetu v každé generaci s 50% rizikem přenosu na děti. Jednotlivé typy MODY diabetu se dříve číslovaly (MODY1, MODY2 atd) podle pořadí objevů genů, jejichž mutace MODY diabetes způsobují. V současné době se již toto číselné označení nepoužívá, preferujeme označení genetické obsahující název mutovaného genu (např. HNF1A-diabetes, nikoli MODY3). Na monogenní diabetes pomýšlíme u pacientů, kteří mají:

• pozitivní rodinnou anamnézu diabetu (nebo poruch glukózové tolerance, gestačního diabetu, mírné hyperglykemie nalačno) s manifestací nemoci do 40 let věku v každé generaci (autozomálně dominantní typ dědičnosti)

a dále alespoň jedno z následujících kritérií:

• k manifestaci diabetu (hyperglykemie) došlo bez známek diabetické ketoacidózy
• pacient je sledován pro trvalou stacionární mírnou hyperglykemii, která ani bez léčby neprogreduje
• byla zjištěna negativita protilátek anti-GAD, anti-IA2, anti-IAA, anti-ZnT8, případně HLA genotyp protektivní proti DM1T

Pro monogenní diabetes svědčí kromě absence autoprotilátek též pozitivní rodinná anamnéza diabetu alespoň ve 3 generacích, i zde je však třeba zohlednit možnost mutací de novo, které se vyskytují v České republice a na Slovensku u necelých 8 % potvrzených případů [28]. Celou situaci komplikuje fakt, že i u monogenního diabetu se mj. podle studie pocházející ze skupiny jubilanta mohou vyskytovat GAD protilátky povětšinou v nízkých titrech [29]. Přítomnost diabetické ketoacidózy není absolutním vylučovacím kritériem monogenního diabetu, v případě dalšího precipitujícího faktoru (např. infekt) může k těžké ketoacidóze dojít [30]. Nikdy však nebyla popsána při manifestaci diabetu.

Etiolopatogeneze i klinický obraz monogenního diabetu je velmi pestrý a jejich detailní popis přesahuje rozsah i cíl tohoto sdělení. Proto se omezíme pouze na monogenně podmíněné autoimunitní typy diabetu, z nichž některé byly popsány teprve nedávno.

Monogenní formy autoimunně podmíněného diabetu

Vrozené defekty imunologické autotolerance způsobují komplexní dysfunkci imunitního systému; v jejich důsledku nositelé těchto mutací vyvíjejí v průběhu dětství různé autoimunitní choroby včetně autoimunitního diabetu.

APECED (autoimunní polyendokrinopatie, kandidóza, ektodermální dystrofie, alternativní název APS-1 – autoimunitní polyglanduální syndrom typu 1) je vzácné autoimunitní onemocnění vznikající na podkladě autozomálně recesivní dědičnosti s incidencí přibližně 1 : 100 000. Jeho podkladem je autoimunní destrukce endokrinních žláz zprostředkovaná T-lymfocyty a současné postižení neendokrinních orgánů. Ve 2–23 % případů je onemocnění spojeno se vznikem diabetu, který se klinicky neliší od DM1T. Klasická forma APECED zahrnuje především kombinaci hypoparatyreózy, chronické mukokutánní kandidózy a Addisonovy choroby, nicméně příznaky mohou být velmi pestré [31]. Syndrom je způsobený mutacemi v genu AIRE (autoimmune regulátor), jehož produkt protein AIRE je transkripčním faktorem, který je nezbytný k „přečtení“ molekulární sekvence všech potenciálních autoantigenů v thymu během vývoje imunitního systému [32]. Tento mechanizmus je zásadním předpokladem pro eliminaci potenciálně autoreaktivních klonů T-lymfocytů. Pokud je porušen, dochází v průběhu života k rozvoji četných autoimunitních onemocnění. O tom, zda se mezi ně zařadí též autoimunitní diabetes, nicméně rozhodují zřejmě i další faktory – např. alela HLA-DQB1*0602 má DM1T–protektivní charakter podobně jako u ostatních osob [33].

Syndrom IPEX (imunitní polyendokrinopatie vázaná na X chromozom) je vzácné autoimunitní onemocnění postihující pouze chlapce. Do klinického obrazu patří permanentní novorozenecký diabetes, velmi časně nastupující tyreoiditida, průjmy, ekzémy, rekurentní těžké infekce, hemoragická diatéza a hemolytická anémie [34]. Nicméně klinické formy mohou být velmi proměnlivé v závislosti na tom, který orgán je autoimunitní reakcí nejvíce postižen. V krvi je přítomna trvalá aktivace autoagresivních T-lymfocytů CD4⁺. Syndrom vzniká na podkladě mutace v genu FOXP3 kódujícím protein scurfin působící jako transkripční faktor. Předpokládá se, že scurfin je protein nutný pro diferenciaci a správnou funkci CD4⁺CD25⁺ T-lymfocytů, tedy regulačních T-lymfocytů (T_regs). U pacientů s mutací FOXP3 nedochází k supresi efektorových lymfocytů pomocí T_reg, což vede k závažnému rozvoji lymfoproliferativního onemocnění s rozličnými klinickými projevy [34]. V případě plně vyjádřeného IPEX je jedinou možností léčby transplantace kostní dřeně.

Diabetes způsobený mutací v genu CTLA4 byl popsán v roce 2014 [35,36]. CTLA4 (protein cytotoxic T-lymfocyte antigen 4) je základní negativní regulátor imunitní odpovědi, jehož úplná ztráta způsobuje rozvoj autoimunitních onemocnění, polymorfizmus v tomto genu modifikuje riziko manifestace klasického DM1T. Hetero­zygotní mutace v CTLA4 způsobují autozomálně dominantní syndrom dysfunkce imunitního systému charakterizovaný nejčastěji kombinací různých autoimunitních projevů (pancytopenie, průjmy, diabetes, alopecie, hemolytická anémie a další) a recidivujících infekcí. Onemocnění má neúplnou penetranci, klinický obraz u nositelů mutace v rámci jedné rodiny se může zásadně lišit. Terapeuticky se u nejtěžších případů zkouší kromě kombinace imunosupresiv abatacept [37], v případě selhání je i v těchto případech indikována transplantace kostní dřeně s nejistým výsledkem.

Podobnou jednotkou je diabetes vzniklý v důsledku mutace genu LRBA (lipopolysaccharide-responsive and beige-like anchor protein). Jeho změny byly nově popsány u pacientů s časně vznikajícím autoimunitním diabetem (kojenecký a batolecí věk), enteropatií a torpidní trombocytopenií nebo pancytopenií. Terapie se neliší od mutace v genu CTLA4 [38].

Geny STAT1 a STAT3 (signal transducers and activator of transcription) kódují rodinu tzv. STAT proteinů. Ty působí v jádře jako transkripční faktory mediující expresi řady genů, které se aktivují v odpovědi buňky na stimulaci prostřednictvím cytokinů (interferon α, γ nebo IL6) nebo růstových faktorů [39]. Ztráta funkce STAT3 v důsledku mutace se klinicky projevuje rozsáhlými ekzémy (při velmi vysokém IgE) a opakovanými infekty. Naopak aktivační mutace STAT3 vedou k rozvoji autoimunitních onemocnění zahrnujících časně nastupující diabetes, autoimunitní tyreoiditidu, zánětlivá střevní onemocnění i hematologické abnormality [40]. Rozvoj autoimunitního diabetu byl publikován také u nositelů mutací v STAT1 [41]. Terapie je svízelná, jsou popsány případy úspěšné transplantace kostní dřeně, naše zkušenosti s touto léčbou prozatím příliš povzbudivé nejsou.

Diabetes 2. typu u dětí

V naší populaci je proporce dětí s DM2T velmi nízká, okolo 1 %, a nejsou signály, že by docházelo k růstu incidence [42]. V diferenciální diagnostice DM2T vs DM1T využíváme v prvním kroku autoprotilátky specifické pro diabetes, jejichž negativita zvyšuje pravděpodobnost, že se skutečně jedná o DM2T. Jsou-li protilátky pozitivní, jde nejspíše o DM1T, nicméně je dobré mít na paměti, že existují přechodné typy někdy označované též jako „double diabetes“ či „diabetes 1,5“, které sdružují základní klinické znaky obou nejčastějších typů diabetu [43].

Metodou volby při terapii DM2T u adolescentů je metformin v dávce postupně stoupající až na 2–2,5 g denně. Pokud nedojde k zlepšení kontroly diabetu na doporučené hodnoty (HbA_1c < 53 mmol/mol), zahajujeme terapii inzulinem, nejčastěji pomocí intenzifikovaného inzulinového režimu [44]. Studie s využitím novějších antidiabetik u dospívajících probíhají.

Závěr

Dětský diabetes je etiologicky heterogenní. Rozpoznání etiopatogenetických mechanizmů vedoucích ke vzniku jednotlivých typů umožňuje zahájení cílené terapie, pomáhá k odhadu rizika komorbidit a v některých případech i stanovení životní prognózy pacientů.

doc. MUDr. Zdeněk Šumník, Ph.D.

zdenek.sumnik@lfmotol.cuni.cz

Pediatrická klinika 2. LF UK a FN v Motole, Praha

www.lf2.cuni.cz

Doručeno do redakce 6. 8. 2016

Přijato po recenzi 26. 9. 2016