Jak klinicky interpretovat výsledky TP53 analýz u chronické lymfocytární leukemie v kontextu dostupných terapeutických režimů

Souhrn

Mutace v genu TP53 představují nejdůležitější nepříznivý prognostický a prediktivní faktor u pacientů s chronickou lymfocytární leukemií (CLL) a přispívají k celkově horšímu průběhu onemocnění a riziku časného relapsu či rezistenci na podávanou chemoimunoterapii. Z dosavadních výsledků vyplývá, že při léčbě chemoimunoterapií (fludarabin, cyklofosfamid a rituximab – FCR) v první linii dochází ke klonální selekci TP53 aberantních buněk, což má nepříznivý vliv na prognózu onemocnění. Recentní studie zabývající se klonální evolucí mutací v genu TP53 pod vlivem terapie BCR a Bcl-2 inhibitorovými léčivy podobný trend nenaznačují. V klinické diagnostice aberací TP53 se čím dál více využívá metody sekvenování nové generace (NGS), které dosahují citlivosti detekce alelické frekvence pod 10 % oproti standardně zavedenému Sangerovu sekvenování. V posledních letech se pozornost výzkumu CLL upíná zejména k mutacím v genu TP53 s alelickou frekvencí pod 10 % a jejich klinickou významnost. V následujícím přehledovém článku shrnujeme doposud publikované výsledky klonální evoluce mutací v genu TP53 pod vlivem různým terapeutických režimů zejména s ohledem na mutace s alelickou četností < 10 % a jejich klinickou interpretaci.

Klíčová slova:

chronická lymfocytární leukemie – mutace TP53 – klonální evoluce – FCR – BRC a Bcl-2 inhibitory

ÚVOD

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je chronické lymfoproliferativní onemocnění charakterizované klonální proliferací maligně transformovaných maturovaných B-lymfocytů a jejich akumulací v periferní krvi, kostní dřeni, lymfatických uzlinách, slezině či dalších orgánech.

CLL je leukemie s nejvyšší incidencí a prevalencí v západním světě. Jedná se o onemocnění, u něhož je molekulárně-genetické vyšetření rutinní součástí diagnostického a léčebného algoritmu nezbytného k zvolení vhodného typu terapie pro konkrétního pacienta. Diagnostická kritéria jsou založena na analýze periferní krve, případně kostní dřeně, proto není nutné provádět invazivní výkony typu biopsie uzlin, které jsou pro pacienta více zatěžující. Biologický materiál je proto snadno dostupný jak pro diagnostiku i sledování vývoje onemocnění a odpovědi na léčbu, tak pro analýzu prediktivních markerů pro zvolení vhodné cílené terapie. V neposlední řadě neinvazivní odběr nádorových buněk usnadňuje i výzkum, který v posledním desetiletí vedl k značnému rozšíření léčebných možností. I přes výše uvedené výhody a stále se zdokonalující cílenou terapii významně prodlužující život pacientů však CLL zůstává nevyléčitelným onemocněním.

VÝZNAM DEFEKTŮ V GENU TP53 U PACIENTŮ S CLL PŘI LÉČBĚ CHEMOIMUNOTERAPIÍ A CÍLENÝMI LÁTKAMI

Defekty genu TP53 společně s nemutovaným IGHV a komplexními změnami karyotypu v současnosti představují nejsilnější negativní prognostické znaky tohoto onemocnění [1,2].

Produkt genu TP53, protein p53, koordinuje celou řadu mechanizmů spojených s odpovědí na buněčný stres a poškození DNA, zejména regulaci buněčného cyklu a spuštění apoptózy. Pro svou zcela zásadní roli v udržování stability genomu bývá p53 označován jako „strážce genomu“. Gen TP53 patří mezi nádorové supresory, jeho inaktivace akceleruje maligní transformaci. Vzhledem k tomu, že poškození DNA je klíčovým mechanizmem klasické chemoterapie, zhoršují defekty genu TP53 odpověď nádoru na chemoterapii. Selekční tlak vyvolaný chemoterapií navíc podporuje přežití nádorových buněk s nefunkčním p53 a jejich klonální expanzi v relapsu onemocnění.

Aberace TP53 se vyskytují u 5–12 % doposud neléčených pacientů s CLL a jejich incidence signifikantně narůstá pod vlivem chemoimunoterapie (CHIT). U pokročilého, refrakterního či transformovaného onemocnění lze aberace TP53 zachytit u 40–60 % pacientů. U více než poloviny případů se jedná o společný výskyt mutace TP53 a delece genového lokusu [del (17p) ], zatímco samostatný výskyt těchto aberací je pozorován méně často. Samostatná mutace TP53, kterou není možné detekovat vyšetřením FISH (fluorescenční in situ hybridizace), je pozorována u 20–40 % pacientů, zatímco samostatná del (17p) je vzácnější a vyskytuje se u 5–30 % pacientů s TP53 defekty, a to v závislosti na vyšetřované kohortě [3,4].

V současné době je doporučováno vyšetření aberací TP53 vždy před zahájením nové linie terapie. European Society for Medical Oncology (ESMO) doporučuje nejdříve vyšetření přítomnosti delece lokusu 17p13 metodou FISH a poté dovyšetření mutačního stavu TP53 až v případě negativního výsledku FISH [5]. Zároveň mají být vyšetření provedena v co nejkratším časovém intervalu před zahájením každé nové linie terapie. Tato posloupnost vyšetření je sice finančně racionální, avšak vzhledem k časové náročnosti obou vyšetření v řádech týdnů mnohdy obtížně uskutečnitelná v souladu s požadavkem na vyšetření co nejblíže zahájení terapie. Naopak dle doporučení European Research Initiative on CLL (ERIC) a International Workshop on CLL (iwCLL) je zejména z výše uvedeného důvodu vhodné provést vyšetření FISH i mutačního stavu TP53 zároveň [6–8]. Záleží tedy na finančních a časových možnostech pracoviště, jak bude v případě vyšetření TP53 aberací postupovat.

Prognóza pacientů s defekty TP53 byla ještě donedávna považována za velmi nepříznivou, a i přes velkou snahu o zavedení alternativních léčebných postupů nevedlo úsilí lékařů k prodloužení přežití pacientů. Významné zlepšení přineslo až zavedení nových léčiv cílících na dráhy klíčové pro proliferaci a přežití CLL buněk – dráhu B-buněčného receptoru (inhibitory BTK a PI3Kd) a antiapoptotický protein bcl-2. Předpokládá se, že mechanizmus účinku těchto léčiv je nezávislý na dráze p53. Data ze studií sledujících vliv defektů TP53 na léčbu inhibitory skutečně ukázala výborné výsledky léčby, a to i pro pacienty, jimž byla terapie podána po několika předcházejících liniích CHIT, kdy již byli často nositeli dalších aberací a/či komplexního karyotypu [9–11]. Z dosavadních výsledků nicméně také vyplývá, že prodloužení přežití při terapii inhibitory je ovlivněno řadou dalších faktorů. OS nepřímo úměrně koreluje s celkovým počtem předcházejících linií léčeb a některá data také naznačují variabilitu délky PFS v závislosti na režimu podávání léčiva [12]. Z výsledků klinických studií hodnotících účinnost inhibitorů BTK vyplývá, že by tato terapie mohla při podávání v první linii překonat negativní vliv TP53 defektů: výsledky dlouhodobého sledování pacientů léčených kontinuálně podávaným ibrutinibem (studie A041202) publikované ve formě ASH abstraktu ukázaly, že PFS pacientů s TP53 aberacemi je srovnatelné s pacienty s TP53wt (wild-type) [13]. U pacientů léčených kontinuálním podáváním BTK inhibitoru akalabrutinib (s obinutuzumabem a bez) ve studii ELEVATE-TN obdobně nebyl zaznamenán signifikantní rozdíl v PFS mezi pacienty s a bez TP53 defektu [14]. Nutno poznamenat, že srovnání bylo prováděno v časovém horizontu 48 měsíců a není vyloučeno, že by se případný rozdíl mohl projevit i později. Možnosti cílené léčby u pacientů s TP53 defekty dokládají výsledky 3. fáze studie SEQUOIA, kde v nerandomizované kohortě pacientů s del (17p) léčené zanubrutinibem v monoterapii první linie (rameno C) bylo dosaženo obdobného PFS a OS v 24 měsících jako u pacientů bez del (17p) (rameno A): PFS 88,9 % vs. 85,5% a 93,6 % vs 94,3%, respektive. Přímé statistické porovnání obou skupin není bohužel dispozici, ale i tak data ukazují excelentní výsledky u takto rizikové skupiny pacientů. Oproti tomu při časově omezené léčbě první linie kombinací obinutuzumab (6 cyklů) – venetoclax (12 cyklů) ve studii CLL14 pacienti s TP53 aberacemi relabovali dříve než pacienti bez těchto aberací [15]. Tito pacienti však dosahovali kompletních remisí a negativity minimální zbytkové choroby srovnatelně s pacienty bez TP53 defektů. Proto autoři předkládají úvahu, že zkrácené PFS lze pravděpodobně přičítat spíše rychlejší obnově populace buněk s TP53 defekty nežli jejich primární rezistenci vůči venetoclaxu. Jelikož však dosud nemáme k dispozici údaje o vlivu TP53 defektů na trvání PFS při kontinuálním podávání venetoclaxu, nelze v současnosti rozhodnout, do jaké míry je délka trvání remise u pacientů s TP53 defekty ovlivněna typem podávaného léčiva či délkou terapie. V tomto ohledu bude třeba dalších studií, které snad povedou k optimalizaci léčebných algoritmů pro tuto rizikovou skupinu pacientů.

MUTACE TP53 POD 10 % VAF PŘI LÉČBĚ CHEMOTERAPEUTICKÝMI REŽIMY

Interpretace mutačního stavu TP53 je v současnosti vázána především na arbitrárně stanovenou hranici 10 % alelické frekvence (variant allele frequency – VAF) dle Sangerova sekvenování, neboť i současně platná doporučení jsou založena zejména na výsledcích velkých studií využívajících pro identifikaci mutací právě Sangerovo sekvenování [4,6,16,17].

S rozvojem technologických možností došlo přibližně od roku 2013 k výraznému rozšíření možností sekvenování nové generace (NGS) a limit detekce se díky těmto metodám posunul hluboko pod 10 % VAF (v některých studiích až k 0,1% VAF) [12,18–20]. Pozornost se stále častěji začala obracet ke klinickému významu malých TP53-mutovaných klonů u pacientů s CLL.

Při detekci těchto tzv. minoritních mutací (pod 10 % VAF) je pro správnou interpretaci nálezu nezbytné brát v úvahu celkový obraz onemocnění. Zcela klíčové je vztahovat podíl CLL buněk k celkové lymfocytóze či k jejich distribuci, která může být převážně v periferní krvi nebo naopak v uzlinách v případě SLL či relapsu do uzlin. Ne zřídka se tak můžeme setkat s nepřesným stanovením; pokud bychom detekovali malou populaci nízkofrekvenčních klonů v krvi při převážně uzlinovém postižení, mohli bychom mylně přehlédnout dominantní zastoupení v celkové nádorové populaci. V takovém případě bychom mohli dokonce nalézt i výsledek zcela falešně negativní. Vezmeme-li např. současnou hranici pro reportování mutace 10 % VAF, pak v kontextu různého zastoupení nádorových buněk v analyzovaném vzorku a statusu druhé alely může tento výsledek znamenat zcela jinou velikost TP53-defektního klonu (obr. 1).

Při studiu prací, které se věnují vlivu minoritních mutací TP53 na přežití pacientů, je třeba brát ohled na to, ve které fázi onemocnění byli pacienti vyšetřováni (tab. 1). První data zabývající se klinickým dopadem minoritních mutací TP53 na celkové přežití byla získána na souborech pacientů vyšetřených v době diagnózy či v brzkých stádiích onemocnění [18,19]. Tyto publikace ukazovaly vliv na celkové přežití srovnatelný s výskytem mutací TP53 > 10 % [18,19]. Pozdější práce z dánského pracoviště vliv na přežití nepotvrdila [20]. Nejnovější velká italská studie znovu ukázala významně zkrácené celkové přežití pacientů nesoucí mutace TP53 < 10 % VAF. Nicméně při srovnání jednotlivých skupin je patrný trend naznačující delší OS pacientů s TP53 < 10 % oproti pacientům s TP53 > 10 % [21]. Možnou příčinou nejednotných výsledků je heterogenita kohort vyšetřovaných při diagnóze, zejména variabilní podíl dlouhodobě neléčených pacientů s převážně mutovaným IGHV; u těchto pacientů by dle současných doporučení nebylo vyšetření TP53 ani indikováno.

Další provedené studie se proto zaměřily na odběr vzorků od pacientů s aktivní CLL před zahájením první linie CHIT. Výsledná data těchto velkých studií a pilotní data od pacientů před terapií z výše zmiňovaných publikací se již jednoznačně shodovala na vlivu minoritních klonů TP53 na zkrácení OS v porovnání s pacienty bez TP53 mutací [12,18,20–22]. Při podrobnějším pohledu na data založená na větších kohortách pacientů se ovšem ukazuje, že prognóza pacientů s minoritními TP53-mutovanými klony je spíše střední, s mediánem OS mezi pacienty s mutacemi nad 10 % VAF a pacienty bez mutace TP53 (tab. 1) [12,21,22].

Některé z výše zmíněných studií analyzovaly dopad minoritních TP53 mutací nejen na OS, ale i na PFS po 1. linii CHIT [12,21,22]. Ani tyto výsledky nebyly zcela konzistentní, nicméně některé z nich ukazovaly, že vliv minoritních mutací TP53 na PFS již není tak jednoznačný a doba remise není signifikantně zkrácena oproti pacientům bez mutace [12,22]. Vysvětlením tohoto pozorování může být nutnost expanze TP53 mutovaného klonu pod vlivem CHIT k jeho klinické manifestaci.

TP53 MUTACE POD 10 % VAF PŘI POUŽITÍ INHIBITORŮ

S nástupem cílené léčby pro pacienty s TP53 defekty vyvstala také nově otázka klinického vlivu minoritních mutací v kontextu nových léčebných postupů. Tato otázka v současnosti představuje velmi aktuální téma CLL výzkumu, avšak pro recentnost a technickou náročnost vyšetřování těchto minoritních mutací jsou data z léčby inhibitory prozatím velice omezená. Výsledky dosud publikovaných prací jsou limitované zejména nejednotnou kohortou pacientů, často velmi výrazně předléčených mnoha liniemi terapie, a podáním různých druhů inhibitorů vč. jejich kombinací [12,23].

Práce publikovaná v letošním roce se zabývala vlivem alelické četnosti mutací TP53 na odpověď na léčbu inhibitory v první linii i na celkové přežití (BTK inhibitor ± venetoclax ± mAb). Autoři nepozorovali signifikantní rozdíl v PFS i OS po 4 letech sledování mezi pacienty s nízkofrekvenčními (VAF 1–10 %) a vysokofrekvenčními (VAF ≥ 10 %) variantami TP53 [23]. Tato studie však měla celou řadu omezení, zejména pak chybějící klíčové srovnání s kohortou pacientů s wtTP53, nevyvážené zastoupení konkrétních terapeutických režimů mezi kohortami, či nepřesně popsanou metodiku testování mutačního stavu TP53 napříč kohortou. Přežití relabovaných pacientů s minoritními TP53 mutacemi léčených inhibitory v České republice jsme se snažili analyzovat i v rámci naší práce a nepozorovali jsme významný rozdíl napříč kohortami pacientů s různou mutační náloží. Nicméně náš soubor byl složen z pacientů léčených různými inhibitorovými režimy a v různém stadiu předléčenosti, a proto z těchto výsledků nelze vyvozovat jednoznačné závěry [12].

KLONÁLNÍ EVOLUCE MINORITNÍCH TP53 MUTACÍ

Zatímco vliv minoritních TP53 mutací na léčebnou odpověď a přežití pacientů je stále diskutován, vliv CHIT na expanzi klonů nesoucích TP53 defekty byl nejen opakovaně publikován, ale je také jednoznačně viditelný v rutinní klinické praxi [4,12,18,24–26]. Konkrétní případy expanze TP53 defektů po CHIT jsou pozorovány zejména díky rozšiřujícímu se využití NGS se spolehlivým detekčním limitem okolo 5 % VAF v rutinních laboratorních provozech. V naší nedávno publikované studii byla na souboru více než 50 pacientů vstupujících do 1. léčby potvrzena klonální selekce již dříve existujících subklonů nesoucích TP53 aberace pod vlivem CHIT, zejména FCR (fludarabin, cyklofosfamid a rituximab) režimu [12]. V kontextu cílené terapie novými režimy s inhibitory však byla expanze TP53 mutovaných klonů pozorována jen ojediněle (graf 1). V souladu s dalšími nedávnými studiemi bylo pozorováno heterogenní chování minoritních TP53 klonů pod vlivem terapie inhibitory s převažujícími nevýznamnými změnami oběma směry [27,28]. Jen ve zcela ojedinělých případech byl pozorován klonální nárůst i při terapii inhibitory, zde je však nutné brát v potaz celkový biologický obraz takovýchto případů, např. výskyt přidružených „driver“ BTK mutací. Z těchto pozorování vyplývá, že na rozdíl od léčby chemoimunoterapií již TP53 mutace při terapii inhibitory není „driver“ mutací [12].

SHRNUTÍ A NÁVRH PŘIPRAVOVANÝCH DOPORUČENÍ

Co tedy vyplývá ze současných poznatků o chování minoritních TP53 mutací během léčby různými terapeutickými režimy? Studie jasně dokazují vysoké riziko klonální expanze minoritních TP53 mutací pod vlivem FCR režimu, což vede ke zkrácení celkového přežití pacientů. Je čím dál více zřejmé, že cílená léčba inhibitory takovouto expanzi TP53 mutovaných klonů neakceleruje. V klinické praxi je pro nález minoritních TP53 mutací stále v platnosti doporučení ERIC, tedy při VAF 5–10 % je možné klinicky reportovat pouze s poznámkou o nejasném klinickém významu. U TP53 mutací s VAF < 5 % se pro jejich dosavadní nejasnou klinickou významnost a vysoké riziko falešně negativních a falešně pozitivních výsledků reportování prozatím nedoporučuje [6,8]. Nicméně s ohledem na přesvědčivé výsledky dosud publikovaných studií, zavádění spolehlivých NGS metod do rutinní praxe a na již delší dobu probíhající odbornou diskuzi na mezinárodní úrovni se uvedená doporučení stávají zastaralými a v současné době se připravuje jejich aktualizace. Mezinárodní panel odborníků pro CLL se nyní spíše přiklání k názoru reportovat všechny varianty mutací TP53, a to bez ohledu na jejich VAF. Toto stanovisko je samozřejmě založeno na předpokladu, že v laboratoři je zavedena spolehlivě validovaná NGS metoda a pracoviště se pravidelně účastní externích kontrol kvality (TP53 ERIC certifikace, GenQA Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL) TP53 mutation analysis). Přestože se NGS stává preferovanou technologií, je při jeho nedostupnosti stále možné využít Sangerovo sekvenování. Bez ohledu na použitou metodu detekce zůstává stále v platnosti, že zodpovědnost za správný laboratorní výsledek (technologicky i interpretačně) nese laboratoř, zatímco za klinickou aplikaci výsledku pro zvolení příslušné léčby zodpovídá ošetřující lékař (obr. 2). Pro správnou volbu terapie by měl lékař mít k dispozici kompletní informace o pacientovi, tedy i o přítomnosti minoritního TP53-mutovaného klonu. Při posuzování velikosti postiženého klonu je navíc třeba brát v úvahu nejen velikost mutace udávané jako VAF, ale i proporci nádorové populace a použitou metodu separace (obr. 1). Výsledná informace by pak měla být uvažována v kontextu dostupných terapeutických možností. Mutace dominující v nádorové populaci s vysokou pravděpodobností bezprostředně ovlivňuje odpověď na léčbu, zatímco přítomnost minoritního klonu představuje riziko expanze za přítomnosti selekčního tlaku při nesprávně zvolené terapii. Při současně stále probíhajícím intenzivním výzkumu se snad již zanedlouho dočkáme odpovědi na otázku, zda a jak velký význam mají mutace TP53 s VAF < 10 % při rozhodování o typu cílené léčby (např. z hlediska délky podávání a konkrétního typu inhibitoru) či zda převáží vliv majoritní části nádorové populace nesoucí intaktní gen TP53.

PODÍL AUTORŮ NA PŘÍPRAVĚ RUKOPISU

BKV, JM, ŠPav, MD, KP – příprava rukopisu

YB, AP, ŠPosp, MD – korekce a revize rukopisu

ČESTNÉ PROHLÁŠENÍ AUTORŮ

Autoři práce prohlašují, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku nejsou ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

PODĚKOVÁNÍ

Práce byla realizována za podpory Grantu pro specifický výzkum LF MU pod grantovým číslem MUNI/A/1224/2022 a MZ ČR – RVO (FNBr, 65269705). Podpořeno projektem Národní ústav pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU.

Do redakce doručeno dne: 30. 9. 2022.

Přijato po recenzi dne: 30. 12. 2022.

prof. MUDr. Michael Doubek, Ph.D.

IHOK FN Brno

Jihlavská 20

625 00 Brno

e-mail: doubek.michael@fnbrno.cz

Transfuze Hematol Dnes 2023; 29(2): 117– 123