Mechanismy navozené imunotolerance nádorových buněk u chronické lymfatické leukemie a možnosti jejich detekce metodami průtokové cytometrie

Souhrn

Imunotolerance nádoru, popřípadě alterace imunity jako celku, je častým důsledkem interakce nádorových buněk s buňkami imunitního systému. Mezi hlavní mechanismy navození imunotolerance počítáme navození stavu vyčerpání u efektorových CD8+ T-lymfocytů cestou interakce receptoru programované buněčné smrti PD-1 se svými ligandy, nižší exprese MHC proteinů II. třídy na antigen prezentujících buňkách CD4+ T-lymfocytům, změny v poolu T-regulačních lymfocytů, ovlivnění mikroprostředí nádoru a antiapoptotické děje. Ovlivnění imunitní odpovědi cestou blokády dráhy programované buněčné smrti terapeutickými monoklonálními protilátkami je v současné době předmětem klinických studií.

Klíčová slova:
imunotolerance, chronická lymfatická leukemie, T-regulační lymfocyty, dráha programované buněčné smrti, průtoková cytometrie

Úvod

Výzkum vztahů mezi nádorem a hostitelským prostředím, zprostředkovaný imunokompetentními subpopulacemi, je jedním z ústředních témat současné hematoonkologie. Původní „tumorcentrický“ model, ve kterém je výsledek interakce určován téměř výhradně charakteristikami nádorové tkáně, v současné době ustupuje novému pojetí, které zohledňuje výrazný podíl imunitní komponenty hostitele v oblastech geneze nádoru, jeho růstu, prognózy a reakce na terapeutické postupy, zejména na biologickou léčbu na bázi imunoterapie. Vhodným příkladem se jeví být chronická lymfatická leukemie (CLL), která je nejčastější leukemií západní polokoule. Je charakteristická klonální proliferací nádorově transformovaných antigenně stimulovaných zralých B-lymfocytů s typickým imunofenotypem CD19⁺CD20⁺CD22^-CD23⁺CD5⁺ a jejich následnou kumulací v periferní krvi a kostní dřeni, případně ve slezině a lymfatických uzlinách. Biologicky i prognosticky se CLL rozpadá na dvě podskupiny dle diferenciačního stadia maligního B-lymfocytu. Odlišujeme CLL odvozenou od pregerminálních nebo aktivovaných B-lymfocytů, které neprošly změnami v germinálním centru, nesoucích nemutovanou formu IgV_H genu, a CLL s maligním klonem postgerminálních paměťových B-lymfocytů s mutovanou formou IgV_H (1). Ukazuje se, že životaschopnost maligní populace z velké části závisí na permisivitě mikroprostředí nádoru, tedy na komplexu celulární komponenty (T-lymfocyty, makrofágy, stromální folikulární dendritické buňky) poskytujícím chemokiny, cytokiny a angiogenní faktory nezbytné pro přežití nádorových buněk (2). Pronádorově se rovněž uplatňuje dráha B-buněčného receptoru (B-cell receptor, BCR), kdy aktivace transkripčních faktorů cestou tyrozinových kináz (ZAP 70, Bruton tyrosine kinase, spleen tyrosine kinase, Src family kinases, phosphatidyl inositol 3-kinase) zlepšuje přežití maligních buněk (3, 4, 5). Recentní literatura také naznačuje, že CLL může být řízena autonomní signalizací BCR nezávisle na antigenní stimulaci (6). Lepší přežívání maligních B-lymfocytů rovněž vyplývá z jejich zvýšené odolností vůči apoptóze, což je dáno mimo jiné i delecemi genů pro specifické mikro-RNA, které jsou součástí deletovaných dlouhých ramen chromozomu 13 [del (13q14)] (7, 8). Imunitní mechanismy, které se podílejí na podmínění proliferace patologického klonu u CLL lze schematicky rozdělit podle místa působení na mechanismy vázané na T-regulační lymfocyty, stimulaci dráhy programované buněčné smrti cytotoxických T-lymfocytů a pravděpodobně i NK buněk, funkční defekty pomocných T-lymfocytů indukované nádorem, a konečně mechanismy vázané na MHC.

Nádorem indukované funkční defekty T-lymfocytů

Klinicky významnou interakcí mezi nádorem a imunitou je zejména funkční postižení T-lymfocytů, ústící v selhávání protinádorové imunity a snížené odolnosti vůči bakteriálním a virovým patogenům. Toto postižení je způsobeno komplexem dějů, z nichž vedoucí úlohu hraje činnost T-regulačních lymfocytů a kostimulátorů a koinhibitorů T-lymfocytů, označovaných jako B7 homology, a jejich receptorů (9). Jedná se o jev označovaný jako vyčerpání (exhausting) T-lymfocytů, které pak nejsou schopny efektivního cytotoxického působení na cílové buňky. Tento získaný stav T-lymfocytové dysfunkce je definován zvýšenou expresí markerů PD-1 (receptor programované buněčné smrti - 1, programmed death-1), CD244 a CD160 (10), sloužících jako negativní regulátory aktivace lymfocytů, a byl původně popsán v kontextu chronických virových infekcí (mezi ligandy výše uvedených markerů patří např. proteiny mediující vstup herpetických virů do buňky) (11). Defekt spočívá v nižší expresi genů pro cytoskeletální proteiny, vede k chybnému formování synapsí a tím k nefunkčnímu směrování transportu cytotoxických vehikul z efektorové buňky. Produkce F-aktinu, granzymu B ani vlastní degranulace není postižena (12). Chronická stimulace virovými antigeny vede ke ztrátě imunokompetence CD8⁺ T-lymfocytů, ústící v defekt cytotoxického působení, redukované produkce cytokinů a ztrátě proliferační kapacity (12). Podobné postižení imunokompetentních T-lymfocytových subpopulací je v poslední době popisováno i u nemocných s dalšími hematologickými malignitami (chronická myeloidní leukemie, akutní myeloidní leukemie, T-buněčná leukemie/lymfom dospělých) (13, 14). Funkční testy u nemocných s CLL odhalily, že markery T-lymfocytové dysfunkce (PD-1, CD244 a CD160) jsou nejsilněji exprimovány na T_EM buňkách (T effector memory, CCR7^-/CD45RA^-) a T_EMRA (CD45RA⁺), zatímco na naivních (CCR7⁺CD45⁺RA⁺) a paměťových T_CM (T central memory, CCR7⁺/CD45RA^-) je exprese významně nižší. Tyto výsledky ukazují posun v kompartmentu cirkulujících T-lymfocytů směrem k diferencovaným formám T-lymfocytů po kontaktu s antigenem, nesoucím markery vyčerpání (12). Dále byla zjištěna redukce počtu CD8⁺ T-lymfocytů schopných proliferace po polyklonální aktivaci a prolongace buněčného cyklu u dělících se forem (12). A konečně, experimentálně byla prokázána snížená schopnost cytotoxického působení na patologické buňky (12, 15). Na rozdíl od vyčerpání T-lymfocytů u chronických virových infekcí nebyla u pacientů s CLL pozorována ztráta schopnosti produkovat efektorové cytokiny, intracelulární koncentrace interferonu-γ (IFNγ) a faktoru indukujícího nekrózu nádoru (TNFα) byla ve srovnání se zdravými dárci dokonce zvýšená, což odpovídá vyššímu zastoupení T_EM a T_EMRA buněk, produkujícím vyšší množství IFNγ a TNFα než naivní T-lymfocyty a T_CM (12). Byl studován i případný vliv cytomegalovirové infekce (CMV) u nemocných s CLL, přičemž defekt proliferace CD8+ T-lymfocytů i jejich cytotoxické funkce byl pozorován bez příčinné souvislosti s CMV pozitivitou. Naopak, zastoupení jednoho z markerů funkční inaktivity, PD-1, bylo zvýšené pouze u CMV negativních nemocných (12). Rozdílné působení virových a nádorových buněk na funkčnost CD8⁺ T-lymfocytů může odpovídat odlišnému působení vysoce afinitních virových antigenů a nízce afinitních antigenů nádorově transformovaných, tělu vlastních B-lymfocytů. Lze zvažovat i hypotézu, ve které jsou vyčerpané T-lymfocyty udržovány v mikroprostředí nádoru cíleně, neboť jej saturují pronádorově působícími cytokiny IFNγ a TNFα (16, 17). Nádorová populace tedy dokáže komplexně a efektivně potlačovat funkce T-buněčné složky imunity, a to hned na několika úrovních, počínaje redukcí počtu proliferujících T-lymfocytů, přes ovlivnění buněčného cyklu až k zásahu do transportu a směrování vlastních cytotoxických působků.

T-regulační lymfocyty a ovlivnění imunitní odpovědi

Aktivita efektorových T-lymfocytových subpopulací je řízena prostřednictvím T-regulačních lymfocytů (Treg), které jsou součástí komplexní sítě regulující adaptivní typ imunity. Role Treg v regulačních procesech je velmi komplexní a není do dnešní doby zcela objasněna. Jejich schopnost potlačovat protinádorovou imunitu je jedním ze zásadních faktorů umožňujících maligním buňkám uniknout zničení a vede k růstu tumoru (18, 19), u pacientů s některými lymfomy však vyšší zastoupení Treg pozitivně koreluje s aktivitou cytotoxických efektorových buněk a tedy s lepší prognózou (22). Ukazuje se, že minimálně některé subpopulace Treg jsou u hematologických malignit indukovatelné nádorem, konkrétně se jedná o konverzi konvenčních CD4⁺/CD25^- T-lymfocytů na CD4/FoxP3, přičemž fyziologické B-lymfocyty schopnost konvertovat Treg postrádají (20, 21). Studium takových manipulací hostitelským organismem, zvyšujících adaptabilitu nádoru, by mohlo odhalit nové skutečnosti důležité pro hlubší poznání mechanismů evoluce nádorového růstu.

Ve světle současných znalostí rozdělujeme Treg do čtyř funkčních skupin: 1) maligní Treg, infiltrující zralé T-lymfocytové leukemie a lymfomy, typické expresí FoxP3; 2) supresorové Treg, přítomné v matrix solidních tumorů a lymfomů, charakterizované schopností potlačovat protinádorovou funkci cytotoxických CD8⁺ T-lymfocytů; 3) Treg s přímým antitumorovým efektem a 4) tzv. „incompetent“ Treg, přispívající k autoimunitním fenoménům u angioimunoblastického T-buněčného lymfomu (22).

Pro účely detekce Treg metodami průtokové cytometrie jsou v současné době využívány dva přístupy: první, tradiční, využívá exprese znaku FoxP3, což je 47 kDA protein z „forkhead/ wingedhelix“ rodiny transkripčních faktorů. Proteiny rodiny Fox fungují jako aktivátory i represory transkripce a jsou charakterizovány přítomností „forkhead“ domény, nezbytné pro vazbu DNA a lokalizaci v jádře (23). FoxP3 slouží jako represor transkripce promotorů genů pro cytokiny IL-2 a GM-CSF (24). Rovněž byla publikována zjištění, že FoxP3 interaguje s transkripčními faktory hrajícími klíčovou roli v expresi mnoha genů pro cytokiny, jako např. nuclear factor of activated T cells, (NFAT), acute myeloid leukemia 1/Runt-related transcription factor 1 (AML1/Runx1), a pravděpodobně i jaderný faktor-kappa B (NF-κB) (25, 26). Vnitrobuněčná lokalizace FoxP3 však komplikuje cytomerickou analýzu, objevily se proto tendence nahradit jej v analytických protokolech povrchovým markerem, který by byl snáze přístupný a zároveň umožňoval vysokou senzitivitu a specificitu stanovení Treg. Liu a kolektiv popsali metodiku identifikace Treg pomocí znaku CD127, který inverzně koreluje s expresí FoxP3 na T-regulačních lymfocytech (27). CD127 je jednou ze složek heterodimerického receptoru IL-7, který mimo CD127 dále sestává ze základní strukturní domény (common chain), sdílené dalšími receptory pro cytokiny (IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R a IL-21R). CD127 je exprimován na thymocytech, T- a B-lymfocytových progenitorech, zralých T-lymfocytech, monocytech a dalších buňkách lymfoidní a myeloidní linie. Bylo prokázáno, že receptor pro IL-7 sehrává důležitou roli v proliferaci a diferenciaci T-lymfocytů a in-vitro experimenty odhalily pokles exprese CD127 v průběhu aktivace T-lymfocytů (28, 29). Role Treg u CLL není doposud jednoznačná, nicméně počet T-regulačních lymfocytů inverzně koreluje s dobou přežití bez léčby (treatment free survival) a může sloužit jako nezávislý prognostický faktor předpovídající čas do začátku terapie u pacientů s nízkým až středním rizikem (30). Zajímavým zjištěním ukazujícím na provázanost mezi regulačními faktory imunity a malignitou je rovněž signifikantně vyšší absolutní počet Treg u pacientů s CLL komplikovanou autoimunitní cytopenií (31). Ukazuje se, že analýzy vztahů mezi T-regulačními lymfocyty, tumorem a imunitou hostitele mohou přinést nové a velmi významné informace o jejich vzájemných interakcích, a to zejména v počátečních obdobích nádorového růstu, kde pravděpodobně spolurozhodují o osudu nádorově transformovaných buněk.

Inhibice funkce cytotoxických T-lymfocytů cestou dráhy programované buněčné smrti

Na snížení imunitní odpovědi vůči tumoru se mimo Treg významně podílí interakce receptoru PD-1, exprimovaného především na B- a T- lymfocytech se svými ligandy PD-L1 (CD274, B7-H1) a PD-L2 (CD273, B7-DC), tzv. dráha programované buněčné smrti (32). PD-1 je vyznamným členem rodiny B7 homologů, jejichž kostimulační a koinhibiční funkce jsou u T-lymfocytů již dlouho známy (9). V poslední době bylo mimo receptoru PD-1(CD279, B7-H1) popsáno mnoho dalších významných homologů (B7-H2, B7-H3,B7-H3, B7-H4, B7-DC, atd.) s významnou rolí v regulaci vrozené i adaptivní imunity, včetně nádorové imunotolerance. Některé z nich účinně potlačují hostitelovu imunitu a umožňují tak nádorovým buňkám unikat cytotoxické odpovědi (33, 34, 35). U T-lymfocytů tyto interakce inhibují proliferaci, produkci cytokinů i schopnost cytotoxického působení, což bývá označováno jako vyčerpání (exhausting) (36). U hematologických malignit byl rovněž popsán vliv PD-1 na NK buňky, tedy NK vyčerpání, což může mít vliv na použití terapeutických monoklonálních protilátek působících cestou NK buňkami mediované cytotoxicity (ADCC) (37). Působení rodiny B7-H se nevztahuje pouze na přímé interakce mezi maligními buňkami a imunokompetentními efektory, ale jejich exprese na nemaligních buňkách tumoru významně ovlivňuje mikroprostředí a vytváří vhodnou niku pro přežití a růst nádorové populace (32). PD-1 pozitivní nádorové buňky jsou rovněž schopny indukovat T-regulační lymfocyty a řídit jejich expanzi a tlumivé působení, přičemž stejný efekt vykazují i PD-1 pozitivní dendritické buňky infiltrující nádor (38, 39, 40). V neposlední řadě nádorové buňky s vyšší expresí PD-1 vykazují rezistenci vůči apoptoptickým stimulům indukovaným jak Fas dráhou, tak účinkem chemoterapie (41). Dlouhodobá stimulace antigeny nádorových buněk, v tomto případě interakce receptoru PD-1 se svými ligandy, tedy způsobuje chronickou aktivaci signální dráhy PD-1 PD-1L/2L, což inhibuje fyziologickou aktivitu efektorových T-lymfocytů formou výše popsaných defektů buněčné diferenciace a cytotoxicity. Mechanismy inhibice imunokompetentních lymfocytových subpopulací, která cestou dráhy programované buněčné smrti během nádorového růstu nastává, zásadním způsobem ovlivňuje možnosti protinádorové imunity hostitele, spolu s dalšími faktory vede k imunitní toleranci nádorové tkáně a v konečném důsledku je spojena s horší terapeutickou odpovědí (42). Geny obou ligandů (PD-L1 a PD-L2) jsou umístěny v oblasti 9p24.1, tedy pod vlivem Janusovy kinázy 2 (JAK2). Experimenty na buněčných liniích Hodgkinova lymfomu a primárně mediastinálního velkobuněčného B-lymfomu prokázaly navýšení transkripce PD-L1 vlivem amplifikace JAK2 (43). Receptor PD-1 i jeho ligandy jsou vzhledem ke svému umístění na povrchu buňky ideálním cílem pro analýzu metodami průtokové cytometrie, přičemž vhodné protilátky jsou již dostupné ve formě konjugátů i pro mnohobarevná stanovení (44). Dráha programované buněčné smrti významně ovlivňuje možnosti protinádorové imunity a je schopna zásadním způsobem redukovat míru cytotoxického působení jak CD8⁺ T-lymfocytů, tak i NK buněk. Tato schopnost manipulovat výkonnou složkou adaptivní imunity poskytuje maligní populaci významnou konkurenční výhodu a interakce receptoru PD-1 se svými ligandy je proto oprávněně v centru zájmu mnoha výzkumných skupin, neboť lze předpokládat, že blokáda dráhy programované buněčné smrti například terapeutickou monoklonální protilátkou umožní obnovení funkce hostitelské protinádorové imunity.

MHC a „ukrytí“ leukemických buněk před imunitní odpovědí

Další modalitou ovlivnění imunitní odpovědi je snížení exprese proteinů hlavního histokompatibilního komplexu II. třídy (MHC II) na antigen prezentujících buňkách CD4 T-lymfocytům. Touto cestou dochází k nižší úrovni exprese HLA (Human Leukocyte Antigen) antigenů, ke snížení imunogenity nádorových buněk a tím k jejich „ukrytí“ před imunitní odpovědí ve formě cytotoxického působení T-lymfocytů (45). Geny pro MHC II. třídy jsou většinově umístěny v oblasti 6p12 a jsou konstitutivně exprimovány na antigen prezentujících buňkách (B-lymfocyty, dendritické buňky, monocyty), s možností indukovatelné exprese na dalších typech leukocytů. Snížení exprese genů MHC II. třídy u nemocných s difuzním velkobuněčným B-lymfomem (DLBCL) výrazně koreluje s kratším přežíváním (46). Z recentních výzkumů vyplývá, že podkladem nižší exprese těchto genů je snížení jejich transkripce, která je řízena expresí transkripčních aktivátorů kódovaných genem transkripčního aktivátoru pro MHC II. třídy (CIITA; class II, Major Histocompatibility Complex, Transactivator) respektive jeho mutovaných forem (47, 48). Lze se oprávněně domnívat, že analogický mechanismus regulace transkripce se uplatňuje i u CLL a dalších hematologických malignit (49). Na snížení imunitního dozoru nad nádorovými buňkami má dále vliv míra exprese genů Janusovy kinázy (JAK2). Amplifikace oblasti 9p24, tedy postihující gen JAK2, vede k jeho hyperexpresi a tím ke konstitutivní aktivaci JAK2, což má za následek nekontrolovanou buněčnou proliferaci a dále amplifikaci genů PD-L1 a PD-L2, tedy genů přímo ovlivňujících cytotoxickou imunitní odpověď organismu (43).

Biologické podklady regulace imunitní odpovědi u CLL

Společným jmenovatelem všech výše uvedených cest alterace imunitní odpovědi jsou primární genetické změny, předcházející nebo souběžné s růstem nádoru, zejména amplifikace genu Janusovy kinázy a pravděpodobně i zásah do mechanismů transkripčního aktivace genu pro MHC II. třídy (49), což vede k vyšší aktivitě dráhy programované buněčné smrti a tím k indukci imunoregulačních Treg, k navýšení proliferační aktivity nádorových buněk a k nižší expresi HLA (43). Nádorové buňky pak unikají imunitnímu systému především použitím „stealth mode“, tedy snížením imunogenity prostřednictvím nižší exprese HLA (23) a cestou aktivace dráhy PD-1/PD-L1 spojené s alterací funkce efektorových CD8⁺ T-lymfocytů, čímž dochází k navození imunologické tolerance (24). Dále se uplatňuje vliv nádorové tkáně zvyšující aktivitu CD4⁺ Treg, vykazujících tlumivý efekt na cytotoxické efektorové buňky, potlačení procesů apoptózy a ovlivnění mikroprostředí nádoru cestou protumorových cytokinů a chemokinů (16, 17, 41). Vyčerpání efektorových T-lymfocytů, indukované chronickou aktivací signální dráhy programované buněčné smrti, vede nejen k navození imunotole-rance nádorových buněk, ale k alteraci T-buněčné imunity jako celku, což je v konečném důsledku patrné ve vyšší incidenci a závažnějším průběhu bakteriálních a virových infekcí (50). Navýšení exprese ligandu PD-1L je prokázáno nejen u hematologických malignit, ale i u mnoha solidních tumorů, kde inhibuje pro-dukci cytokinů i aktivitu tumor infiltrujících CD4⁺ a CD8⁺ T-lymfocytů (51, 52, 53). Blokáda interakce receptoru PD-1 s ligandy (PD-L1 a PD-L2) in vitro zvyšuje úroveň imunitní odpovědi (54) a přímo se podílí na efektivitě protinádorové aktivity imunitního systému (50, 55).

Mimo dráhu programované buněčné smrti se na regulaci T-buněčné odpovědi podílí i další mechanismy, v recentních publikacích je popsán vliv dráhy CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte antigen 4), která ovlivňuje proliferaci a přežívání buněk CLL cestou downregulace T-lymfocytové odpovědi, konkretně cestou ovlivnění exprese transkripčních (STAT1, NFATC2), proliferačních (c-Fos, c-Myc) a antiapoptotických (Bcl-2) faktorů (56).

Blokáda CTLA4 terapeutickými monoklonálními protilátkami je v současné době předmětem klinických studií zejména u solidních tumorů, a to se slibnými výsledky. Zajímavý je synergní protinádorový efekt souběžné blokády dráhy PD-1 a CTLA4, což demonstruje možnosti komplexního terapeutického ovlivnění imunitní odpovědi v budoucnu (57).

Od experimentů do praxe

V současné době již poměrně komplexní poznání mechanismů, dovolujících maligním buňkám unikat protinádorové odpovědi, logicky vede k vývoji nových terapeutických postupů a rutinně aplikovatelných diagnostických metod. Snahy o terapeutické ovlivnění T-regulačních lymfocytů jsou prozatím většinou ve stavu primárního výzkumu, zejména pro ne zcela vyjasněnou a velmi komplikovanou a provázanou síť působení mezi buňkami. Terapeutická modulace exprese proteinů hlavního histokompatibilního komplexu II. třídy (MHC II) by pravděpodobně vyžadovala individualizované zásahy na úrovni genomu, resp. epigenomu, což je v současné době rutinně nezvládnutelné. Velmi vhodným cílem se však ukazuje být dráha programované buněčné smrti, a to jednak pro jednoduchost interakce (jeden receptor a jeden, resp. dva, ligandy) a dále pro lokalizaci cílových struktur na povrchu buněk. Tyto skutečnosti v současné době vedou k testování terapeutické monoklonální protilátky anti-PD-1 u solidních tumorů (58) i hematologických malignit (37, 59).

Průtoková cytometrie hraje klíčovou roli jak v diferenciální diagnostice CLL, tak ve stanovení imunitní odpovědi, v případě analýz T-lymfocytových subpopulací jsou její metody zlatým standardem a jsou rutinně využívány. Diferenciálně diagnostické analýzy a sledování minimální zbytkové nemoci prodělávají v současné době přerod směrem k využití mnohobarevných panelů protilátek dle výstupů konsorcia Euroflow (60).

Unifikace laboratorního procesu včetně použitých identických sestav monoklonálních protilátek, analytického software a kalibrátorů umožňuje nejen eliminovat nepřesnosti, ale i dříve nedosažitelné druhé čtení čí konzultaci expertním pracovištěm. Na našem pracovišti již s úspěchem používáme vlastní mnohobarevný analytický protokol založený na analýze povrchových markerů CD45, CD3, CD4, CD8, CD16+CD56, CD279 (PD-1) a CD107a, zpracovaných metodikou „lyse no-wash“ z periferní krve. Za účelem detekce T-regulačních lymfocytů jsme nejprve testovali povrchovou analýzu znaku CD127, který inverzně koreluje s expresí FoxP3 na Treg (27), ale později jsme z důvodu snazší standardizace přešli na detekci intracytoplazmatických FoxP3 (markery FoxP3, CD4, CD25) pomocí komerčně dostupného kitu.

Do praktického použití se dále dostávají metody i kvantitativní průtokové cytometrie (61), které jsou na základě analýzy vazebných míst schopny poskytnout informace o reálném zastoupení cílových struktur na zájmových buňkách, což s sebou přináší nový pohled zejména na hodnocení účinnosti terapeutických monoklonálních protilátek (62).

Pokročilé analýzy subpopulací T-regulačních lymfocytů včetně jejich dynamiky a výzkum dráhy programované buněčné smrti jsou zatím doménou spíše vědecko-výzkumných pracovišť, nicméně v blízké době můžeme čekat jejich přesun do rutinní praxe.

Týká se to zejména metod detekce a kvantifikace exprese receptoru PD-1, které v případě úspěšných testů terapeutické monoklonální protilátky budou nezbytné pro přesnou indikaci terapie a sledování odpovědi na léčbu. Zásadní úlohu průtokové cytometrie lze s jistotou očekávat u indikace a monitorování terapie na bázi virovou transdukcí modifikovaných T-lymfocytů, exprimujících chimérické receptory antigenů (Chimeric antigen receptors, CARs), slibné nové terapeutické modality s kurativním potenciálem, která je v současné době ve stadiu klinických testů (63).

Zavádění osmi- a vícebarevných cytometrů, rozšiřující se spektrum fluorochromů a nové analytické metody, zejména možnost kvantifikovat expresi cílových struktur, umožňuje analyzovat širší souvislosti mezi jednotlivými imunokompetentními populacemi a maligními buňkami, posoudit jejich role v procesu regulace protinádorové odpovědi a poskytuje tak nový vhled do interakcí mezi maligními buňkami a hostitelským organismem směrem k úspěšné terapii (64, 65, 66).

Poděkování

Podpořeno grantem IGA-LF-2014-001RNDr.

Podíl autorů na přípravě rukopisu

Martin Novák: sepsání rukopisu

MUDr. Vít Procházka, Ph.D.: připomínkování a korektura rukopisu

Doručeno do redakce: 15. dubna 2014

Přijato po recenzích: 23. června 2014

RNDr. Martin Novák

Laboratoř průtokové cytometrie

Hematoonkologická klinika FN/LF Olomouc

I. P. Pavlova 6

775 20 Olomouc

e-mail: novak.m@email.cz