Vývoj cévní náhrady pro nízké průtoky – přehled

Souhrn

Vývoj cévní náhrady pro nízké průtoky je aktuální otázkou. Autoři představují vlastní model hledání vývoje náhrady optimálních vlastností, které vycházejí z myšlenky převzetí charakteristiky biologického modelu – veny sapheny, a naprogramování těchto vlastností do modelu konstruované náhrady. Představovaná cévní náhrada se skládá ze tří částí – nevstřebatelného scaffoldu představujícího medii a dvou vstřebatelných kolagenních vrstev – pseudointimy a pseudoadventicie. Autoři představují základní metody fyzikálního testování (inflačně-extenzní test), stejně jako další postupy, které ovlivňují konečné vlastnosti vyvíjené protézy. Mezi takové patří tvrzení kolagenu, antitrombogenní ošetření vnitřního povrchu cévní náhrady a použití metody sterilizace. Testovaný prototyp byl úspěšně ověřen implantací na ovčím modelu.

Klíčová slova:

cévní náhrada pro nízké průtoky – fyzikální testování

ÚVOD

Jedním z pilířů rekonstrukční cévní chirurgie jsou cévní náhrady. Snaha o jejich nalezení se datuje již do druhé poloviny devatenáctého století. Za zásadní příspěvek v této oblasti (cévní steh) byl Carrel v roce 1912 oceněn Nobelovou cenou [1]. První pokusy s cévní rekonstrukcí byly vynuceny válečnými zraněními, ale po skončení druhé světové války se již rekonstrukční cévní chirurgie začala rozvíjet jako samostatný obor. Jako první náhrady se začaly používat tepenné alotransplantáty a nejčastější indikací výkonu byly výdutě, zejména na břišní aortě. Poměrně brzy se však začaly objevovat problémy v důsledku imunologicky vyvolaných změn – rejekce, s uzávěrem nebo fatální rupturou. V roce 1952 publikoval Kunlin [2] úspěch při použití vlastní žíly nemocného (vena saphena magna) k tepenné rekonstrukci. Dodnes zůstává žilní autotransplantát jednou z nejlepších náhrad. Jeho využití je však limitováno kvalitou a dostupností u řady nemocných. Celou tuto dobu přetrvávala snaha vytvořit umělou cévní náhradu, což se podařilo v roce 1954, kdy Voorhes a spol. publikovali zkušenosti s porézní cévní náhradou vytvořenou textilním způsobem ze syntetických vláken [3]. Tento základní průlom byl následován dynamickým vývojem a konstrukcí škály cévních protéz z různých materiálů, různých charakteristik a rozměrů, takže je bylo možno použít téměř ve všech anatomických oblastech tepenného systému.

Obecnou nevýhodou cévních protéz je nízká průchodnost v případě nízkého průtoku rekonstrukce, limitem jsou průtoky nižší než 100–200 ml/min. Druhou zásadní nevýhodou je citlivost polyesterového vlákna vůči infekci. Na základě dlouhodobých zkušeností s cévními náhradami vycházejí autoři z představy, že klíčovou charakteristikou pro úspěch žilního autotransplantátu v tepenných oblastech s nízkým průtokem jsou její fyzikální vlastnosti, které umožňují dokonalé technické provedení anastomóz a též umožňují náhradě přizpůsobit se průtokovým a tlakovým poměrům v rekonstruovaném tepenném úseku [4–8]. Přibližování vlastností syntetických cévních náhrad biologickým autologním materiálům je tedy jednou z možných cest vývoje

Vlastní koncepce cévní náhrady

Cévní náhrada je konstruována jako kompozitní poddajná trubice s třívrstvou sendvičově uspořádanou stěnou – sestávající z prostřední nevstřebatelné porézní vrstvy – tzv. scaffold – a dvou vstřebatelných vrstev z biologického materiálu – zevní a vnitřní, tzv. pseudointima a pseudoadventicie [9]. Jako mechanicky základní vrstva scaffoldu je použita monofilová polyesterová nevrapovaná pletenina s porozitou vyšší než 10 000 ml/min/cm²/120 mmHg [10]. Tato vrstva by měla zaručit limitní roztažnost (dilataci) alternativní protézy. Síla vláken i charakter pletení jsou voleny tak, aby nevstřebatelná složka nebránila klasické perfuzi živin z lumina až do zevní vrstvy, která při dostatečné vaskularizaci odvádí produkty metabolismu. Jinak řečeno, vlákna nevytvářejí tzv. perfuzní stíny. Pro vstřebatelné vrstvy, pseudointimu a pseudoadventicii, přicházejí z biopolymerů v úvahu kolagen, želatina, elastin, rekombinantní tropoelastin, polylysin, chitosan, celulóza a její deriváty, hyaluran a jeho deriváty [11−13].

Metody

Výroba nosného scaffoldu protézy

Pro výrobu scaffoldu bylo použito monofilní polyesterové vlákno o průměru 0,034 mm. Toto vlákno bylo v pletacím stroji sdružováno do svazků po 2 a byla z něj vytvořena pleteninová trubice. Než se dospělo k finální konstrukci pleteniny, bylo testováno několik variant. Ty se lišily počtem sdružovaných monofilních polyesterových vláken a hustotou, tím i velikostí ok pleteniny. Před integrací pleteninového scaffoldu do kolagenní hmoty, byla pletenina ještě chemicky ošetřena praním a předsrážením. Pletenina jako scaffold byla zvolena pro své mechanické vlastnosti. Pleteninová trubice se dokáže vhodně deformovat v obvodovém i podélném směru. Tím by měla být umožněna dobrá poddajnost alternativní cévní protézy zejména v obvodovém směru. To je mimo jiné důležité pro přenos pulzací v krevním systému a propagaci pulzní vlny. Vzhledem k dobrým mechanickým vlastnostem a biokompatibilitě je polyester využíván jak v chirurgii, tak v tkáňovém inženýrství.

Pseudointima a pseudoadventicie – kolagenní vrstvy

Na základě podrobné analýzy vlastností byl vybrán bovinní a rybí kolagen vyrobený za kontrolovaných podmínek. Kolagen je typická vláknitá bílkovina, která je spolu s retikulinem hlavní součástí fibrilárních struktur vaziva, kůže, kostí a podpůrného skeletu všech orgánů a tkání. Antigenní vlastnosti nativního kolagenu jako heterologní bílkoviny vyvolávají vazbu komplementu, aglutinaci, anafylaxi a další reakce. Kolagenní hmota byla při výrobě protéz vystavena tvrzení, v tomto případě pomocí chemických činidel vytvářejících přídavné příčné vazby na molekulární úrovní struktury kolagenu typu I. Tato materiálová úprava je klíčová pro ovlivnění vlastní kolagenu, zejména bobtnavosti, stupně denaturace a doby vstřebávání. V této oblasti je zcela zásadní spolehlivá kontrola stupně vytvrzení [14,15]. Stupeň vytvrzení se hodnotí podle takzvané teploty smrštění (Ts) nebo též denaturační teploty. Vlákna netvrzeného kolagenu se při stoupající teplotě, mezi 30 až 40 °C, smrští. Dochází také k denaturaci a změně fyzikálních vlastností hmoty, např. poklesu mechanických vlastností. Úměrně se stupněm vytvrzení stoupá i teplota, při které ke smrštění dochází. Bylo jednoznačně prokázáno, že antigenicita nativního kolagenu klesá úměrně se stupněm vytvrzení (hodnoceno podle Ts) až k bezvýznamným hodnotám. Podobný trend byl pozorován u trombogenicity. Je však nezbytné uváděné výhodné faktory korelovat s mechanickými vlastnostmi a hledat optimální konfiguraci úpravy kolagenní hmoty.

Testování fyzikálních vlastností biologických cévních náhrad

Inflačně-extenzní test je vhodnou metodou k testování fyzikálních vlastností cévních náhrad. Jedná se o cyklické zatěžování tubulárního vzorku vnitřním tlakem, kdy jsou pozorovány deformace vzorku v obvodovém a podélném směru. Sledováno je i torzní chování vzorku. Všechny deformace jsou ve vazbě s monitorovaným interním tlakem ve vzorku a s rychlostí cyklického zatěžování simulující různé tepové frekvence. Princip je blíže vysvětlen na Schema 1. Test začíná upnutím vzorku mezi dva trny. Horní trn je spojen s dávkovačem kapaliny, který je kotven na lineární elektrické motory, jejichž pohyb je řízen měřicím počítačem. Deformace vzorku během zatěžování vnitřním tlakem je sledována pomocí dvou na sebe kolmo ustavených kamer. Následně je ze získaného experimentu zpracován graf závislosti napětí - deformace nebo tlak – deformace.

Testování kompozitních celků

Dalším krokem ve vývoji cévní náhrady je mechanický test náhrady jako kompozitního celku v různých sendvičových uspořádáních (Schema 2 vlevo). Rozdílná uspořádání vrstev cévní náhrady se promítají do různých vlastností, které tímto uspořádáním náhrada dostává. Z provedených měření vzešla doporučená struktura cévní náhrady, která je na Schematu 2 označená jako E20. Takto utvořená náhrada se svými fyzikálními vlastnostmi nejvíce přibližuje nativní saféně. Jde o uspořádání stěny trubice, kdy je kolagenní trubice uvnitř síťky. Na náhradě byla vytvořena i vnější kolagenní vrstva – pseudoadventicie, aby byl scaffold překryt kolagenní hmotou. Pro lepší přiblížení mechanické odezvy cévní náhrady humánní žíle [16] bylo nutno zmenšit tloušťku stěny náhrady, která se u testovaných vzorků pohybovala kolem 0,45 mm, a to zhruba cca o 50 %, tj. na hodnotu 0,2 až 0,3 mm. Důvodem je, aby závislost deformace na tlaku byla méně strmá a posunula se v grafu směrem doprava, tj. do oblastí větších obvodových deformací při stejném zatížení vnitřním tlakem. Provedená redukce tloušťky stěny vedla ke zmiňovanému efektu posuvu deformačních charakteristik cévní náhrady do oblastí větších deformací, jak je patrné na Schematu 2 [17].

Antitrombogenní ošetření vnitřního povrchu cévní náhrady

Lokální aplikace antitrombotických látek může zpomalovat počáteční nekontrolované ukládání fibrinu na vnitřní stěnu cévních náhrad, které u cév s malým průtokem může vést až k jejich uzávěru. Také postupné uvolňování heparinu do krevního řečiště může významně prodloužit životnost cévních náhrad. V průběhu roku 2014 byly autory vyvinuty antitrombotické biomateriály s postupným uvolňováním heparinu a/nebo streptokinázy [18]. Obě tyto látky jsou již široce využívány v klinické praxi [19]. V posledních letech je věnována zvýšená pozornost možnosti využití jiného antitrombotického činidla, oxidu dusnatého (NO). Přirozená endoteliální výstelka cév uvolňuje NO, který inhibuje aktivaci krevních destiček a polymorfonukleárních leukocytů, brání tak jejich agregaci a působí preventivně proti cévní trombóze. Kromě antitrombotických účinků má NO celou řadu dalších důležitých fyziologických funkcí [22]. Další účinnou látkou je např. dipiridamol, který inhibuje vychytávání adenosinu v erytrocytech, krevních destičkách a endoteliálních buňkách za podmínek in vivo i in vitro. Inhibice dosahuje v maximu přibližně 80 % a její intenzita je při terapeutických koncentracích (0,5−2,0 μg/ml) závislá na podané dávce [18]. Snížení agregace krevních destiček snižuje jejich konzumpci k normálním hodnotám. Navíc má adenosin vazodilatační účinky, což je jeden z mechanismů, kterým dipyridamol vyvolává vazodilataci.

Výsledky

Experimentální ověření

Uvedené poznatky získané během experimentální práce vedly k vytvoření kompozitní třívrstvé cévní náhrady. Prostřednictvím technologie výroby extruze homogenizované kolagenní hmoty, se podařilo změnou uspořádání orientace kolagenních vláken a jejich svazku, vytvořit anizotropní materiál s nelineární mechanickou odezvou při zatěžování. To je další krok přibližující alternativní cévní náhradu nativním cévám. Dalším krokem bylo její experimentální ověření na ovčím modelu [9]. Při implantaci graftu jako náhrady ovčí karotidy (bypass s anastomózami end-to-side nebo náhrada s anastomózami end-to-end) u 7 ovcí a peroperačním omezením průtoku zaškrcením výtokového traktu (s průtoky cca 150 ml/min.) bylo při půlročním přežití ovcí dosaženo velmi dobré průchodnosti (6 průchodných, 1 uzavřená) [9].

Vliv sterilizace na mechanickou odezvu cévní náhrady

Ukázalo se, že typ sterilizace má na mechanické chování náhrady značný vliv [26−28]. Při sterilizaci vznikají ve vnitřní struktuře kolagenní hmoty přídavné vazby, tzv. crosslinky, jak názorně dokumentuje Schema 3. Ukázalo se, že tyto přídatné vazby ve struktuře kolagenu mají na jeho výsledné fyzikální vlastnosti významný vliv. Je tedy podstatné, jakým způsobem sterilizujeme cévní náhradu, v jejíž struktuře je obsažen kolagen. Tato skutečnost může vést nejen ke změně vlastností ve smyslu obvodové a axiální deformace (Schema 3), ale i k vyšší náchylnosti cévní náhrady k trombóze.

Diskuze

Mezi základní požadavky na cévní náhrady patří biokompatibilita, vhodné mechanické vlastnosti – dostatečná pevnost a viskoeleastické nebo hyperelastické vlastnosti podobné jako u nativní cévy a schopnost adaptace na měnící se podmínky krevního průtoku. Dalším nezbytným požadavkem je nízká trombogenicita vnitřního povrchu cévních náhrad [29]. Nejnáročnější požadavky jsou na cévní náhrady s malým průtokem a malým průměrem, které jsou velmi náchylné k trombóze. V současné době nejsou na trhu skutečně spolehlivé syntetické cévní náhrady určené pro nízké průtoky.

Chan-Park et al. popisují postupy tkáňového inženýrství vedoucí k požadovaným vlastnostem cévních náhrad [30]. Diskutují zde i požadavky na biodegradovatelné materiály. Cévní náhrady s malým průtokem jsou vyžadovány zejména pro pacienty s potřebou náhrady koronárních a podkolenních cév – tzv. distálních bypassů. Současné možnosti zahrnují použití autologních cév a syntetických náhrad [31,32]. Požadovanými mechanickými vlastnostmi infrainguinálních bypassů se zabývali Sarkara et al. [33]. Ideální biomateriál pro tuto oblast tkáňového inženýrství by se měl mechanickými vlastnostmi blížit nativním cévám, ale také podporovat buněčný růst, podporovat produkci extracelulární matrix a inhibovat trombogenicitu [12,23]. Kaibara et al. popsali metodu in vitro hodnocení trombogenicity biomateriálů [23]. Rovněž z těchto požadavků vycházejí autoři při hledání adekvátních vlastností cévní náhrady.

V případě použití biologického materiálu pro konstrukci cévní protézy pro nízké průtoky – tedy například kolagenu – je třeba zohlednit, že výrobou proces vytváření fyzikálních vlastností náhrady nekončí a vliv sterilizace na tuhost náhrady může být zásadní [34]. Typ použitého kolagenu je otázkou dalších experimentů s výhledem využití rybího kolagenu s předpokladem nižší antigenicity, ve srovnání s nejčastěji používaným kolagenem bovinním.

Závěr

Souhrnem lze říci, že vyvíjenou cévní protézu lze jako kompozitní trubici „naprogramovat“ následujícími kroky: 1) volbou vhodné geometrie scaffoldu (velikost ok síťoviny a tloušťka vlákna), 2) vhodně zvoleným sendvičovým uspořádáním kompozitní trubice (pozice scaffoldu vůči matrici), 3) technologií výroby kolagenních vrstev náhrady, kdy může dojít k plánované řízené změně uspořádaní vnitřní struktury materiálu, např. extruzí, s dopadem na fyzikální vlastnosti, 4) dobou tvrzení kolagenní hmoty matrice náhrady (vznik přídavných vazeb mezi kolagenními vlákny – crosslink), 5) vhodným ošetřením vnitřního povrchu cévní náhrady ve smyslu nízké trombogenicity a 6) volbou typu sterilizace hotové cévní protézy (vznik dalších přídavných vazeb mezi kolagenními vlákny). Experimentálně získaná data a ověření modelu cévní náhrady na zvířecím modelu dává naději na budoucí použití v klinické praxi [9,17].

Práce je věnována památce doc. MUDr. Milana Krajíčka, DrSc.

Poděkování: Práce vznikla s podporou grantu MZ ČR AZV 15-27941A, projektu Specifického vysokoškolského výzkumu 2019 – 260 372 a projektu PROGRES Q38/LF1.

Konflikt zájmů

Autoři článku prohlašují, že nejsou v souvislosti se vznikem tohoto článku ve střetu zájmů a že tento článek nebyl publikován v žádném jiném časopise.

MUDr. Miroslav Špaček, Ph.D.

II. chirurgická klinika kardiovaskulární chirurgie,

VFN a 1. LF UK Praha

U Nemocnice 2

128 08 Praha 2

e-mail: miroslav.spacek@vfn.cz