Vliv ultrazvuku na účinnost fotodynamické terapie – in vitro studie

Souhrn

Fotodynamická terapie (PDT) patří k perspektivním metodám léčby nádorů. Je založená na selektivní akumulaci fotosensitizeru v nádorové tkáni a následném ozáření světlem určité vlnové délky. PDT je díky vysoké specifitě a selektivitě a faktu, že nevyvolává nežádoucí vedlejší účinky, v současnosti široce rozvíjena. Sonodynamická terapie (SDT) využívá k vyvolání cytotoxického efektu sensitizeru ultrazvuk. V naší práci jsme ověřovali, zda je možné tyto metody kombinovat a zvýšit tak jejich účinek. Z výsledků vyplývá, že ozáření v kombinaci s aplikací terapeutického ultrazvuku zvyšuje oproti samotnému ozáření ZnTPPS₄ produkci reaktivních forem kyslíku a snižuje životnost nádorových buněk MCF7, zvláště v případě vyšších terapeutických dávek. Kombinace PDT a SDT může do budoucna přinést nové možnosti léčby nádorových, ale také nenádorových onemocnění.

Klíčová slova:
fotosensitizer, fotodynamická terapie, sonodynamická terapie, derivát porfyrinu

Úvod

Fotodynamická terapie (PDT) je jednou z metod minimálně invazivního způsobu léčby celé řady nádorů i některých nenádorových onemocnění a v současné době se stále více rozvíjí. PDT kombinuje tři faktory - kyslík, viditelné záření a fotosensitizer, který se akumuluje přednostně v nádorové tkáni. Tyto komponenty jsou samy o sobě neškodné, ale společně mohou mít letální efekt a tak vyhubit nádorové buňky [1]. Po ozáření světlem určité vlnové délky je molekula fotosensitizeru excitována a dochází k přenosu energie na substráty v buňce (fotochemická reakce typu I), což vede k tvorbě volných radikálů a radikálových produktů (peroxidy, superoxidové ionty a hydroxylové radikály), které spouští řetězové radikálové reakce. Nebo energie excitovaného fotosensitizeru přechází přímo na molekulu kyslíku (fotochemická reakce typu II), čímž vznikne singletní kyslík (¹O₂), který poté oxiduje další molekuly v buňce. Výsledné poškození organel nádorových buněk vede k zániku nádoru. Buňky nádoru mohou umírat apoptózou nebo nekrózou [2–5]. Hlavními výhodami PDT oproti radioterapii a chemoterapii je vyšší selektivita při destrukci nádorové tkáně, možnost opakované aplikace a fakt, že PDT nezpůsobuje těžké lokální ani systémové komplikace. Další výhodou fotodynamických reakcí je možnost využít jejich principu jak k léčbě, tak k fluorescenční diagnostice nádoru [4].

Sonodynamická terapie (SDT) využívá k aktivaci senzitivní látky v patologických tkáních ultrazvuk. Doposud není objasněn mechanismus účinku SDT, výzkumy však naznačují, že SDT vyvolává tzv. vnitřní kavitaci, což je proces, kdy se vzduchová bublina vyvolaná ultrazvukem v kapalině náhle rozpadne a vyvolá šokovou vlnu doprovázenou silným uvolněním tepelné energie. Okolní molekuly vody se přitom rozloží na *H a *OH radikály, které spolu s následně vzniklými radikálovými produkty opět spouští řetězové radikálové reakce a poškozují molekuly buňky. Kromě kavitace může SDT způsobovat také změnu rozmístění sensitizeru v buňce a přeměnu agregovaných molekul sensitizeru na stabilnější monomerní formu, která má silnější cytotoxický účinek. Ultrazvuk může rovněž destabilizovat buněčnou membránu, díky čemuž se buňka stane citlivější a zvýší se transport léčiva přes buněčnou membránu. Tato metoda má oproti jiným fyzikálním způsobům léčby výhodu opět především v selektivitě, protože ultrazvuk je možné zaměřit na malou cílovou oblast. Výhodou oproti PDT je fakt, že ultrazvuk může pronikat hlouběji do tkáně [6–10].

Protože se v literatuře objevily náznaky, že některé fotosensitizery lze aktivovat jak fotochemicky, tak sonochemicky [11–18], zajímalo nás, jak a zda je možné zmíněné terapie kombinovat a tak zvýšit jejich účinnost. Hodnotili jsme tedy podpůrný vliv ultrazvuku na PDT s fotosensitizerem na bázi porfyrinu ZnTPPS₄ na nádorovou buněčnou linii MCF7 v podmínkách in vitro. Účinek in vitro terapie jsme zkoumali pomocí detekce tvorby reaktivních forem kyslíku (ROS) a testem buněčné viability (MTT test).

Materiál a metody

Příprava buněčné kultury

Použili jsme buněčnou linii MCF7 (odvozená od lidského karcinomu prsu). Buňky byly kultivovány v médiu DMEM (10% fetálního bovinního séra, 2% 200 mM L-glutaminu, 0,4% penicilinu/streptomycinu, Sigma) ve sterilních Petriho miskách (TPP, 35 mm), (300 000 buněk/misku) v atmosféře 5% CO₂ při 37°C.

Fotodynamická a sonodynamická terapie

Do kultivačního média DMEM byl přidán fotosentitizer ZnTPPS₄ [zinečnatý komplex meso-tetrakis(4-sulfonatofenyl)porfyrinu] v koncentracích 0 (kontrola); 1; 2,5; 5 a 10 μmol/l. Po 24 h inkubace ve tmě (5% CO₂, 37°C) byly buňky opláchnuty PBS a trypsinizovány 0,5% trypsinem (Sigma-Aldrich). Průběh trypsinnizace byl sledován na inverzním optickém mikroskopu Olympus IX81 s DSU jednotkou (Olympus). Po uvolnění buněk ze dna byla trypsinizace zastavena čerstvým médiem DMEM s 10% FBS a suspenze byla přenesena do 2ml zkumavek eppedorf (P-LAB). Suspenze byla centrifugována při 1250 rpm 5 minut centrifuga HERMLE Z 300 K) a pelet buněk byl resuspendován v 5μM roztoku 5-(and 6-)-chloromethyl-2´,7´-dichlorodihydrofluorescein diacetátu (CM-H2DCFDA), (Invitrogen). Po 30 min inkubace ve tmě byla polovina vzorků vystavena na 5 min působení terapeutického ultrazvuku (BTL-4000, BTL Industries) o frekvenci 1 MHz a intenzitě 2 W/cm². Buněčná suspenze všech vzorků byla následně rozpipetována na 96ti jamkovou kultivační destičku (TPP) a ozářena LED diodami s vlnovou délkou 414 nm, FWHM 20 nm o celkové dávce 0 (kontrola); 10 a 25 J/cm².

Detekce reaktivních forem kyslíku (ROS)

Ihned po ozáření byla měřena fluorescence 5-(-6)-chloromethyl- 2’,7’-dichlorofluoresceinu (CM-DCF), (excitace/emise: 485/540 nm) na readeru Synergy HT (BioTek). Poté byl přebytek sondy vymyt PBS, nahrazen čerstvým médiem DMEM a buňky byly inkubovány dalších 24 h (5% CO₂, 37°C).

Test viability (MTT test)

Médium DMEM bylo nahrazeno 2mM roztokem 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromidu (MTT), (Sigma-Aldrich) v PBS. Buňky byly v roztoku MTT inkubovány 3,5 h (5% CO₂, 37°C). Poté byl roztok MTT odstraněn a krystalky formazánu rozpuštěny v DMSO. Absorbance formazánu byla měřena na readeru Synergy HT při 570 nm (absorbance formazánu) a 690 nm (absorbance destičky - pozadí). Odečtené hodnoty absorbance byly zpracovány v programu PHOTOTOX a byly zjištěny hodnoty IC₅₀ pro neozvučované a ozvučované vzorky.

Statistické zpracování dat

Ke statistickému zpracování dat byl použit software SPSS verze 15 (SPSS Inc. Chicago, USA). Nejprve se testy normality Shapiro-Wilk zjišťovalo, zda mají data normální rozdělení. Pokud bylo prokázáno, že mají normální rozložení, skupiny byly dále porovnány dvouvýběrovým t-testem. U skupin, kde se neprokázalo normální rozdělení dat, byly na následné porovnání použity neparametrické Mann-Whitney U-testy.

Výsledky

Detekce reaktivních forem kyslíku (ROS)

Jak je patrné z výsledných grafů, množství vzniklých ROS závisí zejména na celkové dávce ozáření, méně pak na koncentraci fotosensitizeru. Při terapii bez ozáření (viz Graf 1) byly hodnoty ROS podle očekávání minimální a rozdíly mezi ozvučenými a neozvučenými vzorky nebyly patrné. Při statistickém hodnocení (viz Tab. 1) sice vyšlo v případě 10 μM ZnTPPS₄, že aplikace ultrazvuku hodnoty ROS statisticky významně zvýšila (p = 0,004), vzhledem k vysokým hodnotám ROS u ozařovaných vzorků je to ovšem zanedbatelné. Při terapii s dávkou ozáření 10 J/cm² (viz Graf 2) aplikace ultrazvuku zvýšila produkci ROS při vyšších koncentracích ZnTPPS₄ (5 a 10 μmol/l), jako statisticky významné (viz Tab. 1) bylo ovšem zvýšení pouze u nejvyšší koncentrace 10 μmol/l (p = 0,0001). V případě koncentrací 0 a 5 μmol/l je ale patrný statistický trend směrem ke zvýšení hodnot při aplikaci ultrazvuku, protože hodnoty signifikance byly těsně nad hladinou významnosti (p = 0,088). Při terapii s dávkou ozáření 25 J/cm² (viz Graf 3) byly hodnoty ROS podle očekávání nejvyšší a je patrné, že použití ultrazvuku produkci ROS ještě zvyšovalo a to při všech aplikovaných koncentracích ZnTPPS₄. Jako statisticky významné (viz Tab. 1) bylo ovšem zvýšení v případě 0μM ZnTPPS₄ (p = 0,0001), 2,5μM ZnTPPS₄ (p = 0,029) a 5μM ZnTPPS₄ (p = 0,015).

Test viability (MTT test)

Na základě předběžných experimentů pomocí testu viability MTT v širší škále koncentrací ZnTPPS₄ (data nezobrazena) byly vybrány pro každou dávku ozáření vždy tři koncentrace (a kontrola) tak, aby ta prostřední vyvolávala přibližně 50% úmrtnost buněk (pro 10 J/cm² je to 5 μmol/l ZnTPPS₄, pro 25 J/cm² je to 2,5 μmol/l ZnTPPS₄).

Při terapii bez ozáření životnost buněk podle očekávání neklesla pod 50 % při žádné aplikované koncentraci fotosensitizeru, ať už bez nebo s použitím ultrazvuku (viz Tab. 2), hodnotu IC₅₀ tedy nebylo možno určit. Při terapii s dávkou ozáření 10 J/cm² aplikace ultrazvuku snížila hodnotu IC₅₀ v průměru ze 4,972 μmol/l na 3,693 μmol/l, snížení ale nebylo statisticky významné. Při terapii s dávkou ozáření 25 J/cm² aplikace ultrazvuku snížila hodnotu IC₅₀ v průměru z 2,632 μmol/l na 0,995 μmol/l a snížení se prokázalo jako statisticky významné (p = 0,048).

Diskuze

Některé fotosensitizery lze aktivovat jak fotochemicky, tak sonochemicky [11–14, 17, 18]. V této práci jsme testovali na nádorové buněčné linii MCF7 v podmínkách in vitro, zda je možné PDT a SDT kombinovat a tak zvýšit jejich účinnost. Na základě výsledků lze soudit, že kombinace SDT a PDT je účinnější. Aplikace terapeutického ultrazvuku v kombinaci s PDT se ZnTPPS₄ zvyšuje oproti samotné PDT produkci reaktivních forem kyslíku i úmrtnost buněk, což se statisticky prokázalo u vyšších terapeutických dávek (vyšší koncentrace fotosensitizeru, vyšší dávky ozáření).

Tímto tématem se naše skupina již dříve zabývala, když jsme zkoumali tvorbu ROS po PDT v kombinaci s SDT, rovněž na buněčné linii MCF7 [15], ale také na linii G361 (odvozené od lidského melanomu) [16], jako fotosensitizer jsme ovšem používali ftalocyanin ClAlPcS2. Kvůli poněkud odlišnému postupu (vzorky nebyly trypsinizovány, byly ozvučovány v Petriho miskách a ultrazvuk byl aplikován po delší dobu – 10 min) a především jinému typu sensitizeru nelze výsledky příliš srovnávat. Ovšem i při těchto experimentech se prokázalo, že PDT v kombinaci s SDT zvyšuje produkci ROS oproti samotné PDT, na buněčné linii MCF7 však opět pouze při nejvyšších terapeutických dávkách.

Předpokládá se, že SDT vyvolává kavitaci, může také měnit rozmístění fotosensitizeru v buňce, vyvolávat destabilizaci buněčné membrány a přeměnu agregovaných molekul fotosensitizeru na stabilnější monomerní formu se silnějším cytotoxickým účinkem [6–10]. Z výsledků vyplývá, že ultrazvuk působí mimo jiné na samotnou molekulu fotosensitizeru a v případě buněčné linie MCF7 se vliv ultrazvuku u kombinované terapie PDT s SDT nejvíce projevuje při vyšších terapeutických dávkách.

Závěr

Je velmi důležité hledat a rozvíjet nové účinnější způsoby léčby. Fotodynamická a sonodynamická terapie by mohla výhledově doplnit běžně používané terapeutické postupy pro zhoubné nádory jako chirurgické odstranění, radioterapie a chemoterapie. S pomocí PDT bylo dosaženo už celé řady úspěchů a několik fotosensitizerů bylo schváleno pro klinické použití (k léčbě nádorových i některých nenádorových onemocnění). PDT je ale neustále předmětem výzkumu. Hlavní snahou je zvýšit účinnost této metody a rozšířit její použití. V naší práci jsme prokázali, že aplikace terapeutického ultrazvuku může významně zvýšit účinnost PDT v podmínkách in vitro. I když všechny mechanismy kombinovaného efektu SDT a PDT ještě nejsou zcela vysvětleny, věříme, že tato kombinovaná terapie se může do budoucna stát další účinnou léčebnou metodou a je vhodné zabývat se jí dále.

Poděkování

Práce vznikla za podpory výzkumných projektů CZ.1.05/2.1.00/01.0030 a LF_2011_009.

Prof. RNDr. Hana Kolářová, CSc.

Ústav lékařské biofyziky

Lékařská fakulta

Univerzita Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3, 775 15 Olomouc

E-mail: hana.kolarova@upol.cz

tel.: +420 585 632 101