Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

XXX. Základní a aplikovaný výzkum v onkologii

XXX/ 155. From the tumor genome to the targeted therapy

Petak I.

Oncompass Medicine, Budapest, Hungary; KPS Dia­gnosztika Zrt., Budapest, Hungary

Background: Molecular and clinical interpretation of molecular genetic tumor profiles will be more and more important in the clinical routine work of medical oncologists. We aimed to develop a standardized three-step algorithm for the decision support process to predict sensitivity and resistance to targeted therapies based on the highest available evidences, and to develop the best personalized treatment strategy. Patients and Methods: We have analyzed the molecular profile of solid cancer tumors (n = 70) sequenced by next-generation sequencing (NGS) for a panel of 58 cancer-related genes (ABL1, AKT1, ALK, APC, ATM, BRAF, CDH1, CDKN2A, CSF1R, CTNNB1, EGFR, ERBB2, ERBB4, EZH2, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FLT3, GNA11, GNAS, GNAQ, HNF1A, HRAS, IDH1, IDH2, JAK2, JAK3, KDR, KIT, KRAS, MET, MLH1, MPL, NOTCH1, NPM1, NRAS, PDGFRA, PIK3CA, PTEN, PTPN11, RB1, RET, SMAD4, SMARCB1, SMO, SRC, STK11, TP53, VHL, DDR2, CHEK2, PIK3R1, MAP2K1, JAK1, TGFBR2, PDGFRB, IGFR1) and FISH analysis of HER2, ALK, ROS1, c-MET, FGFR, PIK3CA, EGFR. Driver mutations were defined based on their frequency in the COSMIC database, functional data clustered into published preclinical evidence types (e. g. Evidence for exclusivity with other driver genes in the same signal transduction pathway etc.), and clinical evidence types (e. g. Evidence for association with worse prognosis etc.). Driver-Target associations were evaluated base on specific evidence types (decreased or increased sensitivity to specific inhibitors in case of certain drivers). Target-Drug associations were established based on preclinical and clinical evidences related to 260 compounds in clinical use or clinical development. Results: We found evidence for positive association between the molecular profile and targeted compound in 80.6%, negative association in 43.5% of cases. As a clinical consequence 20% of cases participated in targeted clinical trials and 10% received molecular profile based targeted therapies. Conclusions: Multi-gene molecular profile analysis and medical information technologies empowers the clinical oncologists in the planning of the best treatment strategy, reduces the unnecessary treatment delays due to multiple unsuccessful screening of low frequency bio­markers one by one in central labs. Better prediction of therapy response can also accelerate the reimbursement of novel targeted therapies.

XXX/ 160. „OMICS“ PŘÍSTUPY VE VYHLEDÁVÁNÍ METASTATICKÝCH BIOMARKERŮ U NÁDORŮ PRSU

Bouchal P.¹, Maryáš J.¹, Dvořáková M.¹, Faktor J.¹, Struhárová I.¹, Bortlíček Z.², Budinská E.³, Vojtěšek B.¹, Nenutil R.⁴

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Institut bio­statistiky a analýz, MU, Brno, ³ Masarykův onkologický ústav, Brno, ⁴ Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno

Východiska: Nádory prsu jsou nejčastějším typem nádoru u žen. Současné dia­gnostické přístupy však stále vykazují nedokonalosti při určení rizika metastazování u subtypu luminal A, kdy malá část pacientek vykazuje v rozporu s teoretickou prognózou časné uzlinové metastázy. V našem projektu se snažíme identifikovat, validovat a charakterizovat specifické proteiny, mechanizmy a metastatické molekulární portréty, které by byly použitelné v identifikaci pacientek s vyšším rizikem metastazování. Materiál a metody: V první fázi projektu jsme se zaměřili na vyhledávání prometastatických cílů v souboru 96 charakterizovaných nádorů prsu zahrnujícího stratifikaci vzorků podle grade, exprese hormonálních receptorů a stavu lymfatických uzlin. Primární proteo­mická studie byla založena na metodice zahrnující štěpení komplexních lyzátů trypsinem, značení peptidů izobarickými značkami (iTRAQ), separaci peptidů dvourozměrnou kapalinovou chromatografií a identifikaci a kvantifikaci proteinů na bázi vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie (iTRAQ-2DLC-MS/ MS). Soubor 95 vybraných genů pak byl profilován na transkriptové úrovni. Statistika zahrnující Spearmanovu korelaci odhalila dva klastry související se stavem lymfatických uzlin u low-grade karcinomů. Sada proteinů, změny, jejichž exprese byly potvrzeny na proteinové i transkriptové úrovni, byla dále validována pomocí imunohistochemie. Výsledky: Kombinovaný přístup na bázi proteomiky a transkriptomiky ukázal statisticky významné zvýšení proteinových, resp. transkriptových hladin panelu devíti genových produktů u metastazujících low-grade nádorů prsu ve srovnání s nemetastazujícími. Statistika zahrnující Spearmanovu korelaci odhalila dva klastry související se stavem lymfatických uzlin u low-grade karcinomů. Exprese genů byla úspěšně validována na nezávislém setu nádorů luminal A (n = 343) pro CPB1 (p = 0,00155), PDLIM2 (p = 0,02027) a RELA (p = 0,00015), na dalším nezávislém souboru (n = 1 678) byla získána statisticky významná data ve vztahu k přežití pacientů. Závěr: Naše výsledky ukazují, že molekulární mechanizmy metastazování u low-grade karcinomů prsu zahrnují aktivaci proteolýzy, NF-κB dráhy, změny v cytoskeletálních a adhezních proteinech a liší se od mechanizmů známých u high-grade karcinomů.

Práce byla podpořena Grantovou agenturou ČR (projekt č. 14-19250S), Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101), státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 223. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is associated with less aggressive tumours and better outcome of breast cancer patients

Obacz J.¹, Brychtová V.¹, Podhorec J.², Fabián P.³, Dobeš P.¹, Vojtěšek B.¹, Hrstka R.¹

¹ RECAMO, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ² Department of Comprehensive Cancer Care, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ³ Department of Oncological Pathology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno

Background: Breast cancer is the most common female malignancy and a leading cause of deaths among women worldwide thus understanding molecular mechanisms affecting breast cancer patients’ outcome remains of great importance. Anterior gradient protein 3 (AGR3) is a highly related homologue of pro-oncogenic AGR2 and was firstly characterized in breast cancer cell membranes. Its strong expression was shown in various cancers including that of breast, liver, ovary and prostate. However, there is a limiting amount of data depicting AGR3 prognostic relevance in these malignancies. Material and Methods: A retrospective cohort of 129 patients with primary breast cancers was selected for the study. Patient age at the time of dia­gnosis ranged from 29 to 84 years (median 57 years). Immunohistochemical analysis was used to assess the clinical and prognostic significance of AGR3 expression. The immunostaining was evaluated according to the number of positive cells. Results: AGR3 staining was detected in 80% of analyzed specimens. The percentage of AGR3 positive cells statistically significantly correlated with oestrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), as well as low histological grade and inversely correlated with the level of Ki-67 expression. In the whole cohort, AGR3 expression was associated with longer progression free survival (PFS). When pair-wised with other variables, AGR3-positive subgroup of low histological grade tumours showed significantly longer PFS and overall survival. Conclusion: Here, we demonstrate that AGR3 correlates with ER and PR status, slowly proliferating and well-differentiated tumours. AGR3 positivity significantly affected longer progression free survival. Our results suggest that AGR3 expression is associated with less aggressive tumours that are more prone to effective treat­ment and therefore favourable outcome.

The work was supported by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805), European Regional Development Fund, the state budget of the Czech Republic for Regional Centre for Applied Molecular Oncology – RECAMO (CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101), GACR 13-00956S, IGA NT/ 13794-4/ 2012 and the state budget of the Czech Republic (LO1413).

XXX/ 232. DNp63 multifunctionality in triple negative breast cancer – role in cell adhesion and potential interacting partners

Orzol P., Nekulová M., Vojtěšek B., Holčáková J.

RECAMO, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno

Background: Protein p63 is essential for the development and differentiation of stratified squamous epithelium. It belongs to the p53 protein family, which consists of p53, p63 and p73 proteins. At least six isoforms of this protein are expressed and it can act as both tumour supressor or oncogene. We can distinguish full-length isoforms (TAp63) and DN isoforms with shortened N-terminal transactivation domain due to the use of alternative promoters. In breast carcinomas, p63 expression is usually lost, except of subgroup of triple-negative breast carcinomas (TNBC). Our goal was to investigate p63 role in carcinogenesis of TNBC. Materials and Methods: We developed a tetracycline-inducible model system to study the role of p63 in breast cancer cells (MDA MB 468). We analysed the impact of p63 expression on cellular proliferation, migration, adhesion, gene expression profiling and signalling pathway activation by xCELLigence real-time cell analysis, trypsynization test and real-time PCR. Potential p63 interacting partners were co-immunoprecipitated with DNp63 specific antibody and analysed by mass spectrometry. Furthermore, we have prepared a knock-out p63 cell line (CRL 2335) by CRISPR-Cas system to observe changes in the cell phenotype and signalling pathways after eliminating p63 expression. Results: DNp63 expression in breast cancer cells caused morphological changes and the loss of cellular adhesion. We supposed that reduced cell adhesion is caused by up-regulation of phosphorylated form of EGFR. Additionally, elimination of p63 expression seems to be important in maintaining a basal phenotype of cancer cells, as evidenced by changes in specific markers. Using mass spectrometry method we were able to identify many potential interacting partners, which play role in cancer development and progression like: peroxiredoxin 2, stathmin 1, PDLIM 1 protein. Now our aim is to investigate the influence of these interactions on breast cancer cell. Conclusion: Based on results obtained with our new model cell lines (with p63 overexpression and p63 knock-out) we suggest that DNp63 isoform plays an important role in regulation of cell adhesion through the EGFR pathway activation and is also needed for maintaining a basal phenotype of breast cancer cells.

The work was supported by European Regional Development Fund, the state budget of the Czech Republic for Regional Centre for Applied Molecular Oncology – RECAMO (CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101) and by IGA NT/ 14602-3/ 2013, by MH CZ – DRO (MMCI, 00209805) and the state budget of the Czech Republic (LO1413).

XXX/ 234. Funkční charakterizace potenciálně prometastatických proteinů u nádorů prsu

Maryáš J.¹, Dvořáková M.¹, Struhárová I.¹, Nenutil R.², Vojtěšek B.¹, Bouchal P.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno

Východiska: Hlavní příčinou úmrtí pacientek s nádorem prsu nebývá obvykle primární nádor, ale jeho vzdálené metastázy. Identifikace metastatických markerů je tedy z klinického hlediska velmi žádoucí. Naše vyhledávací studie zahrnující analýzu transkriptomu a proteomu na souboru 96 klinicko-patologicky charakterizovaných nádorů prsu odhalila korelaci zvýšených hladin proteinů a transkriptů PDLIM2 a RNF25 s přítomností metastáz v lymfatických uzlinách u nádorů prsu grade 1 (ER+, PgR+, Her-2–), což naznačuje potenciální prometastatický charakter těchto proteinů. Materiál a metody: In vitro funkční experimenty, navazující na vyhledávací studii, byly zaměřeny na sledování vlivu hladin vybraných proteinů na buněčnou migraci a invazi. K tomuto účelu byly využity buněčné linie odvozené od nádorů prsu MCF7 (ER+, PgR+, Her-2–) a T47D (ER+, PgR+/–, Her-2–) a systémy xCELLigence a Transwell assay. Hladiny proteinů byly v buňkách modifikovány (zvýšeny) transfekcí specifickými plazmidy. Výsledky: Vyhledávací studie prokázala statisticky významné zvýšení proteinových, resp. transkriptových hladin PDLIM2 (p < 0,009, resp. p < 0,007) a RNF25 (p < 0,05, resp. p < 0,002) u G1 N1–2 nádorů prsu ve srovnání s G1 N0 nádory. Následná funkční charakterizace těchto proteinů pomocí Transwell assay odhalila signifikantní nárůst migrace (p < 0,0001) a invaze (p < 0,0001) u buněk MCF7 se zvýšenými hladinami PDLIM2, resp. RNF25, ve srovnání s buňkami s nízkými (endogenními) hladinami (transfekce kontrolním plazmidem). Stejný efekt mělo zvýšení hladin PDLIM2, resp. RNF25, i u buněk T47D. Signifikantní nárůst migrace (p < 0,005) a invaze (p < 0,005) u buněk se zvýšenými hladinami PDLIM2, resp. RNF25, byl detekován i pomocí xCELLigence systému. Závěr: Výsledky funkční studie ukázaly korelaci hladin PDLIM2, resp. RNF25 s migrací a invazí modelových buněčných systémů reprezentujících G1 nádory prsu a jsou v souladu se závěry vyhledávací studie. Práce bude pokračovat funkční charakterizací s využitím 3D buněčných kultur a příp. i in vivo modelových systémů, studiem molekulárních interakcí a klinickou validací proteinů na nezávislém souboru pacientek. V případě úspěchu by naše úsilí mohlo směřovat k potenciálnímu klinickému využití těchto proteinů jako prognostických či dia­gnostických bio­markerů asociovaných s metastazováním u pacientek s G1 nádory prsu.

Práce byla podpořena Grantovou agenturou ČR (projekt č. 14-19250S), Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101), státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR-RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 269. Stanovení exprese AGR2 u estrogen receptor negativních karcinomů mléčné žlázy

Sommerová L.¹, Nenutil R.², Selingerová I.³, Vojtěšek B.¹, Hrstka R.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno, ³ Masarykův onkologický ústav, Brno

Východiska: Protein anterior gradient 2 (AGR2) představuje potenciální bio­marker, který se významně uplatňuje v patogenezi karcinomu mléčné žlázy, kde se podílí na regulaci buněčné proliferace, migrace a tvorbě metastáz. Předešlé studie prokázaly souvislost mezi expresí AGR2 a estrogenních receptorů (EsR). Bylo zjištěno, že zvýšená exprese AGR2 u EsR+ karcinomů je asociovaná s horší prognózou. Navíc byl prokázán přímý vliv působení EsR receptorů na expresi AGR2. Protein AGR2 byl rovněž vzácněji detekován u EsR– karcinomů mléčné žlázy, což dokazuje existenci dalších signálních drah uplatňujících se při regulaci jeho exprese. V naší studii jsme se zaměřili na potenciální funkční souvislost mezi AGR2 a receptorem pro lidský epidermální růstový faktor (Her-2). Materiál a metody: Exprese AGR2 a Her-2 receptoru byla imunohistochemicky stanovena u 211 EsR negativních vzorků. K in vitro sledování funkčního vztahu mezi AGR2 a Her-2 receptorem byly použity buňky SK-BR-3 (EsR–, Her-2+), které byly vystaveny účinku Herceptinu (trastuzumabu) a lapatinibu. Exprese cílových proteinů byla stanovena Western blot analýzou a hladina mRNA pomocí PCR v reálném čase. Výsledky: Ve vybraném souboru byla přibližně u 60 % vzorků pozorována přítomnost AGR2. Statistická analýza odhalila významnou korelaci mezi expresí AGR2 a Her-2 receptory (p < 0,0001). Tento vzájemný vztah byl potvrzen i na úrovni mRNA (p < 0,0001). Paralelně byla buněčná linie SK-BR-3 vystavena působení trastuzumabu, který indukoval mírné snížení fosforylace Her-2 receptoru (p-Her-2), což bylo asociováno s poklesem exprese AGR2 a PI3K/ Akt signalizace. Při aplikaci nízkomolekulárního inhibitoru (lapatinibu) jeho krátkodobé působení zřetelně inhibovalo Her-2 signalizaci a vedlo k významnému poklesu hladiny AGR2 proteinu. Závěr: Naše výsledky ukazují zvýšenou expresi proteinu AGR2 u Her-2+ karcinomů mléčné žlázy a zároveň funkční spojitost mezi expresí AGR2 a Her-2 receptory, čímž jsme prokázali existenci další signální dráhy uplatňující se v regulaci exprese AGR2 nezávisle na EsR. Vzhledem ke skutečnosti, že se v poslední době ve stále větší míře objevují případy rezistence k trastuzumabu, nově popsaná schopnost AGR2 podílet se na vzniku lékové rezistence, vytváří z AGR2 nejen zajímavý prognostický marker, ale také možný cíl při cílené terapii Her-2+ karcinomů mléčné žlázy.

Tato práce byla podpořena grantem GACR P301/ 13/ 00956S, IGA NT/ 14602-3/ 2013, státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 385. Fytofarmaká v prevencii experimentálnej rakoviny prsníka

Výbohová D.¹, Mojžiš J.², Bojková B.³, Kassayová M.³, Péč M.⁴, Mahmood S.⁵, Murín R.⁵, Kajo K.⁶, Kubatka P.⁴, Kapinová A.⁷, Kello M.², Adamkov M.⁸

¹ Ústav anatómie, JLF UK v Martine, Slovensko, ² Ústav farmakológie, LF UPJŠ v Košiciach, Slovensko, ³ Ústav bio­logických a ekologických vied, PrF UPJŠ v Košiciach, Slovensko, ⁴ Ústav lekárskej bio­lógie, JLF UK v Martine, Slovensko, ⁵ Ústav lekárskej bio­chémie, JLF UK v Martine, Slovensko, ⁶ Ústav patológie LF SZU a Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava, Slovensko, ⁷ JLF UK v Martine, Slovensko, ⁸ Ústav histológie a embryológie, JLF UK v Martine, Slovensko

Východiská: Predklinické a epidemiologické štúdie zamerané na liečbu a prevenciu nádorových ochorení zreteľne poukazujú na protektívne účinky bio­aktívnych nenutričných rastlinných zložiek – fytochemikálií. Materiál a metódy: Cieľom experimentu bolo analyzovať antineoplastickú aktivitu komerčne dostupných fytofarmák (Chlorella pyrenoidosa, Flavin7, mladý jačmeň) v chemopreventívnych štúdiách v mamárnej karcinogenézy u samíc potkanov. Mamárna karcinogenéza bola u zvierat indukovaná pomocou N-metyl-N-nitrozourey. Chemoprevencia začala 1 týždeň pred aplikáciou karcinogénu a trvala 15 týždňov až do ukončenia každej štúdie. Použitý model imitoval situáciu u zdravých, ale vysoko rizikových žien. Pri pitve boli nádory excidované a pripravené na histopatologické a imunohistochemické vyšetrenie. Analyzovali sme základné parametre karcinogenézy, mechanizmus účinku a metabolické účinky uvedených látok. Výsledky: Chlorella p. a Flavin7 vykázali výrazný protinádorový účinok v experimentálnej rakovine prsníka u potkanov. Po liečbe oboma fytofarmakami bol u zvierat zistený nižší výskyt agresívnych foriem karcinómov mliečnej žľazy. Chlorella i Flavin7 mali signifikantne beneficiálny vplyv na plazmatický lipidový profil u zvierat (triacylglyceroly, celkový, LDL- a VLDL-cholesterol). Flavin7 mal v nádorových bunkách signifikantný proapoptotický, antiangiogénny a antiproliferatívny efekt, chlorella prejavila proapoptotický a mierny antiangiogénny efekt. U mladého jačmeňa bol pozorovaný miernejší protirakovinový účinok v použitom modeli rakoviny prsníka. Jačmeň nemal výraznejší efekt na lepšiu prognózu karcinómov, avšak signifikantne znížil parameter oxidačného poškodenia (dityrozíny) v nádoroch. Všetky tri fytofarmaká preukázali signifikantný protinádorový účinok v bunkách ľudského adenokarcinómu mliečnej žľazy (MCF-7 línia). Záver: Výsledky nášho experimentu poukazujú na významný antineoplastický účinok Chlorelly p. a ovocných polyfenolov v chemoprevencii mamárnej karcinogenézy in vivo a in vitro. Použité produkty sa javia ako vhodné na pravidelné užívanie v prevencii rakoviny či kardiovaskulárneho ochorenia.

Práca bola podporená grantami VEGA 1/ 0071/ 13 a APVV-0325-07.

XXX/ 270. MiR-205 má vlastnosti nádorového supresoru u adenokarcinomu a onkogenu u dlaždicobuněčného karcinomu jícnu

Héžová R.¹, Kovaříková A.², Srovnal J.³, Zemanová M.⁴, Haruštiak T.⁵, Svoboda M.¹, Ehrmann J.⁶, Hajdúch M.³, Slabý O.²

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ² CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci, ⁴ Onkologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze, ⁵ III. chirurgická klinika 1. LF UK a FN v Motole, Praha, ⁶ Ústav klinické a molekulární patologie, FN Olomouc

Východiska: Karcinom jícnu je celosvětově osmým nejběžnějším maligním onemocněním a šestou nejčastější příčinou úmrtí v důsledku nádorového onemocnění. Tvoří přibližně 20 % všech zhoubných nádorů trávicí soustavy. Na základě histologie a anatomické lokalizace rozlišujeme dva základní typy karcinomu jícnu – spinocelulární karcinom (SCCE) vznikající přeměnou dlaždicového epitelu a adenokarcinom (EAC). EAC a ESSC jsou obvykle detekovány v pozdním stadiu vyžadujícím multimodální léčebný přístup a celkové přežití pacientů s karcinomem jícnu zůstává nižší než u jiných nádorových onemocnění. Výzkum nových molekulárních bio­markerů za účelem zlepšení dia­gnostiky, a tak i léčebných výsledků je u karcinomu jícnu velice žádoucí. MikroRNA (miRNA) jsou krátké nekódující RNA, umožňující regulaci až 60 % protein kódujících genů, které jsou zapojeny rovněž do procesu kancerogeneze. Soubor pacientů a metody: V první fázi studie byla analyzována exprese miR-205 u 44 vzorků karcinomu jícnu (22 EAC, 22 ESSC) a 20 vzorků přilehlé nenádorové tkáně k EAC. V druhé fázi byl pomocí in vitro funkčních analýz stanoven vliv miR-205 na základní buněčné děje u buněčných linií odvozených od EAC SK-GT-4 a ESSC KYSE-150. Výsledky: První fáze studie prokázala signifikantně sníženou expresi miR-205 u EAC pacientů v porovnání se zdravou sliznicí (p = 0,0017) a sníženou expresi miR-205 u EAC v porovnání s ESSC (p < 0,0001). Na základě korelací hladin exprese s parametry přežití bylo zjištěno, že zvýšená hladina miR-205 je asociována s delším celkovým přežitím u pacientů s EAC (p = 0,0138), zatímco u ESSC korelace s celkovým přežitím nebyla nalezena. Po experimentálním navýšení hladiny miR-205 bylo u buněčné linie adenokarcinomu jícnu SK-GT-4 pozorováno snížení proliferace (p = 0,04) a migrace (p < 0,0001). K signifikantnímu snížení proliferace (p = 0,02) a migrace (p = 0,0005) došlo také při experimentálním snížení hladiny miR-205 u ESSC linie KYSE-150 (p = 0,02). U linie SK-GT-4 jsme po navýšení hladiny miR-205 pozorovali zástavu buněčného cyklu v G2 fázi (p = 0,0116), naopak u snížení hladiny miR-205 u KYSE-150 jsme pozorovali zástavu v G1 fázi buněčného cyklu (p = 0,0017). Vliv miR-205 na apoptózu pozorován nebyl. Závěr: Pilotní analýzy ukázaly, že miR-205 se chová jako nádorový supresor u adenokarcinomu jícnu, zatímco u dlaždicobuněčného karcinomu jícnu vykazuje vlastnosti onkogenu. Tato studie naznačuje možnost využití detekce miR-205 u pacientů s karcinomem jícnu ke spolehlivější dia­gnostice a také k predikci prognózy onemocnění.

Tato práce byla podpořena granty IGA MZČR č. NT/ 13585 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 61. Ischemický conditioning žaludku před resekcí jícnu experimentální studie

Pavlovský Z.¹, Kala Z.², Procházka V.², Prudius V.², Prudius D.³

¹ Ústav patologie, LF MU a FN Brno, ² Chirurgická klinika LF MU a FN Brno, ³ Klinika interní, geriatrie a praktického lékařství LF MU a FN Brno

Leak ezofagogastroanastomie po resekčních zákrocích na jícnu je jeden z hlavních problémů v časném pooperačním období. Neovaskularizace orální časti konduitu žaludku je ovlivněna ischemickým conditioningem žaludku. Nejčastěji používanou metodou ve světě je klipáž arteria gastrica sinistra (AGS). Ta je prováděna v průběhu stagingové laparoskopie 30 dnů před hlavním operačním zákrokem (resekce jícnu s náhradou tubulizátem žaludku a založením cervikální ezofagogastroanastomózy). Zkoumali jsme vliv ischemického conditioningu na neovaskularizaci a fibrotické změny stěny žaludku v oblasti velké křiviny. Základem této práce byla již provedená patologicko-anatomická studie zaměřená na zkoumání cévního zásobení konduitu žaludku (n41). Hlavní skupinou byly vzorky tkáně po konstrukci tubulizátu žaludku odebrané z orální časti konduitu (n7) u pacientů po ischemickém conditioningu provedeném klipáží AGS v průběhu stagingové laparoskopie. K posouzení rozdílů mezi autoptickým materiálem a nativně odebranou tkání byly použity vzorky tkáně odebrané ze stejných míst po bernartickém zákroku (sleevegastrectomie). Histologicky bylo prokázáno zvětšení počtu a kalibru kapilár a drobných arteriol ve vyšetřené oblasti ve srovnání s kontrolní skupinou. Dalším nálezem je snížení koncentrace kolagenu ve stěně žaludku. Naše studie prokazuje příznivý efekt ischemického conditioningu na neovaskularizaci konduitu žaludku. Přerušení alespoň AGS při stagingové laparoskopii je dostatečná k vzniku výše popsaných změn.

XXX/ 240. MikroRNA jako dia­gnostický, prognostický a prediktivní bio­marker u karcinomu žaludku – připravovaný pilotní projekt testování v souboru pacientů MOÚ Brno

Všianská M.¹, Obermannová R.¹, Grell P.1, Emmerová R.¹, Slabý O.², Vychytilová P.³, Vyzula R.¹

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ² CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Molekulární medicína II solidní nádory, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiska: Karcinom žaludku je čtvrtým nejčastějším nádorovým onemocněním a druhou nejčastější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění na světě. Prognóza karcinomu žaludku je špatná s pětiletým přežitím méně než 35 %, často ovlivněná již primárně pozdní dia­gnostikou ve stadiu lokálně pokročilého či metastatického onemocnění (u více než 60 % pacientů). Dalším nepříznivým faktorem je omezená odpověď a mnohdy až rezistence na protinádorovou léčbu. Časná detekce karcinomu žaludku je klíčem k prodloužení přežití. Dosud neexistuje spolehlivý marker, který by umožnil plošný screening s dostatečnou senzitivitou a specificitou. Rutinně používané dia­gnostické metody pro detekci karcinomu žaludku jsou GFS, případně EUS, CT vyšetření hrudníku a břicha a tumormarkery (CEA, Ca 72-4 a Ca 19-9). Poslední dobou narůstá počet studií, jejichž cílem je nalezení bio­markerů, které by umožnily včasnou dia­gnostiku karcinomu žaludku v bezpříznakovém období, určení jeho prognózy a predikce odpovědi na protinádorovou léčbu. Detekce těchto bio­markerů by umožnila individualizovat terapeutický plán pro konkrétního pacienta. Objev miRNA jako regulátorů genové exprese přinesl velký pokrok ve výzkumu patogeneze solidních nádorů. MiRNA jsou krátké jednovláknové nekódující RNA (o délce 21–23 nukleotidů), regulující genovou expresi buď vazbou na cílové mRNA s útlumem translace, nebo přímo degradací mRNA. Vyskytují se u rostlin i živočichů, v organizmu kontrolují jak fyziologické, tak patologické procesy. Hrají významnou úlohu v oblastech, jako je buněčná proliferace, apoptóza a diferenciace, ovlivňují vznik nádoru, metastazování, angiogenezi a imunitní reakce. Cíl: Prediktivní a prognostický význam miRNA u vybraných solidních a hematologických malignit je předmětem řady publikovaných prací. Z oblasti zažívacího traktu se jedná např. o karcinom jícnu a kolorekta. Problematika karcinomu žaludku dosud nebyla na našem pracovišti zpracována, k dispozici jsou ale výsledky testování miRNA v zahraničí. Naším cílem bude testování miRNA na souboru cca 60 pacientů převážně s lokálně pokročilým karcinomem žaludku a zhodnocení významu pro dia­gnostiku, prognózu a predikci léčebné odpovědi. Závěr: Analýza souboru bude publikována na BOD 2016.

XXX/ 243. MiR-31-5p zvyšuje prediktivní hodnotu KRAS/ NRAS/ BRAF u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem léčených cetuximabem

Mlčochová J.¹, Vychytilová P.², Radová L.¹, Lupini L.³, Bassi C.³, Ferracin M.³, Zaggati B.³, Němeček R.⁴, Vyzula R.⁴, Svoboda M.⁴, Negrini M.³, Slabý O.¹

¹ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Molekulární medicína II solidní nádory, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ University of Ferrara, Italy, ⁴ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno

Východiska: Úspěšnost léčby metastatického kolorektálního karcinomu (mCRC) monoklonálními protilátkami proti EGFR receptoru je podmíněná nemutovanými onkogeny KRAS, NRAS a BRAF. I přesto, že se jedná o velice účinné negativní prediktivní bio­markery, je klinický benefit léčby pozorován přibližně u čtvrtiny pacientů bez mutace v těchto genech. Je proto nutné nalézt nové bio­markery schopné predikovat odpověď na anti-EGFR terapii. Těmito bio­markery by mohly být mikroRNA (miRNA), jež jsou zapojeny do klíčových signálních drah a regulují také jednotlivé složky signální dráhy EGFR. Soubor pacientů a metody: Do naší studie bylo zařazeno 50 důkladně klinicky charakterizovaných pacientů s mCRC léčených cetuximabem v kombinaci s irinotekanem. Z 50 FFPE vzorků nádorové tkáně byla izolována DNA a celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA. Geny pro KRAS, NRAS a BRAF byly sekvenovány pomocí sekvenování nové generace, platformy Ion Torrent PGM. RNA byla použita pro stanovení exprese miR-31-5p metodikou qRT-PCR. Výsledky: Bylo zjištěno, že mutace v genu pro KRAS/ NRAS/ BRAF spolu se zvýšenou hladinou miR-31-5p signifikantně korelují s časem do progrese u pacientů podstupujících anti-EGFR terapii (14 vs. 46 týdnů), (p = 0,007). V případě predikce času do progrese založené pouze na základě mutačního statusu genů pro KRAS/ NRAS/ BRAF byly mediány času do progrese 13 vs. 43 týdnů (pacienti s alespoň jednou mutací (n = 13) vs. pacienti bez mutace (n = 37), (p > 0,05). Z 37 pacientů, kteří neměli mutaci v žádném ze sekvenovaných genů, mělo 12 zvýšenou hladinu miR-31-5p, přičemž u 9 z těchto 12 pacientů nebyla pozorována léčebná odpověď na anti-EGFR terapii. Zahrnutí miR-31-5p do prediktivního modelu společně s KRAS/ NRAS/ BRAF umožní navýšení senzitivity v identifikaci pacientů, kteří nebudou odpovídat na anti-EGFR terapii. Závěr: Na základě získaných výsledků se zdá, že miR-31-5p by mohla sloužit jako slibný prediktivní bio­marker léčebné odpovědi na cetuximab u pacientů s mCRC, který navyšuje senzitivitu konvenčně používaného mutačního stavu genů pro KRAS/ NRAS/ BRAF.

Práce byla podpořena grantovým projektem IGA MZČR NT 13860-4/ 2012 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 158. Využití ctDNA v predikci nádorové odpovědi na neoadjuvantní léčbu karcinomu rekta

Pazdírek F.¹, Minárik M.², Hálková T.², Benešová L.², Belšánová B.², Hoch J.¹

¹ Chirurgická klinika 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ² Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, Praha

V ČR je každoročně dia­gnostikováno přes 2 000 pacientů s karcinomem rekta. Současná léčba nádorů rekta je multimodální. U nádorů rekta je u stadia II a III před operací doporučena neoadjuvantní léčba spočívající v kombinaci zevního ozáření a systémové chemoterapie (CRT). Předoperační léčba přispívá k omezení lokální recidivy onemocnění. Vliv na dlouhodobé přežívání a zvýšení počtu výkonů zachovávající svěrač nebyl potvrzen. Tato léčba může vést až u 24 % pacientů ke kompletnímu vymizení nádoru. Neodjuvantní léčba ale bohužel přináší i nežádoucí účinky od perianální dermatitidy, postradiační kolitidy až po těžké postradiační poškození v oblasti pánve, končící fibrózou, poruchou análního svěrače, inkontinencí a sexuálními dysfunkcemi. Téměř 40 % pacientů na léčbu neodpoví. U těchto tzv. non-responderů by bylo vhodnější předoperační léčbu modifikovat či zcela vynechat, a tím eliminovat její nežádoucí účinky. Jsou proto hledány molekulárně bio­chemické markery, jak tuto skupinu pacientů vyhledat. Jedním z možností je detekce ctDNA v krevní plazmě a sledování její plazmatické koncentrace během neodjuvantní onkologické léčby. Do souboru bylo zařazeno 20 pacientů s karcinomem rekta podstupující CRT. Monitorovali jsme hladiny ctDNA před, po CRT a po operaci. Výsledek jsme korelovali s histopatologickou odpovědí dle Dworaka. Zjistili jsme pokles hladin ctDNA během dobré léčebné odpovědi na CRT. Limitem studie byl malý počet pacientů a relativně nízký záchyt ctDNA v časných fázích onemocnění. Přesto je z výsledků patrné, že ctDNA je potenciálně zajímavý prediktor léčebné odpovědi na CRT nádorů rekta.

Práce byla podpořena grantem (IGA NT 13660).

XXX/ 162. Analýza mikroRNA u pacientů s kolorektálním karcinomem s využitím sekvenování nové generace

Vychytilová-Faltejsková P.¹, Kosařová Z.², Radová L.², Šachlová M.³, Svoboda M.¹, Vyzula R.¹, Slabý O.²

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ² CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Gastroenterologické oddělení, MOÚ, Brno

Východiska: Kolorektální karcinom (CRC) patří mezi nejčastější nádorová onemocnění v ČR a je druhou nejčastější příčinou nádorových úmrtí v západních zemích. Přestože v současné době existuje řada preventivních programů usilujících o snížení incidence a následně i mortality, nemá výskyt CRC dosud klesající tendenci a vyléčit se daří pouze 35–40 % nemocných. Hlavní příčinou těchto neuspokojivých výsledků je neexistence vhodných metod či bio­markerů pro dia­gnostiku časných stadií CRC, která jsou dobře léčitelná. Z těchto důvodů je nezbytné nalézt nové bio­markery, které by umožnily časnou detekci CRC a zároveň by byly vysoce specifické. Jedním z nejmodernějších přístupů molekulární charakterizace solidních nádorů je analýza mikroRNA (miRNA). MiRNA jsou krátké nekódující RNA, jež mají potenciál posttranskripčně regulovat expresi až 50 % lidských genů. Hrají tak důležitou roli v mnoha bio­logických procesech, jakými jsou proliferace, buněčný cyklus, apoptóza či invazivita. Mnohé studie opakovaně prokázaly jejich deregulovanou expresi nejen v nádorové tkáni, ale rovněž v krevním séru či plazmě, což poukazuje na jejich možné využití pro časnou dia­gnostiku či určení prognózy a léčebné odpovědi pacientů s CRC. Soubor pacientů a metody: V rámci studie byla analyzována exprese miRNA u tří párových vzorků nádorové tkáně a nenádorové střevní sliznice a dále u 45 sér od zdravých dárců a 45 sér od důkladně klinicky charakterizovaných pacientů s CRC s využitím sekvenování nové generace. Ze vzorků byla izolována celková RNA obohacená o frakci krátkých RNA (miRNeasy Serum/ Plasma kit, Qiagen), byla změřena koncentrace a čistota získané RNA (NanoDrop ND-1000) a rovněž její kvalita (Agilent Bioanalyzer 2100). Získaná RNA byla zakoncentrována pomocí etanolové precipitace a následně byla provedena ligace adaptorů, reverzní transkripce, PCR amplifikace a gelová purifikace (TruSeq Small RNA Sample Prep Kit, Illumina). Takto připravená DNA knihovna byla podrobena hlubokému sekvenování s využitím systému MiSeq (Illumina) a získaná data byla analyzována pomocí standardních i vícedimenzionálních bio­statistických metod. Výsledky: Výsledky studie budou součástí sdělení. Závěr: Expresní profilování miRNA přítomných v krevním séru či plazmě patří mezi moderní přístupy identifikace bio­markerů pro časnou dia­gnózu nádorových onemocnění a určení prognózy či léčebné odpovědi pacientů. Sekvenování nové generace umožňuje nejen analýzu deregulovaných miRNA, ale též identifikaci nových miRNA a jejich izoforem.

Práce byla podpořena grantovým projektem IGA MZČR NT13549-4/ 2012 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 208. MiR-215 jako potenciální terapeutický cíl: pilotní studie navýšení exprese v animálním modelu kolorektálního karcinomu

Merhautová J.¹, Vychytilová P.², Slabý O.³, Demlová R.¹

¹ Farmakologický ústav, LF MU, Brno, ² Molekulární medicína II solidní nádory, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiska: MikroRNA působí jako posttranskripční regulátory exprese většiny genů. Dysregulace jejich sítě byla prokázána u nádorových onemocnění včetně kolorektálního karcinomu (CRC). Již dříve jsme identifikovali miR-215 jako tumorový supresor specifický pro tkáň CRC. Prezentované in vivo experimenty ověřují její působení v kontextu celého organizmu. Posloužily také k zavedení a optimalizaci techniky subkutánní xenotransplantace na našem pracovišti. Materiál a metody: Příprava buněk: Buňky linie HCT-116+/ + byly transfekovány CMV vektorem s klonovanou sekvencí pre-miR-215 nebo kontrolním mock-vektorem (OriGene Technologies, Rockville, USA). Stabilně transfekované buňky byly selektovány pomocí G-418 za fluorescenční kontroly exprese GFP. Po limitním naředění bylo provedeno namnožení 14 klonů buněk a jejich charakterizace (morfologie, rychlost proliferace, exprese miR-215 a vybraných genů). Subkutánní xenotransplantace: Animální experimenty byly provedeny v souladu se schváleným projektem pokusů. a) 1. pilotní pokus: Třem samicím NSG myši bylo na dorzální stranu těla vpravo s.c. aplikováno 5 × 10⁶ buněk klonu 33 miR-215-HCT-116+/ +. Jako kontrola byl aplikován vlevo stejný počet buněk mock-HCT-116+/ +. 27. den po aplikaci byl pokus ukončen, nádory byly změřeny a byl proveden odběr vzorku nádorové tkáně. b) 2. pilotní pokus: Pěti samcům NSG myši bylo s.c. aplikováno 2,5 × 10⁶ buněk klonu 33 miR-215-HCT-116+/ +. Jako kontrola byl aplikován vlevo stejný počet buněk mock-HCT-116+/ +. 24. den po aplikaci byl pokus ukončen. Výsledky: V pilotním experimentu byly úspěšně připraveny buňky linie odvozené od CRC se stabilně navýšenou expresí miR-215. Selekcí klonů s následnou charakterizací byl vybrán a namnožen klon s optimálními vlastnostmi. Klon byl subkutánně aplikován NSG myším. Po 10–12 dnech byly v podkoží hmatné tumory, experimenty byly ukončeny 27., resp. 24. den po aplikaci. Odebraná nádorová tkáň byla histologicky zhodnocena jako nízce diferencované nádorové buňky s vysokou mitotickou aktivitou. Kontrolní tumory vykazovaly vyšší míru nekróz než tumory vzniklé z buněk s navýšením miR-215. Tumory vzniklé z buněk s navýšením miR-215 měly signifikantně menší objem než kontrolní tumory (p < 0,05). Závěr: Experimenty in vivo doplnily souhrn poznatků o tumorově supresorovém působení miR-215. Na jejich základě budou provedeny další experimenty s terapeutickou aplikací miR-215 pomocí specifického nosiče. MiR-215 je nadějnou cestou ve vývoji nových léčiv cílené terapie CRC.

Práce byla podpořena projektem MUNI/ A/ 0886/ 2013.

XXX/ 224. Stav imunitního systému u pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem

Vočka M.¹, Špaček J.¹, Závadová E.¹, Konopásek B.¹, Fučíková T.², Říhová B.³, Petruželka L.¹

¹ Onkologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze, ² Ústav imunologie a mikrobio­logie, 1. LF UK a VFN v Praze, ³ Mikrobio­logický ústav AV ČR, v. v. i., Praha

Východiska: Kolorektální karcinom je čtvrtou nejčastější malignitou a pátou nejčastější příčinou úmrtí na malignity ve světě. Přestože došlo v posledních letech ke značnému prodloužení celkového přežívání pacientů, výsledky léčby jednotlivých pacientů se mohou výrazně lišit. Kromě řady prognostických markerů molekulárních a klinických hraje významnou roli i stav imunitního systému, který se přímo i nepřímo podílí na protinádorovém účinku jednotlivých terapeutik, a ovlivňuje tak přežívání pacientů. Soubor pacientů a metody: Do projektu bylo zařazeno 64 pacientů v období od července 2012 do července 2014, kteří byli na Onkologické klinice VFN léčeni pro metastazující kolorektální karcinom (mCRC). U všech pacientů byly vyšetřeny parametry buněčné a protilátkové imunity a pacienti byli vyšetřeni klinickým imunologem. Výsledky: Bylo vyšetřeno 64 pacientů s mediánem věku 64,0 let, 21 žen a 43 mužů. Ve skupině pacientů byl zaznamenán statisticky významný pokles CD3+ lymfocytů (p = 0,003), a to jak pomocných T lymfocytů (CD4+, p = 0,002), tak cytotoxických lymfocytů (CD8+, p = 0,008). U pacientů s mCRC byla zjištěna vyšší hladina NK buněk (CD16+56+). V rámci humorální části imunitního systému byl snížen absolutní počet B lymfocytů (CD19+) u pacientů s mCRC (p = 0,002), stejně jako hladina IgG4 (p = 0,004), naopak IgE byl v této skupině zvýšen (p = 0,0006). Porovnání těchto dat s hodnotami CD3+ a CD8+ buněk v centru tumoru a v invazivních okrajích je v plánu. Závěr: Změny hladin jednotlivých složek imunitního systému se významně liší u pacientů s mCRC oproti zdravým kontrolám. Porovnání těchto dat s hodnotami CD3+ a CD8+ buněk v centru tumoru a v invazivních okrajích a jejich vztahu k odpovědi na léčbu a celkovým přežíváním pacientů zatím není k dispozici.

Práce byla podpořena grantovým projektem IGA NT 13259-3, Liga proti rakovině a PRVOUK-P-27/ LF1/ 1.

XXX/ 233. Využití metody sekvenování nové generace (NGS) k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mCRC) léčených cetuximabem

Němeček R.¹, Berkovcová J.², Babánková I.³, Mlčochová J.⁴, Vychytilová-Faltejsková P.¹, Slabý O.⁴, Svoboda M.¹

¹ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ² Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno, ³ 1. úsek dia­gnostické bio­ptické patologie, MOÚ, Brno, ⁴ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiska: Cílená léčba monoklonálními protilátkami proti EGFR je významnou terapeutickou alternativou u pacientů s mCRC. K regresi nádoru však dojde jen u části léčených pacientů, a proto jsou vyvíjeny intenzivní snahy o nalezení prediktorů odpovědi či rezistence k této terapii. V klinické praxi se v současné době používá stanovení mutací onkogenů z rodiny RAS (přítomná u cca 50 % pacientů), které predikují rezistenci k anti-EGFR léčbě. Kromě toho však existuje řada dalších prediktorů (mutace BRAF, PIK3CA, PTEN, hladina kopií genu pro EGFR, hladina exprese ligandů EGFR epiregulinu a amphiregulinu a další), které odpověď na anti-EGFR terapii ovlivňují. Cíl: Projekt využívá nové vysokokapacitní technologie NGS k analýze mutačního stavu členů EGFR signální dráhy u pacientů s mCRC léčených cetuximabem, kteří na léčbu neodpověděli ani přes ověřenou absenci mutace v onkogenu RAS. Vyšetřeny byly nádorové buňky primárních tumorů i metastáz a byly hledány rozdíly v mutačním stavu mezi oběma lokalitami a další faktory, které jsou za rezistenci terapie odpovědné. K vyšetření byl použit komerční TruSight Tumor panel (Illumina), který je určen k přípravě DNA knihovny pro následné NGS na platformě MiSeq. Panel obsahuje 26 genů s bio­logickým významem u solidních nádorů. Závěr: Bylo vybráno 13 pacientů léčených cetuximabem pro mCRC s vyloučenou mutací onkogenu RAS. Devět z těchto 13 pacientů na anti-EGFR léčbu vůbec neodpovědělo, naopak zbývající čtyři pacienti dosáhli léčbou kompletní nebo parciální remise. Byly vyhledány vzorky operovaných primárních tumorů a metastáz, patolog vyhodnotil procentuální zastoupení nádorových buněk a označil vhodné části k molekulárnímu testování. Bylo izolováno celkem 26 DNA. U všech vzorků DNA byla spektrofotometricky změřena koncentrace a čistota, následně byla ověřena amplifikovatelnost DNA metodou RQ-PCR. Poté byla připravena DNA knihovna a zahájeno vlastní sekvenování. U čtyř z devíti progredujících pacientů byla zjištěna nová mutace v onkogenu KRAS, kterou v té době používané testy nezachytily: ve dvou případech se jednalo o selhání metody Therascreen, přičemž později používaný test Cobas by danou mutaci již zachytil, v dalších dvou případech by však nová mutace KRAS nebyla zachycena ani zmiňovaným testem Cobas. Nově zjištěné mutace přitom prokazatelně vedly k selhání anti-EGFR léčby. Z uvedeného jednoznačně vyplývá, jak důležité je hodnotit výsledky klinických studií z pohledu senzitivity v té době používaných dia­gnostických metod.

Práce byla podpořena grantovým projektem MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 236. Vliv opioidní analgezie na přítomnost cirkulujících nádorových buněk u nádorů tlustého střeva a pankreatu

Vahalíková M.¹, Srovnal J.¹, Berta E.¹, Prášil P.², Prokopová A.², Vrbková J.¹, Hajdúch M.¹

¹ Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci, ² Klinika anestezie, resuscitace a intenzivní medicíny LF UP a FN Olomouc

Východiska: Kolorektální karcinom (CRC) a karcinom pankreatu patří mezi nejčastější příčiny úmrtí na nádorové onemocnění na světě a jsou charakteristické častými metastázami. Cílem studie bylo analyzovat vliv opioidní analgezie na množství cirkulujících nádorových buněk (CTC) u pacientů s kolorektálním karcinomem a karcinomem pankreatu po chirurgickém odstranění nádoru a dále vliv podané analgezie na délku bezpříznakového (DFS) a celkového přežití (OS) pacientů. Soubor pacientů a metody: Přítomnost CTC/ DTC v krvi a kostní dřeni byla testována u 121 pacientů s I.–III. stadiem CRC po radikálním chirurgickém zákroku a zpětně byl analyzován potenciální vliv podaných opiátů na prognózu pacientů. 39 pacientům byla podávána morfinová analgezie (MA) a 82 pacientům byl podáván piritramid (PA). Druh podaného analgetika byl porovnáván s přítomností CTC/ DTC, detekovaných pomocí real-time PCR kvantifikace epiteliálních genů CEA a CK20 v době operace a jeden měsíc po operaci, a s DFS a OS pacientů. Hodnocen byl také vliv dalších perioperačních faktorů (např. množství podaných transfuzí). Stejným způsobem byla vyhodnocena data pro karcinom pankreatu s využitím bio­markerů CEA, EGFR a hTERT pro detekci CTC/ DTC v krvi a kostní dřeni. Výsledky: Měsíc po operaci byla u pacientů s CRC po podání MA pomocí real-time PCR detekována vyšší hladina CK20 v periferní krvi (p < 0,045) a kostní dřeni (p < 0,065). Kromě toho byla MA spojena se signifikantně kratším DFS a byla negativním prognostickým faktorem u pacientů negativních na CEA a CK20 v portální krvi (p < 0,019) a u pacientů pozitivních na CEA (p < 0,028) a CK20 (p < 0,015). Předběžná data získaná z analýzy vzorků pacientů s karcinomem pankreatu ukazují opačný vliv MA na přítomnost CTC a progresi onemocnění. MA se v případě karcinomu pankreatu chová jako protektivní faktor, což může být způsobeno expresí rozdílných podtypů opioidních receptorů u uvedených dia­gnóz. Závěr: Analgetika na bázi morfinu, nikoli však piritramidu, zvyšují přítomnost CTC/ DTC a zkracují DFS u pacientů s I.–III. stadiem CRC po chirurgickém odstranění nádoru. V případě karcinomu pankreatu pilotní data ukazují, že MA působí naopak jako protektivní faktor.

Práce byla podpořena granty IGA UP 2014_019, CZ.1.07/ 2.3.00/ 30.0004, NPU LO1304 a TAČR TE02000058.

XXX/ 211. Multicenter analysis of soluble Axl reveals dia­gnostic value for very early stage hepatocellular carcinoma

Reichl P.¹, Fang M.², Starlinger P.³, Staufer K.³, Nenutil R.⁴, Müller P.⁵, Greplová K.⁶, Valík D.⁵, Dooley S.⁷, Brostjan C.³, Gruenberger T.³, Shen J.⁸, Man K.⁹, Trauner M.¹, Yu J.⁸, Fang Gao CH.², Mikulits W.¹

¹ Medical University of Vienna, Austria, ² Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Shanghai, China, ³ Medical University of Vienna, General Hospital, Vienna, Austria, ⁴ Department of Oncological Pathology, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ⁵ RECAMO, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ⁶ Department of Laboratory Medicine, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ⁷ Heidelberg University, Germany, ⁸ The Chinese University of Hong Kong, China, ⁹ The University of Hong Kong, China

Background: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most frequently dia­gnosed liver malignancy and third most common cause of cancer-related mortality worldwide. If dia­gnosed at early stages, patients with hepatocellular carcinoma can receive curative therapies, whereas therapeutic options at later stages are very limited. Material and Methods: In this study, we show the potential of soluble Axl (sAxl) as a bio­marker of early HCC by analyzing levels of sAxl in 311 HCC and 237 control serum samples from centers in Europe and China. sAxl levels were determined using sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (R&D Systems Inc., USA). Results: Significantly increased median levels of sAxl were found in all HCC (18.575 ng/ ml) as compared to healthy (13.388 ng/ ml) or cirrhotic (12.169 ng/ ml) controls. Receiver operating characteristics curve analysis of sAxl in very early stage HCC patients (BCLC 0) showed an area under the curve (AUC) of 0.848, with a sensitivity of 76.9% and a specificity of 69.2%. A-fetoprotein (AFP) negative HCC patients displayed an AUC of 0.803, with sensitivity and specificity of 73% and 70.8%. Combination of sAxl and AFP improved dia­gnostic accuracy to 0.936 in very early HCC patients and to 0.937 in all HCC. Differential dia­gnosis of very early HCC versus liver cirrhosis showed a combined performance for sAxl and AFP of 0.901 with a sensitivity of 88.5% and a specificity of 76.7%. Furthermore, sAxl levels failed to be elevated in primary ovarian, colorectal and breast carcinomas as well as in secondary hepatic malignancies derived from colon. Conclusions: In summary, we report high specifity of sAxl in detecting very early HCC, as compared to AFP alone. Combination of sAxl and AFP shows high accuracy in differential dia­gnosis between HCC and hepatic cirrhosis. sAxl is suggested as a bio­marker for routine clinical use.

This study was funded by European Regional Development Fund and State budget of the Czech Republic (RECAMO: CZ 1.05/ 2.1.00/ 03.0101) and by Ministry of Education, Youth and Sports (BBMRI: LM2010004).

Published in: Reichl P et al. Multicenter analysis of soluble Axl reveals dia­gnostic value for very early stage hepatocellular carcinoma. Int J Cancer 2014. doi: 10.1002/ ijc.29394.

XXX/ 161. Možnosti vyšetřování DNA a miRNA markerů u karcinomu pankreatu z různých zdrojů bio­logického materiálu: tenkojehlová bio­psie, cytologické nátěry, tekutá bio­psie

Hálková T.¹, Benešová L.², Belšánová B.2, Chmelařová A.², Bunganič B.³, Dvořáková T.³, Zavoral M.³, Minárik M.²

¹ Endokrinologický ústav, Praha, ² Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, Praha, ³ Interní klinika 1. LF UK a ÚVN Praha

Východiska: Karcinomy pankreatu (KP) jsou charakteristické vysokou mortalitou a jejich incidence stále narůstá. V současnosti neexistují spolehlivé molekulární markery pro včasnou dia­gnostiku, určení prognózy ani predikci odpovědi na léčbu. Hledání bio­markerů komplikuje zejména skutečnost, že je jen malé množství pacientů indikováno k resekci tumoru, a dostupnost peroperačních vzorků pankreatické tkáně je tudíž limitována. Dostupnější jsou vzorky získané bio­psií tenkou jehlou pod kontrolou endoskopické ultrasonografie (EUS-FNA), které se běžně zpracovávají pro cytologická vyšetření. Tyto vzorky však obsahují minimální množství tkáně, a jejich analýza tedy vyžaduje speciální zacházení a citlivou metodiku. Nejnověji se nabízí také možnost vyšetřování molekulárních markerů z cirkulující tumorové DNA (ctDNA) ve vzorcích plazmy. Materiál a metody: Pomocí dříve zoptimalizovaných postupů jsme analyzovali vybrané molekulární markery (KRAS, miR21, miR10b, miR155) ve třech typech vzorků (FNA, cytologické nátěry, plazma) a porovnali výtěžnost jednotlivých vyšetření. 80 pacientům s potvrzeným KP byla pomocí EUS-FNA odebrána bio­psie z tumoru. Polovina odebrané tkáně byla uchována v RNA lateru a vyšetřena nativně, druhá polovina byla zpracována do cytologického nátěru. Každému pacientovi bylo dále odebráno 14 ml periferní krve pro analýzu ctDNA. Ve všech vzorcích jsme provedli detekci mutací KRAS a v případě přítomnosti mutace stanovili procentuální zastoupení mutovaných alel ve vzorku. Dále jsme ve FNA vzorcích a cytologických nátěrech sledovali hladiny exprese miR21, miR10b a miR155. Výsledky: Úspěšnost vyšetření mutací KRAS byla 100% u FNA vzorků, 95% u vzorků plazmy a 90% u cytologických nátěrů. Nejvyšší záchyt mutací jsme zaznamenali v cytologických nátěrech, nejnižší ve vzorcích plazmy. Stejně tak procentuální zastoupení mutovaných alel bylo obecně nejvyšší v cytologických nátěrech a nejnižší v plazmě. Vyšetření hladin mikroRNA byla úspěšná ve všech FNA vzorcích a ve všech cytologických nátěrech. Závěr: Výběr vhodného typu vzorku je pro analýzu molekulárních markerů klíčový. FNA vzorky sice obsahují nejvíce genetického materiálu a výtěžnost vyšetření tak dosahuje 100 %, ovšem zastoupení mutovaných (nádorových) buněk ve vzorku je mnohdy nižší než 30 %. Z tohoto pohledu jsou nejvhodnějším zdrojem bio­logického materiálu pro DNA a miRNA analýzy cytologické nátěry, kde je kontaminace nenádorovou tkání nízká. Vzorky plazmy s detekovanou KRAS mutací (25 %) lze využít zejména pro neinvazivní monitorování průběhu onemocnění.

Podpořeno grantem NT13638.

XXX/ 165. Nový potenciální bio­marker karcinomu pankreatu SLC22A3

Mohelníková-Duchoňová B.¹, Strouhal O.², Honsová E.³, Oliverius M.⁴, Hlavsa J.⁵, Mazanec J.⁶, Kala Z.⁵, Melichar B.¹, Souček P.⁷

¹ Onkologická klinika LF UP a FN Olomouc, ² FN Olomouc, ³ Pracoviště klinické a transplantační patologie, IKEM, Praha, ⁴ Klinika transplantační chirurgie, IKEM, Praha, ⁵ Chirurgická klinika LF MU a FN Brno, ⁶ Patologicko-anatomický ústav, LF MU a FN Brno, ⁷ Oddělení toxikogenomiky, SZÚ, Praha

Východiska: Membránový transportér SLC22A3 je vysoce exprimován v řadě nádorových buněčných linií, např. karcinomu kolorekta a ledvin. Ve své předchozí studii jsme prokázali zvýšenou expresi mRNA SLC22A3 v nádorové tkáni karcinomu pankreatu a zároveň vliv zvýšené exprese SLC22A3 na celkové přežívání pacientů s karcinomem pankreatu po radikální chirurgické resekci léčených v adjuvanci nukleosidovými analogy. Vzhledem k tomu, že řada endogenních metabolitů, jako lipopolysacharidy a metabolity kyseliny linolové, se účastní v procesu karcinogeneze, SLC22A3 může hrát roli v procesu vzniku nádorového onemocnění právě prostřednictvím ovlivnění transportu těchto metabolitů. Cílem projektu bylo ověření role SLC22A3 v patogenezi karcinomu pankreatu analýzou exprese proteinu v nádorové tkáni a následně stanovením SNPs SLC22A3 na vzorcích periferní krve od pacientů s karcinomem pankreatu a v kontrolní skupině. Soubor pacientů a metody: Pilotní soubor zahrnoval 208 vzorků periferní krve od pacientů s karcinomem pankreatu a 384 kontrol. Analýzou haplotypu bylo vybráno 23 SNPs pro naši pilotní studii. Tento výběr SNPs pokrývá celou oblast genu SLC22A3 včetně promotoru a regulačních oblastí. SNPs byly stanoveny pomocí real-time PCR. U 46 vzorků histologicky verifikovaného karcinomu pankreatu byla stanovena exprese proteinu SLC22A3 imunohistochemicky. Výsledky: Prokázali jsme vysokou expresi proteinu SLC22A3 v nádorové tkáni, zatímco ve tkáni pankreatu byla jeho exprese velmi nízká. V univariátní analýze SLC22A3 jako rizikového faktoru pro vznik karcinomu pankreatu bylo prokázáno statisticky zvýšené riziko rozvoje karcinomu pankreatu u homozygotních nosičů alterace v SNP rs2457571 (p = 0,031). V případě dalších tří SNPs (rs2504938, rs2504956, a rs9364554) sice byla nalezena zvýšená frek­vence mutované alely u PDAC ve srovnání s kontrolní skupinou, nicméně tento vztah nedosáhl hladiny statistické významnosti (p = 0,057–0,065). Zvýšené riziko rozvoje metastatického onemocnění bylo zjištěno u pacientů s mutovanou alelou v SNP rs7758229 (p = 0,044). Při hodnocení celkového přežívání pacientů byl u tří SNPs zjištěn zřejmý vztah ke kratší celkové době přežívaní u pacientů, kteří byli nosiči mutované alely (rs512077, rs7758229, rs2504956). Závěr: Závěrem studie je nalezení nového potenciálního bio­markeru u karcinomu pankreatu.

Práce byla podpořena grantovým projektem MZ ČR RVO 75010330.

XXX/ 231. Záchyt atypické přestavby genu ALK u pacienta s nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC)

Robešová B.¹, Bajerová M.¹, Skřičková J.², Tomíšková M.², Hausnerová J.³, Dvořáková D.¹

¹ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, ² Klinika nemocí plicních a TBC LF MU a FN Brno, ³ Ústav patologie, LF MU a FN Brno

Východiska: V cílené terapii NSCLC se kromě inhibitorů EGFR uplatňují nově inhibitory dalších tyrozinkináz. Crizotinib (Xalkori) je selektivní inhibitor ALK (anaplastic lymphoma kinase) a jejích onkogenních variant (ALK fúze a vybrané ALK mutace), který je v ČR hrazen od roku 2014 pro léčbu nemocných s již dříve léčeným pokročilým NSCLC s pozitivním průkazem EML4-ALK. Přestavba genu ALK je významným prediktorem úspěšnosti terapie, a proto její průkaz validovanou metodou je nezbytný pro podání crizotinibu. Mezi standardní metody průkazu patří metody imunohistochemické (IHC) a fluorescenční in situ hybridizace (FISH), lze ale použít i molekulárněbio­logické metody (RT-PCR). Popis případu: U 61letého pacienta, nekuřáka, byl v březnu 2014 dia­gnostikován NSCLC, adenokarcinom, klinické stadium IIIB. Dia­gnóza byla potvrzena cytologicky z bronchoskopické excize. Přes léčbu dvěma liniemi chemoterapie došlo k rychlé klinické, endobronchiální a CT progresi (stadium IV), v srpnu 2014 byla znovu provedena bronchoskopická bio­psie. Mutační analýza EGFR byla negativní, přestavba ALK byla zachycena FISH a IHC, molekulárněbio­logická analýza odhalila několik variant EML4-ALK. Vedle EML4-ALK (varianta 3a/ b) byla potvrzena také varianta EML4-ALK s inzercí části genu ATRNL1 (attractin-like 1). Vzhledem k přítomnosti přestavby genu ALK byla u pacienta zahájena terapie crizotinibem ve třetí linii. Došlo k výraznému zlepšení klinického stavu pacienta, RTG vyšetření po pěti týdnech potvrdilo parciální remisi. Materiál a metody: Pro IHC byla použita protilátka D5F3 (Cell Signaling Technology), FISH byla provedena pomocí ZytoLight Spec ALK/ EML4 TriCheck probe (ZytoVision). RNA byla izolována z nádorové tkáně (FFPE) pomocí RNeasy FFPE Kit (Qiagen). Pro přepis RNA do cDNA byla použita SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Přestavba EML4-ALK byla testována end-point RT-PCR a real-time RT-PCR podle dříve publikované práce (Robešová et al, Lung Cancer 2014; 85: 25–30). Zlomová oblast byla ověřena sekvenováním. Závěr: Pro analýzu genu ALK bylo použito několik metod. Výsledky FISH, IHC a RT-PCR potvrdily přestavbu ALK. RT-PCR prokázala heterogenitu nádorové tkáně, bylo detekováno několik sestřihových variant fúze EML4-ALK. Sekvenace klonovaného amplikonu prokázala inzerci části genu ATRNL1 mezi geny EML4 a ALK. Podobný typ ALK přestavby dosud nebyl u NSCLC publikován. Vzhledem k pozitivní terapeutické odpovědi lze předpokládat, že atypická přestavba EML4-ALK s inzercí ATRNL1 neovlivnila citlivost nádorových buněk ke crizotinibu a nesnížila účinnost inhibitoru.

XXX/ 244. Identifikace prognostických a prediktivních faktorů u pacientů s nemalobuněčným karcinomem plic léčených v adjuvantním režimu chemoterapie

Potočková J.¹, Trojanec R.¹, Drábek J.¹, Stránská J.¹, Vrbková J.¹, Koudeláková V.¹, Mlčochová S.¹, Crlíková Z.¹, Grygárková I.², Hajdúch M.¹

¹ Laboratoř experimentální medicíny, Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci, ² Klinika plicních nemocí a TBC LF UP a FN Olomouc

Východiska: Karcinomy plic představují v ČR jednu z nejčastějších skupin nádorů vůbec a lze je rozdělit podle několika kritérií, jako je bio­logické chování nádoru, histologické složení či lokalizace do několika skupin. Pro praxi má však největší význam dělení na malobuněčný karcinom SCLC (asi 20–25 %) a nemalobuněčný karcinom NSCLC (75–80 %). NSCLC obvykle vykazuje ve srovnání s SCLC nižší proliferaci, takže v praxi bývají příznivější možnosti chirurgického odstranění za předpokladu, že nádor již nevytvořil metastatická ložiska. Na protinádorovou léčbu cytostatiky a radioterapii reaguje o něco hůře než SCLC. I proto se stal NSCLC předmětem naší práce. Materiál a metody: V naší studii byl vyšetřován soubor 124 pacientů s NSCLC, léčených v adjuvantním režimu kombinací derivátů platiny s vinorelbinem. V tomto souboru byla zastoupena klinická stadia IB (27,9 %), IIA (22,1 %), IIB (21,3 %) a IIIA (28,7 %). Nejčastěji zastoupeným histologickým typem nádoru byl non-adenokarcinom (56,2 %), méně často adenokarcinom (30,6 %) a nejméně často spíše-adenokarcinom (13,2 %). Jako materiál byly použity parafinové řezy. Metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) byl vyšetřen status genů EGFR, FGFR1, c-MET, přítomnost přestaveb v genech ALK a ROS1 a počet kopií chromozomů 7 a 8. Byla provedena statistická analýza klinických a laboratorních výsledků, jako kontrolní byl použit soubor 65 NSCLC pacientů bez léčby. Dle histologické klasifikace nádorů byl nejčastěji zastoupeným histologickým typem nádoru adenokarcinom (60 %), méně častým non-adenokarcinom (38,3 %) a nejméně častým spíše-adenokarcinom (1,7 %). Výsledky a závěr: Byly provedeny prvotní analýzy, přičemž získaná klinická data byla korelována s laboratorními výsledky vyšetření výše zmiňovaných markerů pomocí programu STATISTIKA. Z předběžných dat vyplývá, že mezi adjuvantní a kontrolní skupinou pacientů léčenou pouze chirurgicky není z hlediska celkového přežívání (OS) statisticky významný rozdíl. Zajímavé je zjištění, že polyzomie chromozomu 8 je spojena s horší prognózou z hlediska cancer-specific survival (CSS) u adjuvantně léčených pacientů. Obdobně můžeme konstatovat, že translokace ROS1 je spjata s horší prognózou pro OS a disease-free survival (DFS) u téže skupiny pacientů, avšak tato skutečnost je podložena příliš nízkým počtem pozorování a bude aktualizována po rozšíření sledované kohorty pacientů. V současné době dále pokračujeme na vyšetřování a výsledky budou prezentovány.

Tato práce byla podpořena grantovými projekty IGA MZ ČR NT/ 13569 a BIOMEDREG CZ.1.05/ 2.1.00/ 01.0030.

XXX/ 214. Glykanové profilování sér pacientek s rakovinou vaječníku senzitivních na léčbu platinovými deriváty

Zahradníková M.¹, Nenutil R.², Vojtěšek B.¹, Novotný M.¹, Hernychová L.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno

Východiska: Glykanové profilování se zabývá analýzou glykanů (oligosacharidových struktur). Změny v glykanovém profilu hrají důležitou roli v bio­chemických procesech v těle a současně mohou informovat o vzniku onemocnění, případně jeho progresi. Dia­gnózu „rakovina vaječníku“ si každoročně vyslechne téměř čtvrt milionu žen a 140 000 jí ročně podlehne, což z ní činí sedmou nejčastější rakovinu u žen na světě. Chemoterapeutická léčba platinovými deriváty představuje stále jednu z nejúčinnějších variant léčby, ale často dochází ke vzniku rezistence, kterou není možné před podáním léčby zjistit. Materiál a metody: Pro glykanové profilování bylo použito 2,5 µl séra od pěti pacientek senzitivních na léčbu platinovými deriváty srovnané s pěti séry odebíranými při preventivních prohlídkách. Glykanové profilování zahrnovalo denaturaci proteinů v séru, štěpení, purifikaci glykanů přes grafitové kolonky, permetylací byla usnadněna ionizace glykanů. Vzorky byly dále měřeny hmotnostním spektrometrem MALDI TOF/ TOF MS (Apllied Biosystems) v reflektorovém módu. Získaná data byla normalizována a statisticky vyhodnocena za použití jednorozměrné ANOVY. Výsledky: Po statistickém vyhodnocení dat z hmotnostních spekter byly nalezeny čtyři signifikantně odlišné glykanové struktury s efektivní hmotností 1922,9933 m/ z (p < 0,0033), 2097,0825 m/ z (p < 0,006), 2260,1558 m/ z (p < 0,01) a 2662,3560 m/ z (p < 0,0005). Současně bylo nalezeno šest dalších glykanových struktur, jejichž statistické odchylky se pohybují v rozmezí p < 0,091–0,08, což je řadí k dalším potenciálně nadějným strukturám. Závěr: Výsledky studie obsahují statisticky významně odlišné glykanové struktury nalezené v sérech pacientek s nádorem vaječníku. Tato studie bude pokračovat analýzou glykanových struktur v sérech pacientek rezistentních na léčbu platinovými deriváty. Získané výsledky budou validovány na větších souborech pacientek. V budoucnosti na tomto poznání bude možné adekvátně indikovat léčbu u pacientek, které z ní budou jednoznačně profitovat, a na straně druhé nepodávat léčbu v případech, kdy účinná nebude. Výsledky práce budou mít přímý dopad na běžnou klinickou praxi.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101), státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a IGA NT/ 13794-4/ 2012.

XXX/ 157. Močové miRNA jako potenciální bio­markery uroteliálního karcinomu močového měchýře

Juráček J.¹, Mlčochová H.², Peltanová B.³, Slabý O.³

¹ Masarykův onkologický ústav, Brno, ² Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ³ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiska: Uroteliální karcinom močového měchýře (UKMM) se řadí mezi nejčastější maligní onemocnění urinárního systému. Běžně je dělen na sval invadující (muscle-invasive) a povrchový sval neinvadující (superficiální) karcinom, který zaujímá přibližně 80 % všech případů. Přes relativně vysoký výskyt superficiálních tumorů je uroteliální karcinom močového měchýře asociován s častou progresí v invazivní formu, ke které dochází u více než 20 % případů. Přestože cystoskopie zůstává hlavní technikou v detekci a sledování pacientů s karcinomem močového měchýře, v případě karcinomu in situ nebo příliš malé nádorové léze může být malignita lehce přehlédnuta. Navzdory vývoji nových technologií a urinárních testů není však v současnosti k dispozici dostatečně senzitivní bio­marker, který by odrážel bio­logické vlastnosti karcinomu a případně umožnil časnou detekci relapsu, který nastává až u 70 % povrchového karcinomu. Požadavkům na takové bio­markery by mohly vyhovovat močové mikroRNA (miRNA), které vykazují velmi vysokou stabilitu a dobré analytické vlastnosti. Materiál a metody: Za použití Affymetrix miRNA mikroarray jsme analyzovali expresní profily 1 733 miRNA v močovém supernatantu 16 pacientů s UKMM (6 invazivní, 5 high-grade neinvazivní, 5 low-grade neinvazivní), 17 zdravých kontrol, 10 pacientů s RCC a 4 pacientů s infekcí močového traktu. Schopnost vybraných močových miRNA identifikovat UKMM a odlišit jeho jednotlivé formy byla potvrzena během validační fáze na nezávislém souboru 80 pacientů za použití metody qRT-PCR. Výsledky: Globální profilování genové exprese odhalilo sadu 76 miRNA, které byly významně rozdílně exprimovány v moči pacientů s UKMM (p < 0,01) v porovnání se zdravými kontrolami, z toho 64 mělo snížené hladiny a 12 hladiny snížené. Zároveň tyto miRNA vykazovaly vysokou specificitu i při srovnání s dalšími kontrolními kohortami (RCC, infekce). Kromě toho jsme identifikovali 23 miRNA schopných rozlišit invazivní a povrchovou formu UKMM (p < 0,01) a 18 miRNA, jejichž exprese umožnila odlišit low-grade a high-grade neinvazivní formu UKMM (p < 0,01). Následná validace na větší nezávislé kohortě pacientů vedla k sestavení sady miRNA umožňující s vysokou specificitou a senzitivitou dia­gnostikovat UKMM z moči. Závěr: Naše data ukázala, že močové mikroRNA mohou sloužit jako senzitivní a specifické bio­markery uroteliálního karcinomu močového měchýře a po nezávislé validaci na prospektivně sbíraných vzorcích by jejich analýza mohla vhodně navýšit senzitivitu standardního cytologického vyšetření.

Práce vznikla za podpory IGA MZCR: NT/ 13860-4/ 2012 a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 212. Analýza vlivu působení inhibitorů autofagie na metastatickou prostatickou nádorovou linii PC-3

Štěpka P.¹, Balvan J.¹, Gumulec J.¹, Sztalmachová M.¹, Hudcová K.¹, Raudenská M.¹, Babula P.², Kizek R.³, Adam V.³, Masařík M.¹

¹ Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ² Fyziologický ústav, LF MU, Brno, ³ Ústav chemie a bio­chemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Autofagie je proces zajišťující degradaci vnitrobuněčného materiálu. Plní důležitou roli v řadě fyziologických i patologických dějů a její deregulace je častým jevem u nádorových onemocnění. V závislosti na okolnostech může vznik a růst nádorů potlačovat nebo podporovat. V současnosti je aktivně zkoumána možnost využití inhibitorů autofagie v kombinaci s běžnými chemoterapeutiky pro zvýšení účinnosti léčby. Nejčastěji používané inhibitory, jakými jsou např. 3-metyladenin (3-MA) nebo bafilomycin (Baf), mají ale relativně nízkou specifitu účinku a ovlivňují kromě autofagie i jiné procesy a viabilitu buněk. Proto je třeba k jejich užívání přistupovat obezřetně a se znalostí jejich vlivu na celkový stav buněk. V tomto experimentu jsme se soustředili na analýzu morfologických znaků typických pro jednotlivé buněčné procesy (autofagie, nekróza, polyploidita) pomocí inverzní mikroskopie a průtokové cytometrie. Materiál a metody: Testovali jsme vliv 3-MA a Baf na buňky prostatické nádorové linie PC-3 v průběhu času. Pomocí MTT testu jsme stanovili hodnoty IC50 použitých látek (3-MA, Baf). S použitím inverzní mikroskopie jsme analyzovali změny v morfologii buněk po působení inhibitorů autofagie v čase. Podíl buněk exponujících fosfatidylserin na vnější straně buněčné membrány a počet nekrotických buněk jsme stanovili pomocí průtokové cytometrie za použití barvení Annexinem V a propidium jodidem. Průtoková cytometrie byla použita také pro stanovení počtu buněk pozitivních na přítomnost LC-3 proteinu (potenciálně autofagické buňky). Výsledky: Při pozorování inverzním mikroskopem jsme zjistili procentuální zastoupení jednotlivých morfologických typů buněk po působení 3-MA a Baf, jejich vývoj v časech 4, 8 a 24 hod a následně jsme je porovnali s daty z měření průtokovou cytometrií. Po působení látek prostatické nádorové buňky PC-3 vykazovaly známky stresu a mírně sníženou viabilitu, významná část populace ale byla i nadále schopna dalšího dělení. Závěr: Získaná data dávají podklady pro další postup výzkumu a volbu správných koncentrací pro inhibici protektivní autofagie nádorových buněk ovlivňovaných chemoterapeutiky. Kombinovaná terapie nabízí možnost užití nižších dávek různých látek pro vyšší účinek s menšími nežádoucími efekty.

Práce byla podpořena projekty MUNI/ A/ 1549/ 2014 a projektem pro koncepční rozvoj výzkumné organizace (LF MU ROZV/ 24/ LF5/ 2014).

XXX/ 219. Mechanizmy rezistence modelu karcinomu prostaty s dlouhodobým působením zinku

Holubová M.¹, Gumulec J.², Balvan J.², Sztalmachová M.², Raudenská M.², Nováková M.¹, Masařík M.²

¹ Fyziologický ústav, LF MU, Brno, ² Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno

Východiska: Vztah mezi zinkem a karcinomem prostaty je studován již řadu let. Obecně se zinečnaté ionty zapojují do mnoha intracelulárních procesů u všech lidských buněk. U rozvoje karcinomu prostaty je však unikátní jejich významný úbytek během maligní transformace. Jednou z konsekvencí je paradox odblokování citrátového cyklu a následné vyšší množství energie pro nádorové buňky než pro zdravou tkáň. Zinek je považován za protektivní agens proti vzniku malignit, zejména prostaty. Jeho krátkodobé působení vyvolává u buněk karcinomu prostaty apoptózu in vitro i in vivo. Pro lepší pochopení těchto vztahů byl vytvořen model zinek rezistentních buněk odvozených od karcinomu prostaty i nenádorové tkáně. Na tomto modelu bylo popsáno, že při dlouhodobém působení zinečnatých iontů dochází k posunu fenotypu k více agresivním buňkám. Do tvorby rezistence jsou zapojeny odlišné geny než do krátkodobé adaptace a výsledkem jsou komplexní změny vlastností. Do mechanizmů rezistence může být také zapojen proces autofagie, zároveň pozměněná morfologie buněk naznačuje výskyt mitotické katastrofy a vyšší frekvence polyploidie. Materiál a metody: V experimentu byly použity prostatické linie PC-3 (z kostní metastázy), PNT1A (ze zdravé tkáně) a 22Rv1 (z primárního karcinomu). Buňky byly trvale kultivovány v odpovídajícím médiu s požadovanou koncentrací zinečnatých iontů (Zn2SO4). Následně byla pomocí Real-time-PCR stanovena relativní exprese vybraných genů. Vyhodnocení bylo provedeno metodou ddCt. Buňky byly také obarveny fluorescenční sondou CytoID a na průtokovém cytometru bylo analyzováno množství autofagických buněk. Výsledky byly hodnoceny v SW Statistica 12, hladina p < 0,05 byla považována za signifikantní. Výsledky: Použité linie byly viabilní v koncentracích zinku odpovídajícím 1-, 2- a 3násobkům jejich běžné IC50. Po porovnání exprese byly zjištěny signifikantní rozdíly v expresi genů zapojených do metabolizmu kovů i autofagie. Mezi nejdůležitější geny pro krátkodobou adaptaci patří MT2A, naopak na vzniku rezistence se podílí k-RAS a NF-kB. Počet velkých, mnohojaderných buněk rostl spolu s koncentrací zinku. Zároveň výsledky z průtokové cytometrie naznačují, že autofagie se na dlouhodobé rezistenci již významně nepodílí. Závěr: Objasnění komplexních dějů podílejících se na vzniku rezistence u těchto buněk bude předmětem dalšího výzkumu. Současné výsledky ukazují, že dlouhodobé užívání zinku může mít významné následky např. při léčbě karcinomu.

Práce byla podpořena grantovými projekty MUNI/ A/ 1326/ 2014, CEITEC CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0068 a doc CEITEC 02/ 2012 (JG).

XXX/ 237. Exprese PIWIL proteinů a piR-651 u pacientů s renálním karcinomem

Iliev R.¹, Staník M.², Doležel J.², Fedorko M.3, Pacík D.³, Poprach A.⁴, Slabý O.⁵

¹ Masarykův onkologický ústav, Brno, ² Oddělení urologické onkologie, MOÚ, Brno, ³ Urologická klinika LF MU a FN Brno, ⁴ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, 5 CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Proteiny PIWIL patří do rodiny argonautových proteinů, která zahrnuje proteiny PIWIL1, PIWIL2, PIWIL3 a PIWIL4. Tyto proteiny jsou převážně exprimovány v zárodečné linii. Exprese proteinů PIWIL je také společná mnoha typům nádorů. PIWIL1 je spojován s proliferací nádoru žaludku, PIWIL2 pak s antiapoptotickou signalizací u několika typů nádorů. Ukazuje se, že hladiny exprese PIWIL proteinů mohou korelovat s klinickými parametry a s horší prognózou u pacientů s nádorem prsu, cervixu, vaječníku a střev. Proteiny PIWIL se podílejí na vzniku krátkých RNA, tzv. piRNA. PiRNA jsou krátké jednořetězcové RNA o délce 26–31 nukleotidů. Změněná exprese piRNA byla pomocí sekvenačních a čipových technologií zjištěna u nádorů prsu a žaludku. V naší studii jsme k analýzám vybrali kromě PIWIL proteinů ještě piR-651, jejíž deregulovaná exprese byla zjištěna u různých typů nádorů. Ve studii byla použita nádorová a příslušná nenádorová tkáň 56 pacientů s renálním karcinomem. Z tkání byla izolována celková RNA a pomocí metody RT-qPCR byla zkoumaná exprese proteinů PIWIL a piR-651. Pro analýzu sérové piR-651 jsme použili soubor 100 pacientů s renálním karcinomem (RCC) a 75 sér od zdravých dárců. Provedli jsme srovnání hladin studovaných RNA mezi nádorovou a nenádorovou tkání a korelovali je s klinicko-patologickými daty (stage, grade, DFS, OS) pacientů. Analýzou hladin RNA jsme zjistili významný rozdíl v expresních hladinách piR-651 a PIWIL1 u párových vzorků mezi nenádorovou a nádorovou tkání. U hladin exprese PIWIL2, PIWIL3 a PIWIL4 jsme statisticky významné rozdíly nepozorovali. Hladiny PIWIL2 a PIWIL4 se však u pacientů významně korelovaly s jejich stagem a gradem. U analyzované piR-651 nebyla pozorována korelace se stagem a gradem. Byla však nalezena korelace mezi vyšší hladinou PIWIL1, piR-651 a delším celkovým přežitím. U sérové piR-651 byla zjištěna signifikantně snížená exprese pacientů s RCC (p < 0,0001). V naší studii jsme analyzovali expresi proteinů PIWIL a piR-651 v nádorové a nenádorové tkáni pacientů s RCC. Také jsme analyzovali sérovou piR-651 v séru pacientů s RCC a v kontrolní skupině. Pomocí analýzy této sérové piRNA jsme získali slibný bio­marker, který by mohl po další validaci sloužit v budoucnu jako marker při v dia­gnostice RCC. Po podrobnějším objasnění její role v patogenezi RCC by piR-651 mohla sloužit jako vhodný terapeutický cíl.

Tato studie byla podpořena grantem IGA MZČR NT13547-4/ 2012 a Institucionálními zdroji pro Podporu výzkumných organizací poskytnutou Ministerstvem zdravotnictví České republiky v roce 2012.

XXX/ 239. Charakterizace exprese epiteliálních a mezenchymálních markerů zapojených do procesu EMT u pacientů s renálním karcinomem

Mlčochová H.¹, Héžová R.², Macháčková T.¹, Lojová M.¹, Poprach A.², Lakomý R.², Fabián P.³, Svoboda M.², Vyzula R.², Slabý O.¹

¹ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno^{, 3} Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno

Východiska: Renální karcinom (RCC) je nejčastějším nádorovým onemocněním ledvinného parenchymu a představuje přibližně 3 % zhoubných nádorů dospělé populace. Jedním z klíčových procesů v patogenezi nádorových onemocnění, včetně renálního karcinomu, je proces epiteliálně mezenchymální tranzice (EMT). V rámci EMT dochází k přeměně epiteliálních buněk na více motilní a invazivní buňky mezenchymální doprovázené narušenou regulací buněčných funkcí. Pozměněná exprese epiteliálních a mezenchymálních markerů je jednou z kauzálních událostí v kancerogenezi. Charakterizace a specifikace deregulovaných markerů zaujímá výsadní roli v procesu EMT u RCC. V naší práci jsme se zaměřili na identifikaci proteinů asociovaných s procesem EMT sloužící k pochopení procesu metastazování u RCC. Materiál a metody: Pomocí imunofluorescenční charakterizace (IF) byly studovány jednotlivé markery zapojené do procesu EMT (n = 73; tkáně fixované formalínem a uchované v parafínových blocích, FFPE). K analýzám byly využity epiteliální (E-kadherin, cytokeratin-18, cytokeratin-19) a mezenchymální markery (N-kadherin, vimentin, S100A4, MMP-9, MMP-14, alpha-SMA, ZEB-1), v literatuře hojně diskutované s procesem EMT. Exprese jednotlivých markerů byla hodnocena za využití skórovacího systému (intenzita barvení (0–3) + počet pozitivních buněk (0–3, treshold 5 %, 25 %, 75 %). Celkové skóre tvořil součet obou hodnot: intenzita barvení + počet pozitivních buněk přítomných v nádorové tkáni (≤ 3 slabá exprese, > 3 silná exprese). Expresní hladiny jednotlivých markerů byly porovnávány pomocí Mann-Whitney U testu a Kruskal-Wallis testu a následně integrovány s klinicko-patologickými daty. Výsledky: Analýzou párových vzorků (n = 22) byla pozorována signifikantně zvýšená hladina exprese E-kadherinu (p = 0,0088), CK-18 (p = 0,0014) a CK-19 (p = 0,0148) u zdravé tkáně v porovnání s tkání nádorovou. Překvapivě při studiu mezenchymálních markerů byla pozorována také signifikantně zvýšená hladina MMP-9 (p = 0,001) a alpha-SMA (p = 0,0043) ve zdravé tkáni. Dále byla pozorována zvýšená hladina exprese ZEB-1 v závislosti na vyšším stupni pT (pT1,T2 vs. pT3,T4; p = 0,0382). S využitím skórovacího systému byly dále vzorky rozděleny do dvou podskupin (vzorky se slabou vs. silnou expresí). E-kadherin (74 %, 26 %), CK-18 (54,8 %, 45,2 %), CK-19 (37 %, 63 %), N-kadherin (86,3 %, 13,7 %), vimentin (30,1 %, 69,9 %), S100A4 (15,1 %, 84,9 %), MMP-9 (84,1 %, 15,1 %), MMP-14 (52,1 %, 47,9 %), alpha-SMA (90,4 %, 9,6 %), ZEB-1 (56,2 %, 43,8 %). Toto rozdělení bude v další fázi studie sloužit k rozdělení pacientů na EMT+/ EMT–.

Podpořeno IGA MZ NT-13547-04/ 2012, DAAD a Stiftung Urologische Forschung.

XXX/ 210. Charakterizace buněčných subpopulací v primárních kulturách odvozených ze spinocelulárních karcinomů hlavy a krku

Sztalmachová M.¹, Polanská H.², Gumulec J.¹, Balvan J.¹, Binková H.³, Horáková Z.³, Kostřica R.³, Feith M.¹, Zítka O.⁴, Masařík M.¹

¹ Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ² CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku LF MU a FN u sv. Anny v Brně, ⁴ Ústav chemie a bio­chemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Spinocelulární karcinomy představují 90 % všech nádorů oblasti hlavy a krku. Tumor může obsahovat několik subpopulací buněk. Ně­kte­ré z těchto subpopulací mohou mít charakter nádorových kmenových buněk. Roli v kancerogenezi mohou hrát též fibroblasty asociované s nádorem (CAFs). Glykoprotein CD44 se podílí na mezibuněčných interakcích, migraci a buněčné adhezivitě. Studie naznačují, že populace nádorových buněk imunohistochemicky pozitivních na CD44 je zodpovědná za rezistenci nádoru a mohla by sloužit jako marker nádorových kmenových buněk. CD44 receptor exprimovaný na CAFs byl také určen jako funkční molekulou podporující rezistenci nádorových buněk. Cílem bylo porovnat invazivitu, migraci a růstové charakteristiky buněčných subpopulací a také expresi vybraných genů souvisejících s patogenezí HNSCC. Materiál a metody: Při zakládání primokultur byl použit protokol, který využíval kombinace mechanické disagregace a působení trypsinu. Z každého vzorku byly vyseparovány čtyři různé buněčné subpopulace. K separaci byly použity magnetické separační sady od firmy Miltenyi Biotec. Byly vyselektovány čtyři linie: CD44+/ CD90+; CD44+/ CD90–; CD44–/ CD90+; CD44–/ CD90–. Pomocí qRT-PCR byla stanovena exprese vybraných genů. Pomocí systému xCELLigence byly určeny růstové charakteristiky subpopulací a jejich migrace a invazivita. Schopnost indukce tumoru byla ověřena na myším modelu. Výsledky: Byly vyselektovány čtyři subpopulace buněk. Výsledky xCELLigence prokázaly rozdíly v růstových charakteristikách sledovaných subpopulací. CD44+/ CD90– subpopulace byla schopná indukovat tumor v imunodeficientním myším modelu. Subpopulace se lišily též v expresi genů. EGFR a MMP2 byly nejvíce exprimované v CD44+/ CD90– subpopulaci. Gen pro MT2 byl nejvíce exprimován v subpopulacích CD44+/ CD90– a CD44+/ CD90+. Závěr: Charakterizace různých subpopulací buněk vyskytujících se uvnitř tumoru by mohla přinést zásadní poznatky a pokrok v cílené léčbě nádorového onemocnění hlavy a krku.

Práce byla podpořena projektem IGA MZ NT 14337-3/ 2013.

XXX/ 218. Nová varianta RET/ PTC1ex9 přeskupení nalezená u dětského pacienta s agresivním papilárním karcinomem štítné žlázy

Dvořáková Š.¹, Hálková T.¹, Sýkorová V.¹, Václavíková E.¹, Včelák J.¹, Řeboun M.², Sýkorová P.³, Vlček P.³, Katra R.⁴, Kodetová D.⁵, Bendlová B.¹

¹ Endokrinologický ústav, Praha, ² Ústav dědičných metabolických poruch, 1. LF UK a VFN v Praze, ³ Klinika nukleární medicíny a endokrinologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ⁴ Klinika ušní, nosní a krční 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ⁵ Ústav patologie a molekulární medicíny, 2. LF UK a FN v Motole, Praha

Východiska: Papilární karcinom (PTC) je nejčastějším typem maligních nádorů štítné žlázy, jejichž incidence stále stoupá i u pediatrických pacientů. Z genetického hlediska se na vzniku PTC podílí hlavně mutace v genu BRAF, v genech RAS a RET/ PTC přeskupení, které je nalézáno asi u 20 % pacientů. Zde dochází k fúzi tyrozinkinázové domény RET protoonkogenu s dalším běžně exprimovaným genem. Výsledkem je stálá exprese chimérního proteinu RET/ PTC. RET/ PTC přeskupení jsou detekována zejména u mladších pacientů s historií ozáření ionizujícím zářením. Dodnes bylo popsáno 11 fúzních partnerů tvořících s RET proto­onkogenem 15 různých RET/ PTC přeskupení. RET/ PTC1 je nejčastější formou, kde je fúzován 1. exon genu CCDC6 s 12. exonem RET protoonkogenu. Zde popisujeme novou variantu RET/ PTC1 přeskupení nazvanou RET/ PTC1ex9. Popis případu: Osmiletému chlapci po zjištění bulky na krku a suspektní FNAB byla provedena totální tyreoidektomie. Histologicky byla nalezena klasická varianta PTC v téměř celém levém laloku štítné žlázy, metastázy byly nalezeny i v pravém laloku. Karcinom prorůstal přes pouzdro štítné žlázy do okolí a hrtanových chrupavek. Bylo odebráno 16 lymfatických uzlin, z nichž ve 13 byly nalezeny metastázy karcinomu. Při dia­gnostické scintigrafii byly objeveny vzdálené plicní metastázy. Pacient je již po pěti dia­gnosticko-terapeutických pobytech s aplikací 131I. Všechny analýzy byly provedeny se souhlasem zákonného zástupce dítěte. Ze zamražené nádorové tkáně byla izolována DNA a RNA, z periferní krve DNA. RNA byla reverzní transkripcí převedena na cDNA. RET/ PTC1 detekce byla provedena pomocí real-time PCR s následnou analýzou teploty tání, kde byl nalezen odlišný průběh křivky oproti klasickému RET/ PTC1. Toto neobvyklé přeskupení bylo ověřeno kapilárním sekvenováním a sekvenováním nové generace (NGS), navíc za použití různých kombinací primerů, a odhalilo fúzi 1. exonu CCDC6 genu s 9. exonem RET genu spolu s následujícím 12. exonem RET genu, proto jsme jej označili RET/ PTC1ex9. Toto zvláštní přeskupení vysvětlujeme alternativním sestřihem 10. a 11. exonu, kde jsme nalezli somatickou 32bp deleci na hranici 11. exonu a intronu. Závěr: Nalezli jsme novou, delší a atypickou RET/ PTC1ex9 variantu u dětského pacienta s agresivním PTC. Na jejím vzniku se podílí přeskupení a také alternativní sestřih v RET genu. Je to první popsané RET/ PTC přeskupení, kde se zlom nalézá již v extracelulární části RET proto-onkogenu.

Práce byla podpořena grantem IGA MZ ČR NT/ 13901-4 a MZ ČR – RVO (Endokrinologický ústav, Praha, Česká republika, 00023761).

XXX/ 222. Detekce genetických změn u sporadického medulárního karcinomu štítné žlázy s využitím NGS panelu

Sýkorová V.¹, Dvořáková Š.¹, Včelák J.¹, Václavíková E.¹, Kodetová D.², Laštůvka P.³, Betka J.³, Vlček P.⁴, Sýkorová P.⁴, Bendlová B.¹

¹ Endokrinologický ústav, Praha, ² Ústav patologie a molekulární medicíny, 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ³ Klinika ORL a chirurgie hlavy a krku 1. LF UK a FN v Motole, Praha, ⁴ Klinika nukleární medicíny a endokrinologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha

Východiska: Medulární karcinom štítné žlázy (MTC) se vyskytuje ve familiární nebo sporadické formě. Hlavní genetickou příčinou MTC jsou mutace v RET protoonkogenu, které se vyskytují u téměř všech familiárních MTC, ovšem pouze u poloviny sporadických MTC. U části sporadických RET-negativních MTC byly objeveny mutace v genech RAS, přesto stále zůstává část těchto karcinomů bez známé genetické příčiny. Proto jsme se zaměřili na hledání nových genetických změn v jiných nádorových genech za pomoci sekvenování nové generace (NGS). Materiál a metody: Z čerstvě zamražených tkání 27 sporadických MTC byla izolována DNA a použita na přípravu NGS knihoven pomocí TruSight Tumor panelu (Illumina). Tento panel je zaměřen na 175 exonických oblastí ve 26 nádorových genech. Vzorky byly sekvenovány na přístroji MiSeq (Illumina). Nalezené varianty byly analyzovány softwarem MiSeq Reporter a vyhodnoceny v programu Illumina VariantStudio. V panelu nebyly zahrnuty geny RET a HRAS, proto byly sekvenovány samostatně na kapilárním sekvenátoru CEQ 8000 (Beckman Coulter). Výsledky: Mutace v genu RET byly detekovány u 12 pacientů – u 8 pacientů byla nalezena mutace Met918Thr v 16. exonu a u 4 pacientů mutace v 10. a 11. exonu (Cys618Ser, Cys620Ser, Cys630Ser a 628-632del). U 4 pacientů byly nalezeny mutace v 13. a 61. kodonu genu HRAS. Pomocí NGS panelu byly u 3 MTC pacientů detekovány mutace v 12. a 61. kodonu genu KRAS. U pacienta s mutací Gln61Arg v genu HRAS jsme dále nalezli zatím nepopsanou záměnnou mutaci Thr273Asn v genu receptoru pro hepatocytární růstový faktor – MET. Kromě tohoto pacienta se žádné nalezené mutace nevyskytovaly u jednoho pacienta zároveň. Závěr: V našem souboru sporadických MTC jsme genetickou příčinu detekovali celkem u 19 pacientů (70,3 %) – u 12 pacientů mutace RET (44,4 %) a u 7 pacientů mutace RAS (25,9 %). Kromě těchto známých mutací jsme objevili neznámou variantu v konzervované sekvenci genu MET. Tato změna byla programy SIFT a PolyPhen-2 vyhodnocena jako potenciálně patogenní a bude dále ověřována. U osmi pacientů se stále nepodařila odhalit genetická příčina vzniku MTC, a proto bude třeba testovat další potenciální geny zapojené v karcinogenezi těchto nádorů.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR NT/ 13901-4 a MZ ČR – RVO (EÚ, 00023761).

XXX/ 217. Ovlivnění epidermálních keratinocytů nádorovými melanocyty in vivo a in vitro

Kodet O.¹, Dvořánková B.², Štork J.¹, Kolář M.³, Strnad H.³, Smetana K.²

¹ Dermatovenerologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze, ² Anatomický ústav, 1. LF UK v Praze, ³ Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i., Praha

Východiska: Komplexní nádorové mikroprostředí podobně jako u jiných nádorů může v případě maligního melanomu hrát významnou úlohu. V oblasti nodulárních melanomů se nachází až pseudohyperplazie epidermis. Tato studie byla zaměřena na vliv nádorových melanocytů (NM) na keratinocyty v okolí nádoru in vivo, tak i na ovlivnění fenotypu normálních keratinocytů prostřednictvím NM in vitro. Materiál a metody: Bioptické vzorky maligního melanomu jsme porovnali s in vitro modelem, ve kterém byly ko-kultivovány epidermální keratinocyty s NM, zdravými neonatálními melanocyty a kmenovými buňkami z neurální lišty (NCSC). Provedli jsme imuno­histochemickou analýzu specifických keratinů odpovídající diferenciaci keratinocytů a následně pomocí mikročipové analýzy ILLUMINA a RT-PCR jsme určili specifické proteiny odpovědné za tento efekt. Vliv detekovaných proteinů byl následně ověřen kultivačním experimentem. Výsledky: Práce ukázala schopnost NM a NCSC indukovat expresi keratinu 8, 14 a 19 in vitro. Tato pozorování byla podobná i v případě analýzy bio­ptických vzorků melanomu, kde hyperplastický epitel v okolí nádoru vykazoval atypickou pozitivitu keratinů (K10, K14). Analýza expresního profilu studovaných linií ukázala zvýšenou expresi chemokinů (CXCL-1, IL-8) a růstových faktorů (FGF-2, VEGF-A). Jejich přidání do kultivačního média vyvolala podobné změny v kultivovaných keratinocytech. Závěr: NM včetně NCSC jsou schopny ovlivnit diferenciaci keratinocytů in vitro. Produkce CXCL-1, IL-8, FGF-2 a VEGF-A nádorovými melanocyty je odpovědná za pseudohyperplastický epitel v okolí nodulárních melanomů. Tato pozorování podporují význam mezibuněčných interakcí v bio­logii melanomu a komplexnost nádorového mikroprostředí (Kodet et al. Mol Cancer 2015; 14: 1).

Tato práce byla podpořena z grantových prostředků GAČR 304/ 121/ 333, univerzitního projektu PRVOUK 27-1, UNCE 204013 a BIOCEV.

XXX/ 335. Exprese miRNA-31-5p u pacientů s multiformním glioblastomem a její funkční vliv na glioblastomové buňky

Šána J.¹, Bešše A.¹, Ondráček J.¹, Večeřa M.¹, Křen L.², Fadrus P.³, Lakomý R.⁴, Vybíhal V.³, Smrčka M.³, Šlampa P.⁵, Slabý O.¹

¹ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Ústav patologie, LF MU a FN Brno, ³ Neurochirurgická klinika LF MU a FN Brno, ⁴ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno, ⁵ Klinika radiační onkologie, MOÚ, Brno

Východiska: Multiformní glioblastom (GBM) je nejčastěji se vyskytující maligní nádor mozku s mediánem celkového přežívání přibližně 13 měsíců od stanovení dia­gnózy. Ačkoliv jsou histologické profily tohoto nádorového onemocnění navzájem velmi podobné, na molekulární úrovni byly mezi jednotlivými GBM pozorovány značné rozdíly. Naše předchozí studie odhalila u GBM významné změny v expresi mikroRNA (miRNA), krátkých nekódujících RNA, přičemž ně­kte­ré tyto molekuly byly asociovány s celkovým přežíváním pacientů. Jednou z nich byla miR-31-5p, jejíž prognostický význam byl v této studii validován na nezávislém souboru pacientů s GBM. Současně byl pomocí in vitro funkčních testů ověřen její nádorově supresorový charakter v GBM buňkách. Materiál a metody: Exprese miR-31-5p byla validována na souboru 58 GBM tkání a 10 vzorků nenádorové mozkové tkáně získané z temporálních laloků resekovaných u pacientů trpících epilepsií. Zvýšení exprese miR-31-5p v buněčných liniích A172, U87MG, U251 a T98MG bylo dosaženo pomocí transientní transfekce na bázi lipofekce s využitím specifických miRNA mimic oligonukleotidů. Buněčná viabilita a proliferace byly analyzovány pomocí MTT assay, resp. počítáním buněk. Analýza buněčného cyklu byla provedena na průtokovém cytometru s využitím propidium jodidového značení. Migrace pak byla měřena pomocí wound healing assay. Výsledky: Snížená exprese miR-31-5p v GBM tkáni byla úspěšně validována na nezávislém souboru primárních GBM a nenádorových kontrolních vzorků (p > 0,001). Expresní hladiny této miRNA byly rovněž asociovány jak s časem do progrese onemocnění, tak s celkovým přežíváním pacientů s GBM. Zvýšená exprese miR-31-5p u GBM buněčných linií A172, U87MG, U251 a T98MG pak vedla k významnému snížení jejich proliferace a viability (t-test; p < 0,05), a to prostřednictvím zástavy buněčného cyklu v G1 fázi. U linií A172 a U251 byl rovněž pozorován snížený migrační potenciál (t-test; p < 0,05). Závěr: Na základě získaných výsledků se domníváme, že miR-31-5p by mohla být nejen významným dia­gnostickým a prognostickým markerem, ale i slibným terapeutickým cílem u pacientů s GBM.

Práce byla podpořena grantovým projektem NT13514-4/ 2012 MZČR a projektem „CEITEC – Středoevropský technologický institut“ (CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0068).

XXX/ 164. CD133+ buňky u neuroblastomu a možnost jejich ovlivnění

Khalil M.¹, Hraběta J.², Procházka P.³, Eckschlager T.²

¹ 2. lékařská fakulta UK v Praze, ² Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ³ Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i., Praha

Východiska: Význam nádorových kmenových buněk (CSC) spočívá v tom, že mohou dát vznik nádorům, způsobit relaps a/ nebo metastázy. CSC lze detekovat na základě různých markerů nebo jejich kombinací. Tyto znaky CSC se liší u různých nádorů. Povrchový antigen CD133 (promin-1) je markerem CSC u ně­kte­rých mozkových nádorů a u neuroblastomu. Biologická funkce tohoto glykoproteinu není známá, předpokládá se, že se podílí na organizaci topologie buněčné membrány. Exprese CD133 je ovlivněna epigeneticky – acetylací histonů a metylací promotoru. V naší studii jsme se zabývali CD133+ populací u buněčných linií odvozených od neuroblastomu a možnostmi ovlivnění exprese CD133. Materiál a metody: Neuroblastomové buněčné linie UKF-NB-3, UKF-NB-4, IMR-32 a SH-SY-5Y. CD133 jsme detekovali cytometricky a Western blottingem. Buněčný cyklus a aktivovanou caspázu-3 spolu s expresí CD133 jsme stanovovali průtokovou cytometrií. Acetylované histony jsme prokazovali Western blottingem po kyselé extrakci histonů. Metylaci promotorů CD133 jsme stanovovali pomocí metylační vysokorozlišovací analýzy křivek tání po bisulfidové konverzi. Výsledky: CD133+ buňky jsme detekovali u linií UKF-NB-3 a SH-SY-5Y, v UKF-NB-4 a IMR-32 nebyl CD133 Western blottingem prokazatelný. U buněk UKF-NB-3 a SH-SY-5Y inkubace s valproátem (inhibitor histondeacetylázy) zvýšila expresi CD133 a zvýšila tvorbu kolonií. U linií UKF-NB-4 a IMR-32 valproát nezvyšoval expresi CD133 ani klonogenicitu, u těchto linií jsme prokázali hypermetylaci promotorů CD133. Expresi CD133 nezvyšoval valpromid, derivát valproátu, který neinhibuje histondeacetylázu. U linií UKF-NB-4 a IMR-32 indukoval expresi CD133 inhibitor DNA metyltransferázy 5-aza-2’-deoxycytidin v kombinaci s valproátem. CD133+ buňky obsahovaly méně aktivované caspázy-3 než buňky CD133– u kontrol i po indukci apoptózy cisplatinou nebo vinkristinem. CD133+ buňky byly podstatně častěji ve fázi S a G2/ M než buňky CD133–. Závěry: Bez ohledu na to, zda jsou neuroblastomové CD133+ buňky skutečně CSC, zvýšení exprese CD133 pomocí inhibitorů histondeacetylázy, event. v kombinaci s demetylační látkou zvyšují tvorbu kolonií, proliferaci a chemorezistenci.

Podpořeno granty GACR P301/ 10/ 0356 a 14-8344S.

XXX/ 166. Prognostický význam hot spot mutace genu NOTCH1 u pacientů s chronickou lymfocytární leukemií a souvislost s molekulárně bio­logickými markery onemocnění

Kantorová B.1, Malčíková J.¹, Navrkalová V.¹, Vonková B.¹, Vávrová E.¹, Skuhrová Francová H.², Divíšková E.², Šmardová J.³, Plevová K.¹, Trbušek M.¹, Oltová A.², Brychtová Y.⁴, Doubek M.⁴, Mayer J.⁴, Pospíšilová Š.¹

¹ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ² Centrum molekulární bio­logie a genové terapie, Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, ³ Ústav patologie, LF MU a FN Brno, ⁴ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno

Východiska: Chronická lymfocytární leukemie (CLL) představuje v řadě západních zemí jednu z nejčastěji dia­gnostikovaných leukemií dospělých. Prognóza CLL a následná cílená léčba pacientů jsou ovšem dodnes komplikovány nejasnou etiopatogenezí a variabilním klinickým průběhem onemocnění. Progrese CLL a rezistence pacientů na konvenčně podávanou chemoimunoterapii byly v nedávné době asociovány také s výskytem aktivující hot spot mutace p.P2514Rfs*4 v transkripčním faktoru NOTCH1. Cílem studie bylo stanovit význam této mutace u CLL s ohledem na ostatní prognostické markery onemocnění. Materiál a metody: Přítomnost mutace c.7541_7542delCT (p.P2514Rfs*4) genu NOTCH1 byla vyšetřena u 462 pacientů s CLL pomocí přímého sekvenování; u 91 pacientů byla sekvenační analýza doplněna alelově specifickou PCR. Korelace mezi výskytem NOTCH1 mutace a mutačním stavem genů IGHV, rekurentními cytogenetickými aberacemi a mutacemi genů TP53 a SF3B1 byla zhodnocena pomocí Fisherova exaktního testu. Vliv detekované NOTCH1 mutace na délku přežívání pacientů a dobu do první terapie byl stanoven pomocí long-rank (Mantel-cox) testu. Výsledky: Mutace c.7541_7542delCT genu NOTCH1 byla detekována celkem u 15 % (68/ 462) vyšetřených pacientů; u sedmi z těchto pacientů byla na základě opakované sekvenační analýzy prokázána selekce NOTCH1 mutace v průběhu onemocnění. Přítomnost NOTCH1 mutace velmi silně korelovala s nemutovaným stavem genů IGHV (p < 0,0001) a výskytem trizomie chromozomu 12 (p < 0,0001) a byla také častěji detekována u pacientů po podání chemoimunoterapie než u neléčené CLL (24 % vs. 14 % pacientů; p = 0,0784). V souvislosti se zařazením vysokého počtu pacientů s rizikovou CLL do analyzovaného souboru byly rovněž u 26 NOTCH1-mutovaných vzorků prokázány souběžné mutace genů TP53 (n = 20) a SF3B1 (n = 6). Nezávisle na výskytu těchto genových aberací ve vyšetřované kohortě byla přítomnost mutace c.7541_7542delCT genu NOTCH1 asociována s výrazně zkráceným celkovým přežíváním pacientů (p = 0,028) a krátkým časem do podání první terapie (p = 0,0162). V případě analýzy podskupiny 303 pacientů s výlučně nemutovaným stavem genů IGHV ovšem tato souvislost ztratila statistickou významnost v důsledku značného počtu TP53 aberantních vzorků (n = 80) u pacientů bez průkazu NOTCH1 mutace. Závěr: Výskyt mutace c.7541_7542delCT (p.P2514Rfs*4) genu NOTCH1 je spojen s nepříznivou prognózou CLL, která by ovšem měla být posuzována také v kontextu ostatních markerů onemocnění.

Studie byla podpořena VaVPI MSMT CR CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0068 (CEITEC), MUNI/ A/ 1180/ 2014.

XXX/ 207. Sérové koncentrace vybraných cytokinů a cytokinových receptorů u pacientů s akutní lymfoblastickou leukemií

Horáček J.¹, Kupsa T.¹, Karešová I.², Čápková H.³, Jebavý L.¹, Žák P.⁴

¹ Katedra válečného vnitřního lékařství, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové, ² Ústav klinické bio­chemie a dia­gnostiky, LF UK a FN Hradec Králové, ³ Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové, ⁴ IV. interní hematologická klinika LF UK a FN Hradec Králové

Východiska: Cytokiny jsou studovány jako markery aktivace imunitního systému u různých chorob včetně hematologických malignit. Informace získané z těchto studií mohou zlepšit dia­gnostiku a léčbu hematologických malignit, protože cytokiny nebo jejich receptory mohou představovat cíle pro specifickou protinádorovou léčbu na molekulární úrovni. Cílem studie bylo hodnocení sérových koncentrací vybraných cytokinů a cytokinových receptorů u pacientů s nově dg. akutní lymfoblastickou leukemií (ALL) a u zdravých jedinců pomocí bio­čipové technologie. Soubor pacientů a metody: Do studie bylo zařazeno 21 pacientů s nově dia­gnostikovanou ALL (medián věku 46, rozptyl 24–75 let, 17 mužů a 4 ženy) a 15 zdravých dárců krve (medián věku 41, rozptyl 25–58 let, 11 mužů a 4 ženy). Hodnotili jsme sérové koncentrace následujících bio­markerů: interleukin-5 (IL-5), interleukin-15 (IL-15), granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), macrophage inflammatory protein-1 alpha (MIP-1 alpha), soluble IL-2 receptor alpha (sIL-2R alpha), soluble IL-6 receptor (sIL-6R), soluble tumour necrosis factor receptor I (sTNFR-I), soluble tumour necrosis factor receptor II (sTNFR-II), matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Všechny bio­markery byly měřeny bio­čipovou technologií na analyzátoru Evidence Investigator (Randox). Hodnoty p < 0,01 byly považovány za statisticky významné. Výsledky: U pacientů s nově dg. ALL jsme při srovnání se zdravými jedinci zjistili významné zvýšení sérové koncentrace IL-15 (1,74 ± 0,97 ng/ l vs. 0,81 ± 0,16 ng/ l; p = 0,0008), MIP-1 alpha (6,36 ± 3,26 ng/ l vs. 2,68 ± 1,47 ng/ l; p = 0,0003), sIL-6R (2,29 ± 1,80 mcg/ l vs. 0,89 ± 0,39 mcg/ l; p = 0,006), sTNFR-I (0,96 ± 0,50 mcg/ l vs. 0,25 ± 0,07 mcg/ l; p = 0,000005) a sTNFR-II (0,73 ± 0,51 mcg/ l vs. 0,29 ± 0,14 mcg/ l; p = 0,003). Koncentrace ostatních hodnocených bio­markerů se statisticky významně nelišily. Závěr: Naše výsledky naznačují, že sérové koncentrace ně­kte­rých cytokinů a cytokinových receptorů (IL-15, MIP-1 alpha, sIL-6R, sTNFR-I, sTNFR-II) jsou významně alterované u pacientů s nově dia­gnostikovanou ALL a mohou mít vztah k aktivitě onemocnění. Další studie na větším počtu pacientů a srovnání se zavedenými prognostickými faktory budou nezbytné k posouzení, zda změny pozorované v koncentracích těchto molekul mohou být použity jako prognostický ukazatel u ALL.

Práce byla podpořena z projektu RO 1011 (FVZ).

XXX/ 209. Flowcytometrická analýza fenotypu plazmatických buněk u extramedulárního relapsu pacientů s mnohočetným myelomem

Říhová L.¹, Bezděková R.¹, Všianská P.¹, Suská R.¹, Kučerová P.², Šváchová H.³, Pour L.⁴, Ševčíková S.1,³, Hájek R.^1,3,5

¹ Oddělení klinické hematologie, FN Brno, ² Klinika dětské neurologie LF MU a FN Brno, ³ Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ⁴ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, ⁵ Klinika hematoonkologie LF OU a FN Ostrava

Východiska: Mnohočetný myelom (MM) je druhá nejčastější hematologická malignita s charakteristickou přítomností klonálních plazmatických buněk (PC). V posledních letech byla zjištěna zvýšená incidence extramedulárních relapsů (EMR) u pacientů s MM. Jedná se o agresivní formu MM se špatnou prognózou, obvykle rezistentní na léčbu. Nalezení markeru či specifického fenotypu PC může napomoci predikovat riziko vzniku EMR, a následně zintenzivnit léčebné strategie s cílem prodloužit život pacientů. Materiál a metody: Celkově bylo analyzováno 32 pacientů s potvrzeným EMR. Paralelní analýza PC z kostní dřeně (KD) (n = 32) a tumoru (TU) (n = 22) byla provedena pomocí polychromatické průtokové cytometrie. V rámci CD38+CD138+ PC byla analyzována povrchová exprese znaků CD19, CD20, CD27, CD28, CD44, CD56, CD81, CD117 a cytoplazmatická exprese nestinu (Ne). Výsledky: PC byly identifikovány ve všech analyzovaných vzorcích, infiltrace byla významně vyšší v TU než v KD (medián 60,8 % (rozsah 0,0–94,3) vs. 1,5 % (0,01–93,9); p < 0,001). Většina vzorků KD obsahovala směs normálních a abnormálních PC (dle exprese CD19 a CD56), zatímco vzorky TU byly infiltrovány pouze abnormálními CD19- PC. V rámci KD pak byla zjištěna statisticky vyšší exprese CD19 (1,7 % (0,0–94,3) vs. 0,0 % (0,0–0,5); p < 0,001) a CD27 (23,8 % (0,5–95,4) vs. 1,8 % (0,0–98,6); p = 0,015) než v TU, zatímco CD56 byl exprimován v KD méně než v TU (79,4 % (0,4–100,0) vs. 97,8 % (0,0–100,0); p < 0,05). Znaky CD20, CD28, CD81 a CD117 měly v obou typech vzorků nízký medián exprese i míru pozitivity. Naopak CD44 byl silně exprimován, a to v KD (medián 92,3 % (0,0–99,8); pozitivita 92,9 % (13/ 14)) i v TU (98,0 % (0,0–99,8); 84,6 % (12/ 13)). Exprese nestinu byla také pro oba typy vzorků vysoká – medián 71,9 % (1,5–98,9) a pozitivita 76,9 % (10/ 13) v KD vs. medián 61,2 % (0,1–100,0) s pozitivitou 77,8 % (7/ 9) v TU. V jednom případě byl identifikován nestin pozitivní subklon v rámci populace PC v KD (subpopulace CD56+Ne+ vs. CD56++Ne–), kdy v rámci tumoru došlo k propagaci právě Ne+ subklonu. Bylo zjištěno, že u EMR mají PC v KD i v TU obdobný fenotypový profil, avšak při porovnání EMR s MM bez extramedulárního postižení byl zjištěn významný rozdíl v expresi CD44 a nestinu, které jsou u „intramedulárního“ MM sníženě exprimovány (CD44: medián 17,2 % a pozitivita 48 %; nestin: 24,1 % a 52 %). Závěr: Vysoká exprese znaku CD44 na PC v kostní dřeni spolu s vysokou cytoplazmatickou expresí nestinu může identifikovat pacienty s rizikem vzniku extramedulárního mnohočetného myelomu.

Práce byla podpořena projekty IGA NT12130-4 a NT14575, GAČR P304/ 10/ 1395.

XXX/ 215. VLIV CYTOGENETICKÝCH A MOLEKULÁRNĚ GENETICKÝCH ABERACÍ NA HLADINY CYTOKINŮ A SOLUBILNÍCH ADHEZNÍCH MOLEKUL U PACIENTŮ S AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIÍ

Kupsa T.¹, Vašatová M.², Karešová I.², Jebavý L.¹, Žák P.³, Horáček J.¹

¹ Katedra válečného vnitřního lékařství, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové, ² Ústav klinické bio­chemie a dia­gnostiky, LF UK a FN Hradec Králové, ³ IV. interní hematologická klinika LF UK a FN Hradec Králové

Východiska: Cytokiny a adhezní molekuly tvoří dynamickou soustavu, která může napomáhat rozvoji maligních onemocnění. Byly dokumentovány změny hladin cytokinů a adhezních molekul v souvislosti s aktivitou akutní myeloidní leukemie (AML). Cílem studie bylo zhodnotit sérové koncentrace vybraných cytokinů a adhezních molekul v době dia­gnózy AML a posoudit změny související s cytogenetickými a molekulárně genetickými abnormalitami. Soubor pacientů a metody: Soubor 51 pacientů s AML byl rozdělen na dvě skupiny: pacienty s normálním karyotypem (CN-AML, n = 24) a cytogenetickou abnormalitou (n = 27) v době dia­gnózy. Tyto skupiny se nelišily věkem (49,8 ± 12,3 vs. 55,3 ± 13,4 let), středním počtem leukocytů (44,8 ± 37,9 vs. 21,0 ± 25,7 × 1 000/ µL) ani známkami zánětu – CRP (34,7 ± 37,2 vs. 32,4 ± 30,6 mg/ L). Dále jsme v rámci CN-AML zhodnotili rozdíly mezi podskupinou s mutovaným NPM 1 (n = 5) a podskupinou s mutací v NPM 1 a zároveň FLT3-ITD (n = 8). Tyto podskupiny se nelišily věkem, počtem leukocytů nebo CRP. Hodnotili jsme sérové hladiny 17 cytokinů a 5 adhezních molekul: interleukiny (IL-1A, IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-23), vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), tumor necrosis factor-alfa (TNF-α), interferon-gama (IFN-γ), epidermální růstový faktor (EGF), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), E-selektin, L-selektin, P-selektin, intercel­lular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). Biomarkery byly měřeny za použití bio­chip array technologie na analyzátoru Evidence Investigator (Randox). Odchylky s (p) < 0,05 byly považovány za statisticky signifikantní. Výsledky: U CN-AML byly proti pacientům s cytogenetickou abnormalitou vyšší koncentrace E-selektinu (p = 0,0002), L-selektinu (p = 0,0092) a VCAM-1 (p = 0,0394). Zároveň měli tito nemocní nižší hladiny IL-7 (p = 0,0295) a EGF (p = 0,0354). U CN-AML se FLT3-ITD při mutaci v NPM 1 projevila zvýšením hladin IL-1A (p = 0,0290), IL-4 (p = 0,0463), E-selektinu (p = 0,0114) a P-selektinu (p = 0,0365). Závěr: Sérové hladiny IL-1A, IL-4, IL-7, EGF, E-, P-, L-selektinu mohou souviset s cytogenetickými a molekulárně genetickými změnami u AML. K hodnocení prediktivního potenciálu bude třeba dalších studií na větším počtu pacientů, a to zejména s ohledem na primární či sekundární původ onemocnění.

Práce byla podpořena z Projektu specifického výzkumu „Analýza vybraných prognostických markerů u nemocných s AML” a z projektu RO 1011 (FVZ).

XXX/ 216. HLADINY VYBRANÝCH CYTOKINŮ A SOLUBILNÍCH ADHEZNÍCH MOLEKUL U PACIENTŮ S NOVĚ DIAGNOSTIKOVANOU AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKEMIÍ: VLIV TNF-ALFA A FLT3-ITD

Kupsa T.¹, Vaněk J.², Vašatová M.³, Karešová I.³, Jebavý L.¹, Žák P.⁵, Horáček J.¹

¹ Katedra válečného vnitřního lékařství, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové, ² Ústav informatiky a kvantitativních metod, Fakulta informatiky a managementu, Univerzita Hradec Králové, ³ Ústav klinické bio­chemie a dia­gnostiky, LF UK a FN Hradec Králové, ⁴ IV. interní hematologická klinika LF UK a FN Hradec Králové

Východiska: Rezistence akutní myeloidní leukemie (AML) k terapii je prognosticky nepříznivá. Předpokládaným molekulárním mechanizmem je mimo jiné interakce prozánětlivých cytokinů, jako je tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α) s buňkami endotelu a následná zvýšená exprese adhezních molekul. V této studii jsme ověřovali hypotézu, že hladiny cytokinů a solubilních adhezních molekul korelují u nemocných s AML. Soubor pacientů a metody: Byl studován soubor 53 pacientů s nově zjištěnou AML (20 mužů, 33 žen, věk 53,1 ± 13,4 let, medián 56,4 let). Dle standardní prognostické stratifikace bylo 11 AML nízkého, 22 středního a 20 vysokého rizika. Sekundární AML mělo 21 nemocných, FLT3-ITD mutaci mělo 12 pacientů. Hodnotili jsme sérové hladiny 17 cytokinů a 5 adhezních molekul: interleukiny (IL-1A, IL-1B, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-23), TNF-α, vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), interferon-gama (IFN- γ), epidermální růstový faktor (EGF), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), E-selektin, L-selektin, P-selektin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). Biomarkery byly měřeny za použití bio­chip array technologie na analyzátoru Evidence Investigator (Randox). Statistická analýza byla provedena v R 3.1.2. Do analýzy jsme dále zahrnuli počet leukocytů, věk, sekundární původ nemoci, FLT3-ITD, CRP a dosažení remise indukční terapií. Odchylky s p < 0,05 byly považovány za statisticky signifikantní. Výsledky: VCAM-1 koreloval s ICAM-1 (p < 0,0001), E-selektinem (p < 0,0001), počtem leukocytů (p = 0,0005) a TNF-α (p = 0,0035). E-selektin dále koreloval s počtem leukocytů (p < 0,0001), P-selektinem (p = 0,0032) a MCP-1 (p = 0,0119). CRP korelovalo s IL-6 (p < 0,0001). Počet leukocytů negativně koreloval s IL-7 (p = 0,0318). FLT3-ITD byla spojena s vyšším E-selektinem (p = 0,0010) a nižším IL-7 (p = 0,0252). Nemocní se sekundární AML byli starší (p = 0,0008). Selhání indukční léčby bylo spojeno s nesignifikantním zvýšením CRP a snížením P-selektinu. Hlavní komponenta byla ovlivněna počtem leukocytů (p < 0,0001), FLT3-ITD (p = 0,0017) a sekundárním původem AML (p = 0,0439). Závěr: Leukemické buňky mohou ovlivnit mikroprostředí. Hladiny ně­kte­rých cytokinů, adhezních molekul a počet leukocytů významně korelovaly u nemocných s nově zjištěnou AML. Hlubší porozumění těmto molekulárním mechanizmům může stát u zrodu nových léčebných možností v hematoonkologii.

Práce byla podpořena z Projektu specifického výzkumu „Analýza vybraných prognostických markerů u nemocných s AML“ a z projektu RO1011 (FVZ).

XXX/ 220. Cirkulující mikroRNA v moči jako bio­marker mnohočetného myelomu

Sedlaříková L.^1,2, Bešše L.¹, Kubaczková V.^1,2, Novosadová S.¹, Bezděková R.², Stanková M.¹, Radová L.³, Penka M.², Adam Z.⁴, Pour L.⁴, Krejčí M.⁴, Hájek R.^1,2,5, Ševčíková S.^1,2,6

¹ Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ² Oddělení klinické hematologie, FN Brno, ³ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ⁴ Interní hematologická a onkologická klinika LF MU a FN Brno, ⁵ Klinika hematoonkologie LF OU a FN Ostrava, ⁶ Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno

Východiska: MikroRNA (miRNA) jsou 21–23 nt dlouhé jednořetězcové RNA, které se podílejí na regulaci genové exprese a účastní se i patogeneze nádorových onemocnění včetně mnohočetného myelomu (MM). Cirkulující miRNA jsou přítomny v různých tělních tekutinách, jako je sérum, plazma, moč, sliny či mateřské mléko, jsou velmi stabilní, kvantifikovatelné, odolné vůči účinkům RNáz, a mají tak potenciál stát se dia­gnostickým markerem u MM. Vzhledem k tomu, že MM je systémové onemocnění postihující i jiné orgány, např. ledviny, je možné, že cirkulující miRNA nalezené v moči korelují s onemocněním. Toto zjištění by umožnilo neinvazivní stanovení dia­gnózy MM a překonání stávajícího bolestivého postupu, založeného na odběru kostní dřeně (KD). Cílem studie bylo tedy identifikovat cirkulující miRNA v moči, které jsou schopné odlišit pacienty s MM od zdravých dárců (ZD) a porovnat hladiny exprese deregulovaných miRNA s klinickými parametry. Materiál a metody: Celkově bylo do studie zahrnuto 76 vzorků moči. Prvotní analýza byla provedena pomocí platformy Serum/ Plasma Focus MicroRNA PCR Panel (Exiqon) na vzorcích moči osmi nově dia­gnostikovaných MM pacientů a osmi ZD. Vybrané rozdílně exprimované miRNA (p < 0,05) mezi skupinami byly verifikovány metodou qPCR s využitím relativní kvantifikace pomocí cel-miR-39 u 30 nově dia­gnostikovaných MM, 15 ZD a 15 pacientů s renálním karcinomem (RCC). Výsledky: MiRNA profilování odhalilo 20 deregulovaných miRNA (p < 0,05 pro všechny miRNA) mezi MM a ZD. Pro validaci bylo vybráno osm nejvíce deregulovaných miRNA, jejichž hladiny exprese byly dále ověřeny na větším souboru vzorků. Do analýzy byli zařazeni také pacienti s RCC pro odlišení specifických miRNA spojených s MM. Na základě výsledků byla pouze hladina miR-22 významně zvýšena v moči pacientů s MM ve srovnání se ZD (p < 0,012) a ve srovnání se vzorky moči u pacientů s RCC (p < 0,009). Podobný trend byl pozorován také u miR-25, jejíž hladina byla v moči významně zvýšena u pacientů s MM v porovnání s pacienty RCC (p < 0,007), avšak ve srovnání se vzorky ZD se její hladina statisticky významně nelišila (p = 0,325). Korelace s klinickými parametry probíhá. Závěr: Naše předběžné výsledky ukazují, že cirkulující miR-22 v moči by mohla mít potenciál stát se dia­gnostickým bio­markerem pacientů s MM.

Podpořeno grantem IGA NT14575.

XXX/ 265. Hodnocení sérových koncentrací cytokinů a adhezních molekul u pacientů s akutní leukemií a u zdravých jedinců

Horáček J.¹, Kupsa T.¹, Karešová I.², Vašatová M.², Skořepa P.¹, Jebavý L.¹, Žák P.³

¹ Katedra válečného vnitřního lékařství, Fakulta vojenského zdravotnictví UO, Hradec Králové, ² Ústav klinické bio­chemie a dia­gnostiky, LF UK a FN Hradec Králové, ³ IV. interní hematologická klinika LF UK a FN Hradec Králové

Východiska: Cytokiny a adhezní molekuly jsou studovány jako markery aktivace imunitního systému u různých chorob včetně hematologických malignit. Poznatky získané z těchto studií by mohly umožnit zlepšení dia­gnostiky a léčby těchto onemocnění. Cílem studie bylo porovnání sérových koncentrací 17 cytokinů a 5 adhezních molekul u pacientů s akutní myeloidní leukemií (AML), akutní lymfoblastickou leukemií (ALL) a u zdravých jedinců. Soubor pacientů a metody: Do studie bylo zařazeno 15 pacientů s nově dia­gnostikovanou AML, 15 pacientů s nově dia­gnostikovanou ALL a 15 zdravých jedinců (dárci krve). Hodnotili jsme sérové koncentrace 17 cytokinů a 5 adhezních molekul: interleukiny (IL-1 α, IL-1 beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-23), vaskulární endotelový růstový faktor (VEGF), faktor nádorové nekrózy alfa (TNF-α), interferon-gamma (IFN-γ), epidermální růstový faktor (EGF), monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1), E-selektin, L-selektin, P-selektin, intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). Všechny analyty byly měřeny bio­čipovou technologií na analyzátoru Evidence Investigator (Randox). Hodnoty p < 0,01 byly považovány za statisticky významné. Výsledky: U pacientů s nově dia­gnostikovanou AML jsme ve srovnání se zdravými jedinci zjistili statisticky významné zvýšení sérové koncentrace VCAM-1, ICAM-1, E-selektinu a L-selektinu. U pacientů s nově dia­gnostikovanou ALL jsme ve srovnání se zdravými jedinci zjistili statisticky významné zvýšení sérové koncentrace IL-8, L-selektinu, VCAM-1, ICAM-1 a MCP-1. Dále jsme u pacientů s ALL zjistili statisticky významné snížení sérové koncentrace IL-3 a IL-4. Při srovnání pacientů s AML a ALL jsme zjistili statisticky významné rozdíly u IL-2, IL-4 a VCAM-1 (u AML byly vyšší koncentrace IL-2, IL-4 a nižší koncentrace VCAM-1). Rozdíly v sérových koncentracích ostatních cytokinů a adhezních molekul nebyly statisticky významné. Závěr: Naše výsledky ukazují, že sérové koncentrace ně­kte­rých cytokinů a adhezních molekul jsou významně odlišné u pacientů s nově dia­gnostikovanou akutní leukemií ve srovnání se zdravými jedinci. Změny v systému cytokinů a adhezních interakcí mají vztah k aktivitě onemocnění. Není jasné, zda tyto změny mohou sloužit jako prognostický marker u akutních leukemií. Další studie na větším počtu pacientů a srovnání se zavedenými prognostickými faktory budou nezbytné.

Práce byla podpořena z projektu RO 1011 (FVZ).

XXX/ 156. Naše zkušenosti s tekutou bio­psií s využitím vzorků plazmy a moči onkologických pacientů

Benešová L.¹, Belšánová B.¹, Hálková T.¹, Melniková V.¹, Levý M.², Lipská L.², Pešek M.³, Fiala O.⁴, Pudil J.⁵, Mináriková P.⁶, Zavoral M.⁶, Ryska M.⁵, Minárik M.¹, Erlander M.¹

¹ Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, Praha, ² Chirurgická klinika 1. LF UK a Thomayerova nemocnice, Praha, ³ Klinika pneumologie a ftizeologie LF UK a FN Plzeň, ⁴ Onkologická a radioterapeutická klinika LF UK a FN Plzeň, ⁵ Chirurgická klinika 2. LF UK a ÚVN Praha, ⁶ Interní klinika 1. LF UK a ÚVN Praha

Východiska: Detekce cirkulující nádorové DNA (ctDNA), nazývaná také „tekutá bio­psie“ (liquid bio­psy), se stává nadějným nástrojem pro neinvazivní monitoring pacientů. Metodiky vyšetřování ctDNA jsou zpravidla založené na citlivé platformě digitální PCR s limitem detekce nižším než 0,01 % mutovaných alel, avšak jsou finančně i časově náročné. Kromě plazmy se pro vyšetření ctDNA v poslední době stává objektem zájmu také moč, zejména z důvodu neinvazivity. Cílem této práce bylo zavést jednoduchou, levnou, ale citlivou metodu detekce ctDNA v plazmě pro užití v rutinní praxi a ověřit její funkčnost na pa­cientech s kolorektálním karcinomem (CRC), nemalobuněčným karcinomem plic (NSCLC) a karcinomem pankreatu (PC). Dalším cílem bylo za použití speciální platformy stanovit hladiny ctDNA v moči a korelovat je s hladinami v plazmě. Materiál a metody: Celkem jsme do studie zahrnuli 362 pacientů s CRC (251), PC (85) a NSCLC (26) představujících 733 vzorků plazmy. Vzorky jsme vyšetřili na přítomnost mutace protoonkogenů (KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA a EGFR) nebo tumor supresorů (TP53, APC a CTNNB1) za použití denaturační kapilární elektroforézy (DCE). U podskupiny 20 pacientů operovaných pro pokročilý CRC, kde byly hladiny ctDNA monitorované před operací a po ní a následně pak ve 2–6měsíčních intervalech, jsme tato data korelovali s výsledky získanými vyšetřením plazmy a moči za použití hlubokého sekvenování nové generace (NGS) s prekoncentrací mutovaných fragmentů. Výsledky: Celkový záchyt ctDNA v plazmě pacientů s pokročilým CRC metodou DCE je 68 % ve srovnání s uváděnými hodnotami cca 88 % metodami na principu dPCR. Minimální vstupní koncentrace DNA je 5 pg a hodnota LOD odpovídá 0,03–1 % v závislosti na testovaném genu. Při srovnání 85 vzorků plazmy vyšetřených metodou DCE a hlubokého NGS jsme zaznamenali shodu u 69 (81 %) vzorků (37krát pozitivní, 32krát negativní) a neshodu u 16 (19 %) vzorků (15krát DCE negativní a NGS pozitivních a 1krát DCE pozitivní a NGS negativní). Ve všech 15 případech falešné negativity u metody DCE šlo o vzorky s hladinou ctDNA menší než 850 molekul cílové sekvence. Korelace ctDNA pozitivity plazmy a moči byla vyhodnocena u celkem 18 vzorků se shodou u 16 (89 %) vzorků, kdy u dvou neshodných vzorků byla plazma ctDNA pozitivní a moč negativní. Závěr: Naše rutinně používaná metodika je dostatečná pro vyšetřování ctDNA v plazmě většiny pacientů s metastatickým CRC. Nově zaváděná metodika vykazující výrazně vyšší náklady a technologické nároky (dPCR, NGS) má tak především využití pro detekci ctDNA v moči.

Podpořeno grantem IGA MZ NS13660.

XXX/ 159. Může výběr materiálu ovlivnit prediktivní vyšetření metodou sekvenování nové generace (NGS)?

Berkovcová J.¹, Radová L.², Rathouzská Š.¹, Němeček R.³, Svoboda M.³, Fabián P.¹

¹ Oddělení onkologické patologie, MOÚ, Brno, ² Výzkumná skupina Lékařská genomika, CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno, ³ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno

Východiska: Podmínkou cílené anti-EGFR terapie u pacientů s metastazujícím kolorektálním karcinomem je stanovení mutací genů RAS. Dosud užívané molekulární metody mají kvalitativní charakter. Rozhodující pro volbu metody je její senzitivita a specificita. NGS je vysoce senzitivní, ale zároveň i specifické. Dále umožňuje kvantifikaci přítomného markeru v nádoru. Metody: Do souboru bylo zařazeno 16 pacientů s operovaným kolorektálním karcinomem v roce 2014. Jako hlavní kritérium byla zvolena velikost nádoru (> 30 mm) nebo pacienti s více nádorovými ložisky. Celkem byla izolována DNA z 38 vzorků s vysokým zastoupením nádorové populace (40–70 %). Příprava DNA knihovny pro platformu MiSeq proběhla pomocí TruSight Tumor kitu (Illumina), který obsahuje „Hot Spots“ 26 vybraných genů (celkem 175 amplikonů). Základní analýza sekvencí byla provedena pomocí softwarů Illumina, dále detekce variant pomocí softwaru Illumina VariantStudio. K následným datovým úpravám byly použity balíky R/ Bioconductor. Výsledky: Námi izolovaná DNA z FFPET dosahuje velice dobré kvality a ze všech vzorků bylo možné připravit DNA knihovny. Q Skore 30 (odpovídá kvalitě sekvencí) bylo dosaženo u více než 96 % sekvencí. Průměrná coverage dosahuje 4 000 čtení. U 7 pacientů jsme detekovali mutaci v genu KRAS v kodonu 12 nebo 13, u tří pacientů V600E mutaci v genu BRAF. Nejčastěji prokázané varianty byly v genu TP53, a to u 12 pacientů. U šesti pacientů molekulární analýza prokázala rozdíly na úrovni subpopulací. U jednoho pacienta, u kterého byla nalezena morfologicky odlišná ložiska primárního tumoru, jsme potvrdili tuto rozdílnost i na molekulární úrovni. Přestože obě ložiska nesou mutace ve stejných genech (KRAS, TP53 a APC), jedná se ve všech třech případech o mutace odlišné, což vypovídá o podobné karcinogenezi obou ložisek. Závěr: Naše výsledky ukazují, že NGS je vhodná pro FFPET vzorky, ale i u této molekulární metody je nutné zdůraznit správnou fixaci materiálu. Díky paralelnímu vyšetření několika sekvencí vede NGS k úspoře bio­logického materiálu. Potvrdili jsme stabilní rozložení přítomných mutací genu KRAS napříč nádorovou populací. To odpovídá představě, že pro analýzu klinicky relevantních prediktorů nehraje místo odběru roli. Toto vše z NGS dělá metodu spolehlivou pro prediktivní vyšetření u pacientů s plánovanou cílenou terapií. Vedle toho detekujeme s vysokou senzitivitou i minoritní genové varianty v morfologicky odlišných částích tumoru. Z tohoto pohledu je NGS vhodným nástrojem ke studiu intratumorové heterogenity.

Podpořeno MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805); FP7 grant 306242 NGS-PTL.

XXX/ 167. Epigenetická prevence a nutrigenomika v onkologii

Čupka J.

Epigentest, Praha

Východiska: Identifikace epigenetických změn v procesu vzniku nádorů má za následek změnu paradigmatu v chápání rizika a vývoje tumorů. Genetické abnormality či mutace byly dosud považovány za primární příčinu. Epigenetické mechanizmy – metylace DNA, modifikace histonů, remodelace chromatinu a interference s mikroRNA mají zásadní význam pro onkogenezi. Tyto procesy mění genovou expresi, aniž by to ovlivnilo sekvence DNA. Cíl: Bioaktivní složky potravin přímo ovlivňují enzymy podílející se na epigenetických mechanizmech přes DNA metyltransferázy (DNAMT), histon deacetylázy (HDAC) a histon acetyltransferázy (HAT). Esenciální složky, jako je kyselina listová, vitamin B12, kyselina pantotenová, selen a zinek, jakož i fytochemikálie sulforafan, metionin, cholin, betain, niacin, bio­tin genistein, epigallocatechin-3-gallate, čajové i česnekové polyfenoly, resveratrol, butyrate, quercetin, kurkumin a allylové sloučeniny síry patří k narůstajícímu seznamu látek, které mají prokázaný chemopreventivní a epigenetický vliv. V průběhu života mohou nutrienty a životní styl jedince včetně vnějšího prostředí upravit fyziologické i patologické procesy prostřednictvím epigenetických mechanizmů, které jsou rozhodující pro expresi genů. Závěr: Vzhledem k tomu, že metylace DNA, deacetylace histonů a remodelace chromatinu jsou vratné procesy, ukazují se jako atraktivní cíle pro epigenetickou terapii a primární i terciální prevenci nádorů. V přednášce budou řešeny poznatky týkající se nutriční epigenetiky, které jsou užitečné pro pochopení, jakým mechanizmem nutrienty a interferující vlivy prostředí výrazně ovlivňují onkologickou prevenci. Navíc se ukazuje, že transgenerační dědictví epigenetických změn vyvolané během embryonálního vývoje přetrvává až do třetí generace.

XXX/ 168. Hodnocení imunitní odpovědi u pacientů s nádorovým onemocněním

Závadová E.¹, Konopásek B.¹, Vočka M.¹, Špaček J.¹, Fučíková T.², Petruželka L.¹

¹ Onkologická klinika 1. LF UK a VFN v Praze, ² Ústav imunologie a mikrobio­logie, 1. LF UK a VFN v Praze

S přihlédnutím k faktu, že nedostatečná imunitní odpověď často koreluje se špatnou prognózou, se výzkum v posledních letech zaměřil na přesný popis stavu a funkce imunitního systému. Do popředí se dostává mapování imunitní odpovědi u nádorových pacientů – tzv. immunoscore. Jedná se o hodnocení přítomnosti nádorových buněk jak v bezprostředním okolí nádoru, tak i v periferní krvi. U onkologických pacientů byly prokázány defekty specifické imunity prakticky na všech úrovních (prezentace antigenu, součinnost jednotlivých subpopulací lymfocytů, nedostatečná funkce a někdy i snížené zastoupení CD8 lymfocytů, převaha vlivu imunosupresivních subpopulací lymfocytů T-reg atd.). V rámci velkých studií se zkoumá přítomnost různých imunitních buněk a jejich poměr u nádorových pacientů. Zdá se, že nejlepší prognózu vykazují pacienti s vysokým počtem efektorových lymfocytů CD8, které jsou schopny nádorovou buňku eliminovat. Vzhledem k výsledkům u tisíců pacientů bylo navrženo doplnit klasifikaci TNM u kolorektálního karcinomu o immunoscore. Immunoscore se zřejmě bude týkat i dalších druhů nádorů. Zcela nový pohled na imunologická vyšetření přinesly i klinické úspěchy imunoterapie. Dnešní imunoterapie nepomáhá každému a je otázkou, proč z imunoterapie neprofituje více pacientů. Hledá se proto způsob, jak najít prediktivní bio­markery, které pomohou učinit imunoterapii efektivnější. Zdá se, že hodnocení stavu imunitního systému onkologického pacienta bude pro efektivní imunoterapii velmi významné. U ně­kte­rých pacientů, zejména těch na terapii anti CTLA 4, se objevily závažné autoimunitní nežádoucí účinky (např. autoimunitní zánět tlustého střeva či hypofýzy). Tyto nežádoucí účinky souvisejí s aktivací imunitního systému, jsou předvídatelné a při správné imunomodulaci (zahrnující správný poměr mezi imunostimulací a imunosupresí) i zvládnutelné. Vzhledem k neobvyklým a závažným nežádoucím účinkům by imunoterapii mělo předcházet komplexní imunologické vyšetření, které vyloučí autoimunitní terén či jinou imunopatologii. Otázkou rovněž zůstává správné načasování imunointervenční terapie – je důležité správně načasovat kombinaci imunoterapie a chemoterapie, event. radioterapie tak, aby docházelo k potenciaci efektu. Proto je nutné podotknout, že pro efektivní léčbu je nutná úzká spolupráce mezi onkologem a imunologem. Závěrem možno prohlásit: Imunologická vyšetření u onkologických pacientů považujeme za záhodná a doporučujeme zvážit jejich provádění za standardní.

Práce byla podpořena grantovým projektem IGA NT 13259-3, Liga proti rakovině a PRVOUK-P-27.

XXX/ 163. ÚLOHA RAD51-BRCA2 INTERAKCIE V UDRŽOVANÍ STABILITY GENÓMU: MECHANIZMUS ZOSTAVENIA A STABILIZÁCIE RAD51 PRESYNAPTICKÉHO FILAMENTU AKO POTENCIÁLNY CIEĽ PROTINÁDOROVEJ TERAPIE?

Beláň O.¹, Špírek M.¹, Krejčí L.¹, Kim T.², Hasty P.³

¹ Laboratory of Recombination and DNA Repair, National Centre for Biomolecular Research and Department of Biology, Masaryk University, Brno, ² The University of Texas Health Science Center at San Antonio, USA, ³ Department of Molecular Medicine, Institute of Biotechnology, The University of Texas Health Science Center at San Antonio, USA

Východiská: Pre nádorové bunky je príznačná výrazná genómová nestabilita spojená s kumuláciou genetických alterácií, preto terapeuticky vyvolané DNA poškodenie dokáže znížiť ich životaschopnosť. Často však dochádza k vývinu rezistencie. Homologická rekombinácia je mechanizmus zodpovedný za presnú opravu DNA dvojreťazcových zlomov (DSBs) – vážneho typu DNA poškodenia. Medzi kľúčové proteíny, ktoré sa jej zúčastňujú, patria RAD51 a BRCA2. Mutácie v géne BRCA2 sú spojené so vznikom karcinómu prsníka, ovária a prostaty. BRCA2 viaže RAD51 cez BRC motívy (BRC1-8) a C-terminálnu doménu, exón 27 (Ex27), kde TR2-peptid predstavuje minimálnu aktívnu časť. Cieľom našej práce bola identifikácia a charakterizácia RAD51 mutantu s narušenou Ex27-interakciou, bližšie objasnenie úlohy interakcie RAD51-BRCA2(Ex27) pri udržiavaní stability genómu a možného využitia jej narušenia pre liečbu malignít. Materiál a metódy: Porušenie RAD51-BRCA2(Ex27) interakcie u mutantu bolo overené dvojhybridným systémom a „pull-down“ experimentmi. Mutanty boli fenotypizované in vivo v myších embryonálnych kmeňových bunkách (mESCs). Účinok TR2 na stabilitu RAD51 filamentu bol sledovaný pomocou metódy EMSA (electrophoretic mobility shift assay). Pre meranie rýchlej reakčnej kinetiky bola využitá metóda stopped-flow. Výsledky: V partnerskom laboratóriu bol identifikovaný mutant RAD51 defektný v interakcii s Ex27. Mutant in vivo nemal výrazný vplyv na proliferizáciu a stratu heterozygotnosti u mESCs (na rozdiel od RAD51KR – mutanta neschopného hydrolýzy ATP), avšak zvyšoval senzitivitu mESCs voči camptothecínom vyvolanému DNA poškodeniu (mj. DSBs). TR2 in vitro chráni RAD51 filamenty pred destabilizujúcim účinkom BRC3, ale zvýšenie stability voči disociácii pri nadbytku voľnej ssDNA bolo menej výrazné, čo sme potvrdili metódou stopped-flow, ktorá zároveň odhalila zmenu mechanizmu zostavenia filament pri pre-inkubácii RAD51 s TR2. RAD51 mutant defektný v interakcii s Ex27 tieto zmeny takmer nevykazoval. Záver: Narušenie interakcie RAD51-BRCA2(Ex27) zvyšuje citlivosť voči DNA poškodeniu bez výrazného cytotoxického účinku na nepoškodzované bunky. Za tento efekt je pravdepodobne zodpovedné porušenie Ex27-závislej koordinácie tvorby a bio­logickej stabilizácie RAD51 filamentu (spôsob vytvárania nukleačných jadier, ochrana pred antirekombinačnými proteínmi) manifestujúce sa až po preťažení bunky DNA poškodením. Inhibícia RAD51-BRCA2(Ex27) interakcie by teda mohla byť využiteľná pri liečbe napr. rádiorezistentných nádorov.

Práca bola podporená grantovým projektom GACR13-26629S a GACR207/ 12/ 2323.

XXX/ 206. Significant seasonal variations of 25-OHD blood levels reflecting sun exposure in the South Moravian region of the Czech Republic

Greplová K.¹, Valík D.², Obermannová R.³

¹ Department of Laboratory Medicine, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ² RECAMO, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ³ Department of Comprehensive Cancer Care, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno

Background: Vitamin D plays an important role in a number of physiological functions including calcium absorption, bone metabolism, immune function, muscle function and cellular regulation. Numerous clinical studies have shown that vitamin D has significant protective effect against the development of cancer. We studied changes in 25(OH)D serum concentrations in healthy individuals in the spring and autumn to assess difference between late spring and early autumn period in our geographical location. Materials and Methods: The serum aliquots were derived from blood of healthy individuals who visited Masaryk Memorial Cancer Institute (MMCI) to receive preventive health check up focused on early cancer detection. This cancer prevention program is avail­able at MMCI and is not reimbursed by health insurance system. Out of this cohort, 437 blood samples in March and April and 508 blood samples in September, October were taken in sample tube without anticoagulant. Collected samples were left to coagulate 45 minutes. After centrifugation (1,500 g, 15 ˚C, 20 min) separation serum was stored in short term storage serum repository of bio­bank at –20 ˚C. Subsequently, 25(OH)D serum concentrations were measured using Architect i2000sr (Abbott) analyzer within one week. Results: We found vast differences in concentrations of 25(OH)D between “spring” and “autumn” group. In the spring group median of 25(OH)D concentration was 42.7 nmol/ l (95% CI 21.9–90.1 nmol/ l). In the autumn group median of 25(OH)D was 70.8 nmol/ l (95% CI 37.0–137.5 nmol/ l). Conclusion: We observed fundamental differences in 25(OH)D concentrations between late spring and late summer which is in our latitude due to exposure to sunlight during the summer. This finding may have substantial implications for populational health. However, our data may be slightly biased by the type of a source population that may carry more active lifestyle than the true population average.

This study was funded by European Regional Development Fund and State budget of the Czech Republic (RECAMO: CZ 1.05/ 2.1.00/ 03.0101) and by Ministry of Education, Youth and Sports (BBMRI: LM2010004).

XXX/ 213. Analýza dynamiky oligomerizace proteinu reptin metodou vodík/ deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií

Coufalová D.¹, Ďurech M.¹, Růčková E.¹, Dvořáková P.¹, Hupp T.^1,2, Vojtěšek B.¹, Hernychová L.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Edinburgh Cancer Research Centre, Cell Signalling Unit, University of Edinburgh, United Kingdom

Východiska: Protein reptin se nedávno dostal do popředí vědeckého zájmu v oblasti onkologie, jelikož jeho zvýšená exprese byla identifikována v buňkách hepatocelulárního karcinomu, kolorektálního karcinomu, karcinomu ledvin a plic. Je zapojený v proteinových komplexech důležitých pro řadu buněčných dějů, mezi které patří remodelace chromatinu, regulace transkripce, detekce a oprava poškozené DNA a stabilizace telomer. Ve zmíněných komplexech se nachází reptin zejména v hexamerické formě a jeho aktivita je závislá na vazbě a hydrolýze ATP a také na interakci se signálními proteiny. V současnosti byla prokázána jeho interakce i s tumor supresorovým proteinem p53. Pro studium možných protein-proteinových interakcí byl navržen nízkomolekulární ligand Liddean interagující s ATP vazebnou kapsou na povrchu reptinu, který má za cíl stabilizovat konečnou homohexamerickou formu. Získání stabilního hexameru přispěje k objasnění struktury výsledného komplexu a k odhalení nových specifických motivů nacházejících se na povrchu komplexu, díky kterým bude možné určit nové interakční partnery a pochopit roli reptinu v onkogenezi. Materiál a metody: Vliv Liddeanu na oligomerizaci rekombinantního proteinu reptin byl měřen metodou vodík/ deuteriové výměny ve spojení s hmotnostní spektrometrií. Tato metoda umožňuje analyzovat dynamické změny ve struktuře proteinu a také protein-proteinové interakce. Výsledky: Ve výsledných hmotnostních spektrech byly identifikovány dva různé stavy proteinu lišící se mírou inkorporace deuterií. Stav s nižší deuterací, který je typický pro více kondenzované proteiny, byl přiřazen oligomerické formě a stav s vyšší deuterací, typický pro více rozbalené proteiny, byl přiřazen formě monomerické. V analyzovaných vzorcích reptinu s navrženým ligandem Liddeanem byl poměr oligomerické formy zvýšen ve srovnání s formou monomerickou. Závěr: Naše výsledky ukazují, že přítomnost Liddeanu měla vliv na stabilizaci homooligomerické formy reptinu.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101), státním rozpočtem České republiky (LO1413) a MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 221. Nová cesta rozpoznávání sterolových tumorových markerů: polymetiniové soli – syntetické receptory pro sulfátové steroly

Kejík Z.¹, Bříza T.², Mikula I.², Martásek P.², Králová J.³, Král V.⁴

¹ Klinika dětského a dorostového lékařství 1. LF UK a VFN v Praze, ² 1. lékařská fakulta, UK v Praze, ³ Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i., Praha, ⁴ Epigentest, Praha

Východiska: Pro úspěšnou léčbu rakoviny je včasná dia­gnóza klíčovým faktorem. Pro řešení tohoto úkolu je nutno rozpoznávat rakovinu na buněčné úrovni. Její efektivní rozpoznávání může být založeno na specifických interakcích analytického činidla a vhodného molekulárního partnera, např. rakovinového (tumorového) markeru. V současné době se většina používaných a studovaných metod jejich stanovení zaměřuje především na proteiny a nukleové kyseliny. Řada klinických studií ukázala, že jejich stanovení vede k podstatnému zlepšení nejen dia­gnostických metod, ale i samotné protinádorové terapie. Nicméně bez stanovení dalších tzv. neklasických tumorových markerů (např. sulfátované steroly) bude získaná informace omezená a její využití může být limitováno. Sulfátované steroly hrají významnou roli v řadě bio­logických procesů. Jejich bio­logická funkce zahrnuje kontrolu řady důležitých tělesných funkcí (krevní sražení, finbrinolysu, aktivaci protein kinázy), regulují činnost řady důležitých neurotransmiterů, např. glutamátu, g-kyseliny aminomáselné, acetylcholinu, noradrenalinu a dopaminu. Dosud známé metody jejich stanovení zahrnují HPLC, hmotnostní spektroskopii a imunochemické metody. Další možností může být použití syntetických receptorů, které umožní jejich spektroskopické stanovení. Nicméně syntetický receptor pro sulfátové steroly nebyl dosud popsán. Proto jsme se zaměřili na studium stanovení sulfátovaných sterolů pomocí polymetiniových solí. Materiál a metody: Testované sterolové tumorové markery byly cholesterol sulfát a estrogen sulfát. Jako syntetické receptory byly použity pentametiniové soli. Studium jejich afinity a selektivity bylo provedeno pomocí UV-VIS spektroskopie. Vazebná studie byla provedena v 1mM fosfátovém pufru (voda : MeOH 98 : 1), pH 7,34. Vazebné konstanty byly spočteny pomocí programu Letogrop SPEFO. Výsledky: Provedená studie ukázala vysokou selektivitu a spektrální odezvu těchto receptorů pro studované analyty oproti kontrolním analytům (cholesterol a žlučová kyselina). Podrobnější studium interakce polymetiniových solí ukázalo, že jejich vysoká selektivita je založena na kombinaci sulfátové specifity a hydrofobicitě testovaných receptorů. Závěr: Testované receptory jsou použitelné pro rozpoznání a stanovení testovaných markerů.

Práce byla podpořena grantovými projekty: UNCE 204011/ 2012 a PRVOUK P24/ LF1/ 3 od grantové agentury Univerzity Karlovy, LH 14008 od MŠMT a BIOCEV (CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0109) od Evropského regionálního fondu.

XXX/ 225. ALTERACE EXPRESE GENŮ OXIDATIVNÍHO STRESU ÚČINKEM NANOČÁSTICOVÝCH FOREM DOXORUBICINU

Fojtů M.¹, Gumulec J.¹, Sztalmachová M.¹, Raudenská M.¹, Stračina T.², Nováková M.², Kizek R.³, Adam V.³, Masařík M.¹

¹ Ústav patologické fyziologie, LF MU, Brno, ² Fyziologický ústav, LF MU, Brno, ³ Ústav chemie a bio­chemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Antracyklinové antibio­tikum doxorubicin (DOX) patří mezi jedny z nejúčinnějších protinádorových léčiv. Navzdory jeho hojnému využívání v klinické praxi je však jeho administrace značně limitována vedlejšími účinky. Jedním z těch nejzávažnějších je jeho kardiotoxicita. Hlavním mechanizmem, kterým DOX poškozuje zdravé tkáně, je indukce tvorby volných radikálů. V následující studii byly evaluovány lipozomální a apoferitinové nanonosiče DOX a také konjugáty DOX s uhlíkovými nanotrubicemi. Cílem bylo zjistit, zda mají částice potenciál tato poškození redukovat a dochází po jejich aplikaci ke snížení exprese enzymů zapojených do mechanizmu oxidačního stresu v srdci a dalších tkáních. Materiál a metody: V rámci studie byla analyzována změna genové exprese enzymů oxidačního stresu (SOD1, Gpx1, Txnrd2, ALDH3A1) po podání jednotlivých forem DOX. 32 samců potkanů o průměrné váze 300 g (± 30 g) bylo rozděleno do čtyř skupin po osmi jedincích. Každému z nich bylo i.p. aplikováno 5 mg/ kg dané formy léčiva. Následně byly odebrány jednotlivé tkáně (levá a pravá síň, levá a pravá komora, játra, varlata a ledviny), ze kterých byla pomocí trizolové extrakce vyizolována RNA. Byla provedena kvantitativní RT-PCR s využitím specifických TaqMan® sond (Applied Biosystems, USA). Exprese výše uvedených genů byla analyzována komparativní DDCt metodou s využitím b-aktinu jako endogenní kontroly. Výsledky: Po podání nanočásticových forem DOX došlo v porovnání s administrací jeho volné formy k významnému snížení exprese SOD1 zejména v levé a pravé srdeční síni, ale také v játrech a ledvinách. Gpx1 byl v těchto tkáních se SOD1 koexprimován, naopak v případě ALDH3A1 byl trend exprese opačný. Změny exprese Txnrd2 nebyly statisticky signifikantní. Snížení kardiotoxického efektu bylo nejvíce patrné v srdečních síních, a to konkrétně po podání konjugátů DOX s nanotrubicemi. Závěr: Cílem této studie bylo zjistit, jak DOX a jeho nanočásticové formy alterují expresi enzymů oxidačního stresu. Z našich dat vyplývá, že jejich administrace nejvýznamněji snižuje expresi SOD1 a Gpx1, které se svou katalytickou činností podílí na vzniku volných radikálů. Právě to jsou totiž jednou z hlavních příčin toxicity DOX vůči okolním tkáním. Redukce exprese těchto enzymů byla pozorována hlavně v srdečních síních a v játrech. Souhrnně tato data naznačují, že mají nově syntetizovaná léčiva potenciál tvorbu volných radikálů redukovat.

Stipendista programu Brno Ph.D. talent – financuje statutární město Brno. Práce byla podpořena grantovými projekty MUNI/ A/ 1326/ 2014 a CEITEC CZ.1.05/ 1.1.00/ 02.0068.

XXX/ 226. Vliv 3’-UTR oblasti mRNA AGR2 na expresi protoonkogenu AGR2

Matoulková E., Hrstka R., Vojtěšek B.

RECAMO, MOÚ, Brno

Východiska: Exprese proteinu AGR2 (Anterior gradient 2) byla prokázána ve zvýšených hladinách u řady onkologických onemocnění. Vzhledem k jeho prometastatickým vlastnostem je řazen mezi nádorové onkogeny podporující buněčnou proliferaci, a napomáhající tak buněčné nádorové transformaci. Přesná molekulární podstata regulace exprese AGR2 doposud není objasněna. Jedním z nově diskutovaných obecných mechanizmů ovlivňujících expresi nádorových onkogenů je vliv délky jejich 3’-UTR oblasti mRNA. V publikovaných případech byla zkracující se délka 3’-UTR dávána do souvislosti se zvýšenou expresí nádorových onkogenů a v důsledku toho i do souvislosti se zvýšeným proliferačním potenciálem buněk. Cílem tohoto sdělení je prokázat vliv délky oblasti 3’-UTR transkriptu AGR2 na expresi proteinu AGR2 a zhodnotit tento vliv na klinických vzorcích pacientů. Materiál a metody: U AGR2 negativních nádorových buněčných linií, tranzientně transfekovaných expresními vektory s rozdílnou délkou 3’-UTR AGR2, byla imunochemicky stanovena hladina exprese AGR2 v závislosti na délce 3’-UTR. Tato hladina exprese byla srovnána s příslušnou hladinou transkriptu AGR2 stanovenou PCR v reálném čase. Z vybraných klinických vzorků s imunohistochemickým stanovením exprese AGR2 byla izolována RNA, přepsána pomocí reverzní transkriptázy do cDNA a následně byla pomocí PCR v reálném čase stanovena hladina mRNA AGR2 s rozdílnou délkou 3’-UTR. Výsledky: Hodnocení hladiny exprese tranzientně transfekovaných buněčných linií plazmidy s rozdílnou délkou 3’-UTR AGR2 jasně prokázalo nižší účinnost transkripce v závislosti na prodlužující se délce 3’-UTR. Jinými slovy: čím byla 3’-UTR delší, tím byla nižší hladina mRNA. Stejně tak tomu bylo i u hladiny proteinu, tedy s prodlužující se délkou 3’-UTR byla snižována exprese AGR2. Optimalizací metody PCR v reálném čase jsme byli schopni zachytit zkracující se délku 3’-UTR genu AGR2 u vybraných klinických vzorků, přičemž u většiny těchto vzorků se jednalo o výše uvedený trend – vyšší exprese AGR2, kratší 3’-UTR, a naopak – nižší exprese AGR2, delší 3’-UTR. V případě negativní kontroly (AGR2 negativní vzorky) nebyla touto metodou 3’-UTR AGR2 detekovatelná. Závěr: V naší práci jsme jednoznačně prokázali inhibiční vliv 3’-UTR na hladinu proteinu AGR2, přičemž významnou roli hraje vlastní délka 3’-UTR oblasti. V případě klinických vzorků jsme byli schopni prokázat trend kratší délky 3’-UTR oblasti protoonkogenu AGR2 u vzorků se zvýšenou expresí AGR2.

Tato práce byla podpořena GACR 13-00956S, GACR P301/ 11/ 1678, MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805), OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101 a NPU I (LO1413).

XXX/ 227. APOFERRITIN – EFEKTIVNÍ ZPŮSOB DOPRAVY LÉČIV

Dostálová S.¹, Vaculovičová M.¹, Eckschlager T.², Stiborová M.³, Adam V.⁴, Kizek R.⁴

¹ Mendelova univerzita v Brně, ² Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ³ Katedra bio­chemie, PřF UK v Praze, ⁴ Ústav chemie a bio­chemie, Mendelova univerzita v Brně

Východiska: Ačkoliv se pro léčbu rakoviny používají účinná cytostatická léčiva, mnoho z nich má řadu negativních účinků, které zhoršují kvalitu života pacienta. Tyto účinky jsou nejvíce viditelné u rychle se dělících buněk, jako jsou vlasové folikuly nebo sliznice trávicího ústrojí. Mezi nejzávažnější patří kardiotoxicita způsobená opakovaným podáním antracyklinového antibio­tika doxorubicinu. Tyto negativní účinky je možné snížit nebo i zcela odstranit enkapsulací léčiva do vhodného nanotransportéru. Jako velmi vhodný se jeví protein apoferritin (APO), který se nachází v těle mnoha organizmů včetně člověka, nevyvolává tedy imunitní odpověď po podání, jako je tomu v případě mnoha syntetických nanotransportérů. Protokol enkapsulace léčiva do APO je založen na přirozené změně jeho struktury v závislosti na okolním pH. Navíc je APO pasivně cílen do nádorů díky efektu zvýšené permeability a retence a je možné jeho povrch modifikovat ligandy pro aktivní cílení do nádorových buněk. Materiál a metody: APO (2 µM) byl smíchán s doxorubicinem (4 µM) a směs byla acidifikována pro rozvolnění struktury APO. Směs byla třepána 15 min při 20 °C a poté alkalizována zpět na neutrální pH pro enkapsulaci molekul doxorubicinu do znovu sestaveného APO. Přebytečný doxorubicin byl 3krát dialyzován přes kolonky Amicon 3K. Vliv enkapsulace na APO i doxorubicinu byl sledován z hlediska velikosti a povrchového náboje molekul a pomocí dialýzy s následnou absorbanční (l = 230/ 480 nm) a fluorescenční (lex = 480 nm) detekcí. APO s enkapsulovaným doxorubicinem byl skladován 14 dní při –20; 4; 20 a 37 °C a bylo sledováno uvolňování léčiva z dutiny APO. Výsledky: Byl studován vliv enkapsulace léčiva doxorubicinu do APO na velikost a hustotu povrchového náboje APO. APO měl velikost 12 nm a zeta potenciál –13,5 mV. Enkapsulací léčiva se velikost APO zvětšila na 16 nm se zeta potenciálem –23,5 mV. V absorbančním spektru samotného apoferritinu je absorpční maximum při 260 nm, po enkapsulaci se objevuje nové absorpční maximum při 480 nm. Výtěžnost procesu enkapsulace je 80 %. Uvolňování léčiva z apoferritinu bylo velmi nízké i při dlouhodobém skladování, nejmenšího uvolňování léčiva bylo dosaženo, pokud byl vzorek sladován při teplotě –20 °C. Závěr: Apoferritin se jeví jako velmi slibný kandidát pro dopravu cytostatických léčiv do nádorových buněk. Enkapsulace molekul léčiva je velmi jednoduchá a má velkou účinnost a nedochází k přílišnému uvolňování léčiva.

Práce byla podpořena grantovým projektem GA ČR 14-18344S.

XXX/ 228. CHITOSANOVÉ NANOČÁSTICE PRO CÍLENÝ TRANSPORT DOXORUBICINU

Omastová M.¹, Skaličková S.¹, Milosavljevic V.¹, Ruttkay-Nedecký B.², Eckschlager T.³, Stiborová M.⁴, Adam V.², Kizek R.²

¹ Mendelova univerzita v Brně, ² Ústav chemie a bio­chemie, Mendelova univerzita v Brně, ³ Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN v Motole, Praha, ⁴ Katedra bio­chemie, PřF UK v Praze

Východiska: Chitosanové nanočástice získávají více pozornosti v oblasti cíleného transportu léčiv díky jejich stabilitě, nízké toxicitě a jednoduché přípravě. Deacetylovaná chitosanová kostra glukosaminových jednotek má vysokou hustotu nabitých aminoskupin, které umožňují silné elektrostatické interakce s proteiny a geny. Ně­kte­rá cytostatika, jako je doxorubicin, vykazují toxicitu, přes svou vysokou terapeutickou účinnost. Systém nanočástic pro dopravu léčiv se tedy stává slibným přístupem v léčbě onkologických onemocnění. Materiál a metody: Chitosan, doxorubicin, tripolyfosfát (TPP) a další chemikálie byly zakoupeny od firmy Sigma Aldrich (USA), pokud není uvedeno jinak. 5 g chitosanu bylo rozpuštěno v 3% kyselině octové a za stálého míchání byl přidán TPP (0,25 % w/ v). Chitosanové nanočástice s enkapsulovaným doxorubicinem byly připraveny stejným způsobem, k TPP (0,25 % w/ v) byl přidán doxorubicin (0,5 mg/ ml). Velikost částic byla zjištěna koloidním analyzátorem (Malvern Zetasizer Nano ZS, United Kingdom). Fluorescenční spektra byla naměřena pomocí fluorimetru Tecan Infinite 200 PRO (TECAN, Švýcarsko). Vzorky byly měřeny 2krát na 96jamkové mikrotitrační destičce Costar (Fisher Scientific, USA). Všechna měření probíhala ve fluorimetru Tecan Infinite 200 PRO (TECAN, Švýcarsko) při 30 °C. Výsledky: Pro přípravu chitosanových nanočástic byl optimalizován přídavek polyaniontu TPP (100–250 µg), kdy bylo pozorováno exponenciální snížení velikosti nanočástic 4–13 nm s vyšším přídavkem TPP. Dále byla sledována účinnost enkapsulace porovnáním fluorescence volného doxorubicinu uzavřeného do chitosanových nanočástic. Z výsledků vyplývá, že účinnost enkapsulace je 70 % a množství enkapsulovaného léčiva odpovídá 5 µg doxorubicinu na 1 mg chitosanových nanočástic. Závěr: Cílem experimentu bylo vytvoření chitosanových nanočástic jako nosič pro doxorubicin a jeho charakterizace. V dalších experimentech bude testována toxicita doxorubicinu uzavřeného do chitosanových nanočástic na tkáňových kulturách.

Práce byla podpořena grantovým projektem GA ČR 14-18344S.

XXX/ 229. Titanoceny jako protinádorová léčiva

Koubková L.¹, Karban J.², Pinkas J.³, Vyzula R.⁴, Vojtěšek B.¹, Hrstka R.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Ústav chemických procesů AV ČR, v. v. i., Praha, ³ Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha, ⁴ Klinika komplexní onkologické péče, MOÚ, Brno

Východiska: 60. léta 19. století přinesla objev jednoho z nejúspěšnějších protinádorových léčiv – cisplatiny, které se dodnes používá v klinické praxi k léčbě karcinomu varlat, ovaria, hlavy a krku. Úspěch cisplatiny spustil vlnu syntézy a testování dalších látek ze skupiny organokovových sloučenin. Největším nedostatkem cisplatiny je časný rozvoj rezistence a vedlejší účinky postihující zejména ledviny a sluchový aparát, což se stalo dalším důvodem k hledání nových účinnějších a méně toxických derivátů platiny (karboplatina, oxaliplatina), ale i dalších organokovových sloučenin obsahujících jiné přechodné kovy. Materiál a metody: Byl analyzován set organokovových sloučenin s centrálním atomem titanu (titanoceny) a testován jejich účinek na ovariálních nádorových liniích (A2780 senzitivní k cisplatině, A2780cis se získanou rezistencí k cisplatině a SK-OV-3 mající vnitřní cisplatinovou rezistenci) pomocí MTT testu. Na základě výsledků MTT testu jsme vybrali tři titanoceny (dva účinné č. 14 a č. 15 a jeden neúčinný č. 22) ke studiu mechanizmu jejich působení. Výsledky byly srovnávány s cisplatinou. Byl analyzován účinek vybraných látek na proliferační aktivitu, distribuci buněk v průběhu buněčného cyklu a vliv těchto látek na změnu exprese proteinů sloužících jako markery stresu endoplazmatického retikula, apoptózy a autofagie pomocí imunochemických metod. Výsledky: Proliferační křivky po působení titanocenů a cisplatiny ukázaly, že sloučeniny č. 14 a č. 15 snižují proliferační aktivitu A2780, A2780cis i SK-OV-3 buněk ve srovnání se sloučeninou č. 22, která nevykazovala žádný antiproliferační efekt. Analýza buněčného cyklu po 24hodinovém působení titanocenů ve srovnání s kontrolou neprokázala významné změny v distribuci buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu na rozdíl od cisplatiny. Byla však prokázána schopnost titanocenů narušit homeostázu endoplazmatického retikula projevující se indukcí proteinu CHOP (C/ EBP homologous protein) vedoucí následně k buněčné smrti. Tento mechanizmus indukce buněčné smrti byl následně podpořen průkazem přítomnosti LC3-B II proteinu v autofagosomech, především po expozici buněk sloučenině č. 15. Závěr: Studované látky potvrdily důležitost výzkumu organokovových sloučenin, jenž by mohl vést k nalezení nových protinádorových látek s odlišným mechanizmem působení, než má cisplatina. Objevení nové účinnější a méně toxické struktury by mohlo být příslibem pro léčbu nádorů rezistentních k cisplatině.

Práce byla podpořena OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101 a NPU I (LO1413), MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805) a GAČR P206/ 12/ G151.

XXX/ 230. Konformační stavy chaperonu Hsp70 ovlivňujevazba kochaperonu Tomm34

Trčka F.¹, Ďurech M.¹, Man P.², Vojtěšek B.¹, Müller P.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² AV ČR, v. v. i., Praha

Východiska: Ovlivnění celkového stavu buněčného proteomu prostřednictvím nízkomolekulárních inhibitorů je v současnosti nezřídka využíváno v terapii nádorových onemocnění. Mezi cíle inhibice patří zejména chaperony Hsp70, Hsp90 a komponenty proteazomu. Pro zpřesnění účinnosti léčby je nezbytné identifikovat a funkčně popsat proteinovou strukturu rozsáhlých chaperonových komplexů. V nich se kromě vlastních chaperonů, Hsp70 a Hsp90, vyskytují také pomocné proteiny zvané kochaperony. Jejich úloha spočívá v časově a prostorově specifické regulaci aktivity molekulárních chaperonů Hsp70/ Hsp90. V nedávné minulosti byla pomocí precizních expresních a proteomových studií změřena zvýšená exprese kochaperonu Tomm34 v karcinomech prsní žlázy a kolorekta. O molekulární funkci tohoto kochaperonu je však jen nemnoho informací. Funkce chaperonu Hsp70 je závislá na jeho ATPázové aktivitě. Vazba ATP vyvolává rozsáhlé konformační změny v molekule chaperonu a umožňuje cyklus vazby a uvolnění jím skládaných substrátů. V eukaryotních buňkách je často prostorově koordinována funkce chaperonu Hsp70 s chaperonem Hsp90, a to prostřednictvím „strukturních“ kochaperonů, které obsahují vazebná místa pro oba chaperony. Mezi dobře studované „strukturní“ kochaperony patří protein HOP. Jeho doménová struktura je velice obdobná proteinu Tomm34. V této práci jsme se zabývali srovnáním vlivu vazby kochaperonů HOP a Tomm34 na konformační stav chaperonu Hsp70. Metody a výsledky: Zatímco vazba kochaperonu HOP nevykazovala významnou závislost na konformačním stavu chaperonu Hsp70, komplex Tomm34-Hsp70 se tvořil převážně v přítomnosti konformace chaperonu Hsp70 navozené přídavkem ATP. Dále jsme pomocí analýzy vodíko-deuteriové výměny ve struktuře chaperonu Hsp70 a následné cílené mutageneze odhalili, že mezidoménové kontakty v molekule Hsp70 vyvolané vazbou ATP jsou nezbytné pro vazbu kochaperonu Tomm34. Dalším zjištěním bylo, že kochaperon Tomm34, na rozdíl od proteinu HOP, inhibuje skládání denaturované luciferázy zprostředkované chaperonovým komplexem Hsp70/ Hsp40 in vitro. Závěr: Tyto výsledky naznačují, že protein Tomm34 se kromě „strukturní“ funkce v architektuře Hsp70 chaperonové mašinérie podílí také na regulaci konformačních přechodů chaperonu Hsp70. To má za následek ovlivnění schopnosti chaperonu Hsp70 vázat a uvolňovat proteinové substráty a předávat je chaperonu Hsp90.

Práce byla podpořena Evropským fondem pro regionální rozvoj a státním rozpočtem České republiky (OP VaVpI – RECAMO CZ.1.05/ 2.1.00/ 03.0101 a LO1413 a GAČR P301/ 11/ 1678). Podpořeno MZ ČR – RVO (MOÚ, 00209805).

XXX/ 235. Proteomická analýza potencionálnych prometastatických cieľov odvodených z porovnania bunečných línií s rôznym migračným potenciálom

Faktor J.¹, Knopfová L.², Potěšil D.³, Beneš P.², Šmarda J.², Vojtěšek B.¹, Bouchal P.¹

¹ RECAMO, MOÚ, Brno, ² Ústav experimentální bio­logie, PřF MU, Brno, ³ CEITEC – Středoevropský technologický institut, MU, Brno

Východiská: Mamárny karcinóm je jedným z najfrekventovanejších malígnych ochorení u žien. Na základe bio­logickej heterogenity ochorenia možno rozlíšiť rôzne subtypy s rôznym metastatickým potenciálom. Včasná dia­gnóza metastatického fenotypu a využitie selektívnych liečiv zameraných na prometastatické ciele môže rapídne znížiť mortalitu mamárneho karcinómu. V súčasnosti nie sú k dispozícii rutinne využívané terapeutické ciele pre liečbu metastáz karcinómu prsníka alebo pre včasnú dia­gnózu ochorenia. Cieľom nášho výskumu je hľadanie nových prometastatických proteínov a bio­markerov metastázovania lokalizovaných na bunečnom povrchu. Materiál a metódy: Porovnaním dvoch variant línie karcinómu prsníka MDA-MB 231 s rôznym migračným potenciálom boli nájdené potencionálne prometastatické ciele. Metódou SILAC bola získaná ľahká varianta proteínov z kontrolnej línie a ťažká varianta proteínov z viac migrujúcej línie. Vzhľadom k hydrofobicite a nízkemu zastúpeniu transmembránových proteínov boli vzorky bio­tinylované linkerom, ktorý selektívne značí proteíny na extracelulárnych doménach. Biotinylované proteíny boli obohatené na streptavidínovej sepharóze. Kvantifikácia hladín ľahkej a ťažkej formy proteínov s extracelulárnou doménou prebehla pomocou LC-MS/ MS. Pre validáciu získaných výsledkov bola použitá metóda SWATH umožňujúca reprodukovateľnú kvantifikáciu proteínov vo väčšom počte vzoriek. Pre SWATH validáciu bolo použitých 96 tkanivových vzoriek rôznych subtypov primárneho a metastatického mamárneho karcinómu. Pomocou štatistického modulu MSstats boli hľadané signifikantné rozdiely v hladinách vybraných proteínov. Výsledky: Zo 129 dysregulovaných transmembránových proteínov bolo pre SWATH validáciu vybraných 21 proteínov. Analýza SWATH dát pre proteín catechol o-metyl transferase (COMT) dokazuje signifikantnú up-reguláciu v metastatických triple-negatívnych tumoroch v porovnaní s primárnymi triple-negatívnymi tumormi (p < 0,05). Na základe výsledkov z MSstats zvýšené hladiny COMT korelujú s agresívnejšími subtypmi a vyšším grade mamárneho karcinómu (p < 0,05). Záver: Experiment potvrdzuje funkčnosť optimalizovaného postupu pre identifikáciu proteínov s extracelulárnou doménou. Ďalšia validácia je nevyhnutná k potvrdeniu aplikovateľnosti vybraných prometastatických cieľov v liečbe rakoviny.

XXX/ 242. Multiplexová analýza a hledání nových cirkulujících nádorových bio­markerů – pohled bio­analytika

Karlíková M.¹, Topolčan O.², Peštová M.¹

¹ Centrální laboratoř pro imunoanalýzu, LF UK a FN Plzeň, ² Oddělení nukleární medicíny – Laboratoř imunoanalytické dia­gnostiky, LF UK a FN Plzeň

Východiska: Ačkoliv se řada nádorových markerů stanovovaných v séru pacienta již léta využívá zejména pro kontrolu nemocného během léčby či po ní a pro včasný záchyt recidivy, stále chybí markery či jejich kombinace např. pro dia­gnostiku onemocnění. Multiplexová analýza je jednou z metod výběru vhodných kandidátních bio­markerů. Materiál a metody: V této pilotní studii jsme testovali nový multiplexový panel firmy Bio-Rad, obsahující 16 analytů (cytokinů a růstových faktorů, jejich receptorů, angiogenních faktorů, hormonů, …). Metodou xMAP na přístroji MagPix jsme stanovili hladiny bio­markerů ve skupině 39 pacientů s kolorektálním karcinomem (fáze IV) a v kontrolní skupině bez onkologického onemocnění; naším záměrem bylo ověřit analytické parametry uvedeného panelu a vytipovat bio­markery, které se významně liší u pacientů a u kontrol. Výsledky: Zjistili jsme významně odlišné hladiny u osmi bio­markerů; u hormonů (leptin, osteopontin) byly hladiny vyšší u pacientů, naopak u cytokinů, růstových faktorů a receptorů (EGFR, FGF-b, VEGFR-2, PECAM-1, …) byly hladiny u pacientů nižší. Bylo možné nalézt korelace mezi bio­markery a klasickými nádorovými markery. Výsledky plánujeme ověřit na větším souboru pacientů s dobře definovaným klinickým stavem a vybrané markery stanovit zároveň metodou ELISA. Studie potvrdila, že multiplexová imunoanalýza je užitečným nástrojem pro kvantifikaci většího množství analytů a předběžný výběr slibných nových bio­markerů.

XXX/ 278. RNA jako moderní onkologický terapeutický nástroj

Vasina L.¹, Král V.², Králová J.³

¹ Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, ² Epigentest, Praha, ³ Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i., Praha

Cílená molekulární léčba se může stát reálným novým přístupem k inhibici genové exprese na úrovni transkripce a translace. Genová terapie se zabývá základními metodami a směry rozvoje prostředků genové terapie s využitím jak fragmentů DNA, tak modifikovaných oligonukleotidů (např. PNA, petidic nucleic acid). Základní schéma antisense a antigen terapie, spočívající v zablokování přenosu škodlivé informace z mRNA nebo DNA vypadá velmi přímočaré, ale praktická aplikace naráží na řadu zásadních problémů. Tím je především efektivní transport oligodeoxynukleotidu (ODN) do buňky a dále vnitrobuněčná stabilita ODN. Úspěšné nalezení transportních systémů pro ODN rozhodne o tom, zda se skutečně stanou významných lékem budoucnosti. Syntetické antisense oligodeoxyribonukleotidy (ODN) mohou být použity jako sekvenčně specifické inhibitory virální a buněčné genové exprese. Funkční účinnost ODN kriticky závisí na výběru cílové sekvence a efektivní vnitrobuněčné koncentraci. Ta je závislá na transportu do buňky, vnitrobuněčné distribuci a stabilitě ODN v buněčném prostředí. Transport ODN přes buněčnou membránu do požadované buněčné organely představuje jednu z největších obtíží antisense strategie. Polyanionické a hydrofilní ODN nemohou difundovat skrz buněčnou membránu, ale jsou aktivně přijímány buňkami za pomoci endocytózy zprostředkované receptory a pinocytózy v kapalné fázi. Ale oba tyto procesy jsou spíše neúčinné. Bylo provedeno mnoho různých pokusů zlepšit transport ODN do cytoplazmy a/ nebo do jádra. I přes současné zlepšení v transportu ODN do buněk v kultuře je terapie založená na nukleových kyselinách stále často omezena slabým průnikem nukleových kyselin do cytoplazmy a jader buněk. Dnes většina široce používaných a úspěšných přístupů zahrnuje komplexaci ODN s katonickými transportními systémy, které zvyšují jak transport do buňky, tak i stabilitu ODN. Transportní techniky pro ODN: viral/ bacterial vehicles: využívají geneticky modifikované viry a bakterie. Non-viral/ bacterial vehicles: využívají katonické lipidy, bio­kompatibilní polymery, lipozomy, konjugáty ODN s cílenými proteiny, anorganické nosiče. Základní požadavky pro úspěch jsou následující: cílený transport, účinný, disociace transportního komplexu. Z výše uvedeného je zřejmé, že požadavek na transportní systém, který by vyhovoval všem výše uvedeným požadavkům, je velmi vysoký. Způsob řešení, který jsme vyvinuli, spočívá v tvorbě supramolekulárních komplexů mezi polyanionickým terapeutickým nástrojem (ODN/ DNA fragment) a kationickým/ polykationickým ligandem, které budou použity pro stabilizaci ODN/ R.

XXX/ 205. The Biobanking Research Infrastructure BBMRI_CZ as a Critical Tool to Enhance Translational Cancer Research – an interim report 2014

Greplová K.¹, Valík D.², Holub P.³, Knoflíčková D.⁴

¹ Department of Laboratory Medicine, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ² RECAMO, Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno, ³ Institut of Computer Science, MU, Brno, ⁴ Masaryk Memorial Cancer Institute, Brno

Background: We introduce the national research bio­banking infrastructure, BBMRI_CZ. The infrastructure has been established under governance of the Ministry of Education and became a founding member of the European bio­banking infrastructure BBMRI.ERIC. It is designed as a network of individual bio­banks where each bio­bank stores samples obtained from associated healthcare providers. Materials and Methods: The constructed system of bio­banks at BBMRI_CZ consists of two types of storage for patient samples – long-term storage (LTS) repository, and short-term storage (STS) repository. The LTS repository collects various types of tissues (tumour, metastases, non-tumour) classified by dia­gnosis, serum at surgery, genomic DNA and RNA. This part of the bio­bank is filled with low frequency, typically at the time point of patient’s primary surgery. STS repository contains sera only and is iteratively updated at each patient visit to the hospital when the blood specimen is taken for the determination of tumour markers. The STS serum repository thus stores leftovers of tumour marker patient material for a period of up to one year. Results: In the years 2000–2014 bio­bank in MMCI archived in LTS repository the following numbers of bio­logical material: 38,068 tissue aliquots from 9,169 patients, 15,822 serum aliquots from 5,416 patients, 3,160 DNA samples. In the course of 2014 the STS repository archived 45,080 serum samples. Conclusion: The unique design of storing not only the tissue material but also longitudinal strings of sera enables access to patient-derived material during the course of the complex patient treatment, thus reflecting pathophysiological and treatment-induced changes in the course of the disease. Designed this way, the research Biobanks will become truly critical tools to enhance translational cancer research.

This study was funded by European Regional Development Fund and State budget of the Czech Republic (RECAMO: CZ 1.05/ 2.1.00/ 03.0101) and by Ministry of Education, Youth and Sports (BBMRI: LM2010004).

Literature: Holub P, Greplova K, Knoflickova D et al. The Biobanking Research Infrastructure BBMRI_CZ: a Critical Tool to Enhance Translational Cancer Research. Klin Onkol 2012; 25 (Suppl 2): 2S78–2S81.

XXX/ 284. Biobanka ve Fakultní nemocnici v Plzni v rámci evropského projektu BBMRI

Kinkorová J.¹, Topolčan O.², Karlíková M.³

¹ Centrální laboratoř pro imunoanalýzu, FN Plzeň, ² II. interní klinika LF UK a FN Plzeň, ³ Centrální izotopová laboratoř, LF UK a FN Plzeň

Fakultní nemocnice v Plzni se stala součástí významného evropského projektu BBMRI-ERIC (Biobanking and BioMolecular resources Research Infrastructure-European Research Infrastructure Consortium), které je jednou z největších infrastruktur v Evropě. V projektu je zapojeno 54 členů a 225 přidružených organizací a bio­bank z 30 členských států EU. Cílem projektu je vytvořit mezinárodní síť bio­bank pro výzkum nejrůznějších nemocí, pro lepší prevenci, včasnou dia­gnostiku a účinnější léčbu v souladu s principy personalizované medicíny. Fakultní nemocnici v Plzni se stala koncem loňského roku součástí národního „nodu“, který je veden a spravován Masarykovým onkologickým ústavem a jehož součástí je pět dalších pracovišť v ČR. Cílem nově vznikající bio­banky v plzeňské FN je vytvořit bio­banku vzorků bio­logického materiálu pro onkologický výzkum. Metodika: Pro zajištění tohoto cíle je nutné vytvořit: 1) multioborový tým pracovníků, 2) dia­gnózy, u kterých bude materiál odebírán, 3) stanovení podmínek, za jakých budou vzorky odebírány, 4) typ bio­logického materiálu, 5) stanovit systém odběru, označení vzorků, 6) preanalytická pravidla, 7) pravidla aliqutoce vzorků, 8) pravidla účelu, 9) pravidla systému jejich využívání, 10) etická pravidla. Vytvořený multioborový tým je tvořen laboratorními pracovníky (imunoanalýza, bio­chemie, genetik), klinickými pracovníky onkologické kliniky, chirurgických oborů (onkochirurg, neurochirurg, urolog), neurologem lékařem Kliniky zobrazovacích technik a pracovníky Patologického ústavu. Materiál bude odebírán u nemocných s karcinomem prsu, kolorekta, ledvin a prostaty. Bude odebírán následující bio­logický materiál: sérum, plazma a materiál pro izolaci DNA. U všech nemocných bude k dispozici podepsaný informovaný souhlas. Odběr bude prováděn v období stanovení primární dia­gnózy při zahájení a skončení léčby a při každé progresi. Po transportu na laboratorní pracoviště je vzorek aliquotován na přístroji Automate Beckman USA do speciálních zkumavek označených čipem o 30 možných znacích pro popis vzorku a místo jeho uložení. Vzorky budou uloženy při –80 °C do zpracování. O využití vzorků na základě žádosti výzkumného týmu zatím výhradně z fakultní nemocnice rozhodne multioborová komise. V počáteční fázi byla v praxi v pilotním pokusu ověřena možnost vytvoření onkologické bio­banky dostupné úzkému týmu pracovníku výzkumu. Je nutno dořešit především problematiku etickou, anonymizace vzorků a problém harmonizace datových souborů.