Molekulární určení genotypu izolátů Streptococcus agalactiae s netypovatelným sérotypem, Česká republika, 2008–2020

Souhrn

V NRL pro streptokokové nákazy byl v letech 2008–2020 metodou latexové aglutinace určován sérotyp u 1 038 vzorků Streptococcus agalactiae od 972 pacientů. U 43 izolátů (4,4 %) se určení sérotypu nepodařilo a byly označeny jako netypovatelné. Cílem této práce bylo u těchto netypovatelných izolátů určit genotyp metodou multiplexové polymerázové řetězové reakce (mPCR). Genotyp se podařilo určit u celého souboru 43 netypovatelných izolátů. Nejčastěji byl zjištěn genotyp V (41,9 %), následován genotypem Ia (20,9 %). U izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem převažoval sérotyp III (29,2 %) a sérotyp V byl z hlediska výskytu na 2. místě (26,2 %). Byla získána kompletní data o výskytu sérotypů/genotypů S. agalactiae v České republice v letech 2008–2020. Monitorování výskytu sérotypů a genotypů je důležitou součástí zavádění případné vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe.

Klíčová slova:

Streptococcus agalactiae – genotyp – sérotyp

ÚVOD

Streptococcus agalactiae (streptokok skupiny B, Group B Strep, GBS) je grampozitivní, kataláza negativní, fakultativně anaerobní opouzdřený kok řadící se do řetízků, vytvářející na krevním agaru beta-hemolýzu, která je obvykle méně výrazná než u Streptococcus pyogenes.

Na povrchu bakterie se nachází skupinově specifický sacharidový antigen, řadící S. agalactiae do skupiny B v systému séroskupin streptokoků podle Lancefieldové [1]. Pouzdro obklopující S. agalactiae je tvořeno polysacharidy, které jsou typově specifické, na základě jejich složení se určuje 10 sérotypů – Ia, Ib, II až IX [2]. S. agalactiae, u kterých nelze určit sérotyp, se nazývají netypovatelné (nontypeable, NT). Polysacharidové pouzdro S. agalactiae zprostředkovává bakterii ochranu před navázáním komplementu, brání opsonizaci a fagocytóze. Kapsulární polysacharidy tak představují nejvýznamnější faktor virulence S. agalactiae a jsou využívány při navrhování vakcín proti tomuto agens [3]. Polysacharidy pouzdra jsou tvořeny opakujícími se strukturami monosacharidů glukózy, galaktózy, kyseliny N-acetylneuraminové a N-acetylglukosaminu, jejichž pořadím je určen sérotyp [4]. U všech sérotypů je polysacharidový řetězec ukončen kyselinou N-acetylneuraminovou (Neu5Ac, kyselina sialová), která zprostředkovává maskování S. agalactiae za humánní buňky, které mají na svém povrchu též vázanou kyselinu N-acetylneuraminovou. Terminální kyselina N-acetylneuraminová dále umožňuje vazbu bakterie na Sia receptory (tzv. Siglecs – Sialic acid-binding immunoglobulin- type lectins) buněk imunitního systému, a tím tlumí imunitní reakci organismu [5]. Genetický podklad tvorby pouzdra S. agalactiae je dán capsule polysaccharide synthesis (cps) operonem. V cps operonu se nachází geny kódující proteiny účastnící se regulačních procesů bakterie, syntézy bakteriálního pouzdra a syntézy kyseliny sialové [6].

Současným standardem v určování sérotypu S. agalactiae je latexaglutinační test. Izolát s netypovatelným sérotypem neaglutinuje s žádným testovacím sérem, případně reaguje pozitivně s více séry. Příčinou netypovatelnosti izolátu je nízká či žádná exprese kapsulárního polysacharidu, která je způsobena alterací či inaktivací tvorby pouzdra různými typy mutací převážně v genech cps [7]. Nejčastější změnou způsobující ztrátu pouzdra je jednobodová mutace, vytvářející v sekvenci nukleotidů cps genu předčasný stop kodon. Dalším důvodem netypovatelnosti izolátu může být výskyt kapsulární strukturální varianty, která nereaguje s žádným nyní dostupným typově specifickým sérem [7, 8].

Pomocí molekulárně genetických metod lze identifikovat části sekvencí genů cps tvořících pouzdro a na základě toho poté určit genotyp. Stejně jako u sérotypů je rozlišováno 10 genotypů – Ia, Ib, II až IX.

Do Národní referenční laboratoře pro streptokokové nákazy (NRL/STR) jsou doručovány izoláty S. agalactiae získané od pacientů se symptomatickým infekčním onemocněním včetně infikovaných kožních defektů, abscesů, sepsí a novorozeneckých sepsí a meningitid a též izoláty od novorozenců s prokázaným nosičstvím S. agalactiae. V NRL/STR je provedeno potvrzení identifikace S. agalactiae a určení sérotypu latexaglutinační reakcí s kapsulárním antigenem. Pokud se takto nepodaří určit sérotyp, jedná se o izolát s pravděpodobně netypovatelným sérotypem a v rámci dalšího dourčení se provádí molekulárně genetické vyšetření genotypu.

MATERIÁL A METODIKA

V této studii jsme se zaměřili na izoláty S. agalactiae, které byly do NRL/STR doručeny v letech 2008–2020. Jednalo se o 1 038 izolátů od 972 pacientů. V několika případech bylo od jednoho pacienta vyšetřeno současně několik vzorků. Tyto duplicitní či triplicitní vzorky byly testovány se shodným výsledným sérotypem, pouze v jednom případě se sérotypy určené u jednoho pacienta lišily. V dalším zpracování dat se vycházelo z dat bez duplicitních vzorků se stejným sérotypem. Izoláty byly získány z infekčních onemocnění i z nosičství.

Z 972 izolátů se u 43 (4,4 %) nepodařilo určit sérotyp latexaglutinačním testem a byly označeny jako netypovatelné. Většina netypovatelných kmenů nereagovala s žádným latexaglutinačním sérem, ve dvou případech kmen reagoval s více séry.

Ze 43 izolátů s netypovatelným sérotypem bylo 29 získáno od žen a 14 od mužů.

V souboru 43 izolátů bylo 12 prokázáno u případů symptomatického infekčního onemocnění. Jednalo se o 6 pacientek ženského pohlaví a 6 pacientů mužského pohlaví, věkové rozložení pacientů bylo 56–85 let, pouze v jednom případě se jednalo o 34letou pacientku po porodu. Z 12 případů symptomatického infekčního onemocnění se v 7 případech jednalo o invazivní onemocnění (invazivita infekce byla stanovena na základě zaslaného materiálu – jednalo se o bakteriální kulturu z žilní krve) a v 5 případech byl izolát získán ze stěru z kožního defektu, z abscesu a z moče, tedy z neinvazivních infekčních onemocnění.

Ze 43 netypovatelných izolátů se v 31 případech jednalo o nosičství, kdy 4 izoláty byly získány od gravidních žen ze stěrů z oblasti pochvy a 27 izolátů bylo získáno převážně z kožních stěrů od 26 novorozenců a od 1 kojence (8 mužského pohlaví a 19 ženského pohlaví).

U 43 izolátů s netypovatelným sérotypem bylo provedeno vyšetření genotypu pomocí metody multiplexové polymerázové řetězové reakce (mPCR).

Izoláty S. agalactiae byly kultivovány na krevním agaru (Oxoid) přes noc při 35–37 °C v normální atmosféře. Dlouhodobě jsou kmeny skladovány v kryozkumavkách (ITEST KRYOBANKA B, ITEST plus s.r.o.) při -70 °C ve sbírce NRL/STR.

Potvrzení správné identifikace S. agalactiae bylo prováděno určením skupinově specifického antigenu pomocí komerční soupravy (Streptococcal grouping kit, Oxoid Diagnostic Reagents).

Sérotyp byl určován komerčním latexaglutinačním testem (ImmuLex Strep-B Kit, Statens Serum Institut, Dánsko).

Izolace DNA izolátů s netypovatelným sérotypem byla provedena pomocí komerční soupravy (QIAamp DNA mini kit, Qiagen).

Určení genotypu u netypovatelných S. agalactiae bylo prováděno metodou multiplexové PCR se zobrazením výsledných amplikonů pomocí gelové elektroforézy. Principem mPCR metody podle Imperi [9] je identifikace sekvencí typických pro jednotlivé genotypy Ia, Ib, II až IX v genech cpsG, cpsI, cpsJ a cpsN, dále se určuje přítomnost genu cpsL, který slouží jako vnitřní pozitivní kontrola správné identifikace S. agalactiae.

VÝSLEDKY A DISKUSE

U celého souboru 43 izolátů S. agalactiae s netypovatelným sérotypem se podařilo určit genotyp. Ve studovaném souboru byl molekulárně geneticky nejčastěji určen genotyp V (18 izolátů), následován genotypem Ia (9) a III (8), 3x byly určeny genotypy Ib a II a 1x genotypy IV a VI.

Ze 7 invazivních izolátů byl určen ve 4 případech genotyp V, 1x byly určeny genotypy Ia, Ib, a II. U izolátů z neinvazivních onemocnění byl 3x určen genotyp V a 1x genotypy Ia a III. Celkem byl genotyp V zjištěn u 7 z 12 izolátů z invazivních i neinvazivních infekčních onemocnění – tabulka 1.

V souboru 31 netypovatelných izolátů S. agalactiae prokázaných z nosičství byl nejčastěji určen genotyp V (11 případů), genotyp Ia a III (po 7 případech), po 2 případech genotypy Ib a II a 1x byly určeny genotypy IV a VI.

U 929 izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem doručených v letech 2008–2020 byl nejčastěji určen sérotyp III (284 izolátů), následován sérotypem V (255), Ia (125) a II (109), další sérotypy jsou již méně časté – graf 1.

Byly získány kompletní výsledky sérotypu/genotypu u všech izolátů S. agalactiae zaslaných do NRL/STR v letech 2008–2020.

Četnost jednotlivých sérotypů vs. genotypů se liší mezi izoláty určenými latexaglutinací a molekulárně geneticky, kdy latexaglutinací nejčastěji určeným sérotypem byl sérotyp III a molekulárně geneticky byl nejčastěji určen genotyp V, následován genotypem Ia. Izoláty s netypovatelným sérotypem a s genotypem V byly poměrově nejčetněji určeny i v dalších studiích [10], důvod tohoto zjištění není zcela jasný, možným vysvětlením je sklon některých linií izolátů S. agalactiae genotypu V ke genetické a antigenní diverzitě [8].

Molekulárně genetické testování izolátů s netypovatelným sérotypem nám zajišťuje stanovení genotypu. Pokud se nepodaří určit genotyp, nelze vyloučit, že by se mohlo jednat o izolát s novým kapsulárním typem.

Zjišťování četnosti jednotlivých sérotypů a monitorování počtu netypovatelných izolátů hraje roli při případném zavádění vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe. Ve vývoji jsou v současnosti polyvalentní vakcíny polysacharidové, které obsahují typově specifické polysacharidy konjugované na proteinový nosič. Dále je ve vývoji proteinová vakcína založená na tvorbě protilátek proti N-terminálním doménám membránových proteinů Rib, AlphaC a Alp 1-3. Proteiny Rib, AlphaC a Alp 1-3 jsou vázány na povrchu téměř všech izolátů S. agalactiae a jejich struktura je převážně homologní napříč izoláty.

Jak je známo ze zkušeností s multivalentními konjugovanými vakcínami proti Streptococcus pneumoniae, typově specifické vakcíny mohou vytvářet selekční tlak na populaci bakterií, což může vést ke zvýhodnění bakterií se sérotypy ve vakcíně neobsaženými a dále bakterií bez pouzderného antigenu. Při případném zavedení polyvalentní polysacharidové vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe tedy nelze vyloučit podobnou situaci tzv. sérotypového replacementu, který vidíme u Streptococcus pneumoniae. Též by mohlo dojít k četnějšímu výskytu S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, jehož pouzdro je méně výrazně vytvořeno, či netvoří pouzdro vůbec, a tím by bakterie unikala pozornosti postvakcinačních protilátek.

V rámci prevence invazivních onemocnění vyvolaných S. agalactiae u novorozenců je v České republice doporučeno testovat všechny gravidní ženy na přítomnost S. agalactiae ve stěru z vaginální sliznice a z rekta v 35. až 37. týdnu těhotenství. V případě pozitivního záchytu se rodičce podává antibiotická profylaxe (intrapartum antibiotic prophylaxis, IAP). Profylaxe se zahajuje se začátkem porodní činnosti a pokračuje dále v pravidelných intervalech po dobu trvání porodu. Antibiotikem první volby je penicilin G či ampicilin intravenózní infuzí. Při alergii na penicilin jsou podávány cefalosporiny 1. generace, při anamnéze anafylaktické reakce po penicilinu je indikován klindamycin či vankomycin. IAP se podává i v případě nálezu S. agalactiae v moči gravidní ženy či v případě invazivního onemocnění vyvolaného S. agalactiae u dítěte z předchozí gravidity.

V České republice není zaveden program surveillance invazivních onemocnění vyvolaných S. agalactiae. Do NRL/STR jsou izoláty S. agalactiae z nosičství a invazivních i neinvazivních onemocnění zasílány na bázi dobrovolnosti. Zasílání izolátů do NRL/STR a jejich typizace je významná pro sledování výskytu sérotypů/genotypů v České republice. NRL/STR děkuje všem laboratořím, které izoláty S. agalactiae k typizaci zasílají, a zároveň apeluje na ostatní laboratoře, aby izoláty S. agalactiae především z invazivních onemocnění do NRL/STR zasílaly.

ZÁVĚR

V období 2008–2020 se vyskytlo 43 izolátů S. agalactiae s netypovatelným sérotypem, což představuje 4,4 % ze všech izolátů doručených do NRL/STR. U všech 43 netypovatelných izolátů byl molekulárně geneticky určen genotyp. Nejčastěji byl určen genotyp V (u 41,8 % netypovatelných izolátů), následován genotypem Ia (20,9 %). U izolátů s latexaglutinací určeným sérotypem převažuje sérotyp III (29,2 %) a sérotyp V je z hlediska výskytu na 2. místě (26,2 %).

Netypovatelné izoláty byly získány ze vzorků případů infekčního onemocnění u dospělých a z nosičství u gravidních žen a novorozenců, žádný netypovatelný izolát nebyl původcem infekčního onemocnění novorozence.

V případě zavádění polyvalentní polysacharidové vakcíny proti S. agalactiae do klinické praxe bude třeba zjistit, zda zaváděná vakcína nabízí pokrytí vyskytujících se sérotypů.

Podpořeno MZ ČR – RVO („Státní zdravotní ústav – SZU, 75010330“).

Do redakce došlo dne 13. 1. 2022.

Adresa pro korespondenci:
MUDr. Sandra Vohrnová
Oddělení bakteriálních vzdušných nákaz, CEM
Státní zdravotní ústav
Šrobárova 49/48
100 00 Praha 10
e-mail: sandra.vohrnova@szu.cz

Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2022; 71(4): 203–207