První potvrzený záchyt kmene Staphylococcus argenteus v České republice

Souhrn

Staphylococcus argenteus (S. argenteus) je nový druh koaguláza-pozitivního stafylokoka popsaného v roce 2015. Jedná se o druh, který je fenotypově velmi podobný a geneticky úzce příbuzný se Staphylococcus aureus (S. aureus). Odlišení bylo donedávna možné pouze s použitím molekulárně genetických metod; multilokusové sekvenční typizace a celogenomové sekvenace, které se v rutinních laboratořích vzhledem k časové a finanční náročnosti většinou nepoužívají. Velkým posunem v určování S. argenteus je aplikace metody MALDI-TOF MS, v případě použití aktualizované referenční databáze hmotnostních spekter. V krátkém sdělení bychom chtěli informovat o prvním potvrzeném kmenu S. argenteus izolovaném od pacienta v České republice a pravděpodobně i prvním publikovaném nálezu kmenu S. argenteus ve střední a východní Evropě.

Klíčová slova:

Staphylococcus argenteus – Staphylococcus aureus – MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie

Do současné doby (červenec 2019) bylo popsáno celkem 54 druhů stafylokoků [1], včetně poddruhů se jedná o 66 taxonů. Z toho je 11 koaguláza-pozitivních a 55 koaguláza-negativních. Staphylococcus argenteus (S. argenteus) spolu se Staphylococcus schweitzeri patří k nově popsaným druhům koaguláza-pozitivních stafylokoků. Staphylococcus schweitzeri, izolovaný původně od opic, není na rozdíl od S. argenteus prozatím považován za agens vyvolávající infekce u člověka [2].

První podezření na nový druh stafylokoka fenotypově podobnému S. aureus bylo vysloveno pravděpodobně již v roce 2009. Autoři více studií [3–6] vykultivovali z různých klinických (humánních) materiálů, ale také ze vzorků od opic [7] a netopýrů v Africe [8], stafylokoka, jehož fenotyp byl na základě biochemické typizace velmi podobný fenotypu S. aureus [9]. Tento stafylokok byl nejprve pracovně označen – doslovně přeloženo z angličtiny divergent lineage of S. aureus – „odlišná linie S. aureus“ nebo S. aureus klonální komplex 75 metodou multilokusové sekvenční typizace (MLST) [6, 10]. Nový stafylokok získal definitivní druhový název Staphylococcus argenteus sp. nov. uvedený v roce 2015 na základě dat získaných z celogenomové sekvenace, MLST a odlišných spekter v MALDI--TOF MS v časopise International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology [11]. Do současné doby (červenec 2019) byly osekvenovány genomy 123 různých kmenů S. argenteus, jejichž sekvence jsou přístupné v NCBI databázi. Podle studie autorů Kaden R. et al. (2018) [12] vznikly druhy S. argenteus a S. aureus oddělením od společného předka již přibližně před 41 000 lety.

Uvedený druh byl identifikován a popsán primárně u původních obyvatel v Austrálii, další izoláty byly hlášeny na Novém Zélandě, v jihovýchodní Asii, v Oceánii, ale pravděpodobně také v Jižní Americe [6, 13]. V ostatních zemích byly kmeny S. argenteus zjištěny retrospektivní identifikací kmenů určených jako S. aureus. Zjištěná incidence ve vybraných státech kolísala od méně než 1 %v Barmě [14], 6 % v Laosu [15] nebo ve východní Číně [16] až po 19 % v Thajsku [17]. V Evropě byly také hlášeny potvrzené izoláty S. argenteus, zjištěné přehodnocením identifikace kmenů původně určených jako S. aureus. V Belgii se jednalo pouze o 0,16 % [18], v Dánsku o 0,42 % kmenů [19], ve Švédsku a Norsku byly potvrzeny i kmeny S. argenteus rezistentní k oxacilinu [9, 20, 21]. Dva případy komunitních infekcí – pneumonie a septické artritidy vyvolané kmeny S. argenteus s geny pro Pantonův-Valentinův leukocidin byly hlášeny z Francie [13].

Staphylococcus argenteus patří mezi koaguláza-pozitivní stafylokoky – testy na volnou a vázanou koagulázu jsou pozitivní, dále produkuje enzym hyaluronidázu. Průkaz produkce hyaluronidázy je velmi specifickým testem k odlišení S. aureus od ostatních humánních koaguláza-pozitivních stafylokoků, neboť byla zjištěna pozitivita tohoto testu u více než 99 % kmenů S. aureus [22]. Z animální provenience produkuje hyaluronidázu Staphylococcus hyicus [22]. S. argenteus disponuje stejnými nebo velmi podobnými faktory virulence, včetně genů antibiotické rezistence, jako S. aureus [12]. Vzhledem k faktu, že S. argen-teus neprodukuje stafyloxantin, byl zpočátku tento nový druh mikrobiology považován za méně virulentního stafylokoka, než je S. aureus. Pigment stafyloxantin chrání bakteriální buňky před oxidačním stresem a do určité míry i před zabíjením neutrofily [12]. Později se však ukázalo, že některé kmeny S. argenteus mají ve svém genomu, podobně jako S. aureus, geny pro enterotoxiny sea, sec, sed, hemolyziny hla a hlb nebo Pantonův-Valentinův leukocidin lukSF-PV [2]. Testováním cytotoxicity na HeLa a HT29 buňkách (nádorové cervikální a nádorové buňky tlustého střeva) byla zjištěna schopnost S. argenteus, zejména prostřednictvím alfa-hemolyzinu, vyvolávat nekrózy uvedených buněk [2].

Kmeny S. argenteus byly izolovány jako etiologické agens od pacientů s infekcí kůže a měkkých tkání, purulentní lymfadenitidou [23], abscedující pneumonií, septickou artritidou [13], infekcí kloubní náhrady [24] a bakteriémií. Uvedený druh je u imunokompetentních pacientů schopen vyvolat podobné spektrum infekcí, avšak pravděpodobně s mírnějším průběhem než S. aureus, a to vzhledem k velmi podobnému spektru faktorů virulence, jimiž S. argenteus disponuje [12, 13, 17, 23].

S. argenteus roste dobře na běžných půdách včetně krevního agaru, kde vytváří větší (2 mm) kulaté, hladké a krémově bílé kolonie, které mohou být obklopené zónu úplné hemolýzy. Kolonie S. argenteus nejsou zejména po prvním dnu kultivace příliš odlišné od kolonií S. aureus. Základním, a často okem patrným rozdílem mezi oběma druhy, je neschopnost S. argenteus produkovat žlutý pigment, karotenoid stafyloxantin. S. argenteus postrádá v sekvenci genomu gen crtM, který kóduje syntézu uvedeného pigmentu. Rozdíl v pigmentaci je patrný zejména při kultivaci na čokoládovém agaru při 37 °C po dobu 48 hodin. Nicméně se nejedná o spolehlivý diskriminační znak, neboť přibližně 10 % kmenů S. aureus produkuje stafyloxantin ve velmi malém množství nebo vůbec [2, 9, 11]. Autorský kolektiv ze Švédska Kaden et al. (2018) [11] ve svém sdělení uvedli, že jimi dourčený S. argenteus roste na chromogenním agaru SAID (bioMérieux, La Balme Les Grottes, France) v modrých koloniích, kdežto kolonie S. aureus v koloniích zbarvených zeleně. Spolehlivou, a v mnoha laboratořích dostupnou metodou k odlišení S. aureus od S. argenteus a rovněž od druhu Staphylococcus schweitzeri, se zdá být MALDI-TOF MS, tedy v případě aktualizované databáze hmotnostních spekter druhů. Biochemické testy jsou vzhledem k velké podobnosti fenotypu S. aureus a S. argenteus (tab. 1) vhodné spíše pro potvrzení výsledku z identifikace hmotnostní spektrometrií a pro sledování fenotypových profilů jednotlivých kmenů. K odlišení S. argenteus od S. aureus molekulárně biologickými metodami nelze využít v mnoha laboratořích prováděnou sekvenaci z oblasti 16S rRNA genu, a to vzhledem k jeho úplné identitě u obou druhů. Sekvenace sodA, gap, rpoB a dalších genů by měla druhy spolehlivě odlišit, rovněž je možné využít metody (GTG)5-PCR fingerprinting (repetitivní PCR) [3, 9, 25]. Ve výzkumně zaměřených laboratořích lze samozřejmě k úplné charakterizaci kmenů S. argenteus použít metod MLST a celogenomové sekvenace [9, 12, 21].

Kazuistika a identifikace kmene S. argenteus

Kmen S. argenteus J4348, vykultivovaný od pacienta ve Fakultní nemocnici Hradec Králové (FN HK), byl spíše náhodným záchytem. Pacient, 72letý muž německé národnosti, který cestoval autobusem z Německa na dovolenou do České republiky, byl hospitalizován 8 dní na Neurochirurgické klinice pro poruchu vědomí způsobenou rozsáhlým subdurálním hematomem. V rámci screeningového vyšetření dýchacích cest; tracheálního aspirátu a výtěru z nasopharyngu, byl z obou materiálů vykultivován v nízké kvantitě stafylokok, suspektně morfologicky vypadající jako S. aureus, dobře citlivý k testovaným antibiotikům (tab. 2). Větší krémově bílé kolonie byly na krevním agaru obklopené dvěma zónami hemolýzy, což bylo způsobeno produkcí alfa- i beta-hemolyzinu. Kmen byl metodou MALDI-TOF MS (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Německo) určen jako Staphylococcus argenteus. Jelikož se jednalo o překvapivý nález, identifikace byla opakována, avšak se stejným výsledkem a se skóre 2,031–2,117. V naší laboratoři disponujeme databází MBT Compass Library, Revision H z dubna 2018.

Kmen byl následně odeslán do NRL pro stafylokoky, kde byl podroben MALDI-TOF MS identifikaci, fenotypové charakterizaci a průkazu nuc genu metodou PCR. Metodou hmotnostní spektrometrie byla zjištěna stejná identifikace jako v Ústavu klinické mikrobiologie FN HK, tj. S. argenteus se skóre 2,0. Z diskriminujících fenotypových reakcí byla většina shodná s výsledky pro S. aureus: u kmene J4348 byla zjištěna pozitivita clumping-faktoru, produkce volné koagulázy, hyaluronidázy a rezistence k polymyxinu B.

Výsledky biochemických testů byly většinou shodné s těmi, které uvádí popisová publikace Tong et al. (2015) [11] – viz tabulka 1. Rozdílně kmen J4348 neprodukoval pyrrolidonyl arylamidázu (PYRázu) a naopak okyseloval laktózu. Metodou PCR nebyl zjištěn pro kmeny S. aureus charakteristický nuc gen, jehož přítomnost je ve výše uvedené práci [11] popsána. V literatuře existuje několik publikací, kde autoři uvádí, že u jejich kmenů S. argenteus nebyl nuc gen rovněž detekován [12, 26].

Kmen S. argenteus J4348 byl zaslán do České sbírky mikroorganismů v Brně (CCM), kde byla provedena repetitivní polymerázová řetězová reakce pomocí primeru (GTG)₅ [25]. Podle výsledků této analýzy se jednoznačně přiřadil k typovému kmenu S. argenteus CCM 8870^T = MSHR1132^T. V rámci molekulárně genetických metod je dále vhodné pro určení S. argenteus použít sekvenaci sodA, gap, rpoB a dalších specifických genů [3, 9].

Jedná se o první, v Národní referenční laboratoři potvrzený záchyt Staphylococcus argenteus v České republice. Domníváme se však, že se jedná také o první publikovaný případ ve střední a východní Evropě. V odborné literatuře jsme (viz předchozí text) doposud zaznamenali zprávy o záchytu uvedené bakterie pouze z Francie, Belgie, Dánska a Švédska. Vzhledem k faktu, že se jedná o nového stafylokoka, pravděpodobně s podobnou mírou virulence jako S. aureus, je nutné na nález S. argenteus v klinických materiálech upozornit ošetřujícího klinika. Nález je vhodné doplnit vhodným komentářem tak, aby nedošlo k domněnce, že se jedná o některého z velmi nízce patogenních nebo nepatogenních převážně koaguláza-negativních stafylokoků. Skupina ESGS (ESCMID Study Group for Staphylococci and Staphylococcal Disease) doporučuje ve svém stanovisku nález S. argenteus hlásit klinikovi jako S. aureus komplex. Ke kmenům S. argenteus rezistentním k oxacilinu by se pak mělo v prevenci a kontrole jejich výskytu přistupovat obdobně jako ke kmenům MRSA (oxacilin rezistentní S. aureus) [25].

ZÁVĚR

Je pravděpodobné, že četnost záchytů kmenů S. argenteus v humánních klinických materiálech bude nadále vzrůstat. Svůj podíl bude mít zlepšující se rutinní diagnostika bakterií a širší dostupnost metody MALDI-TOF MS. Tímto sdělením jsme chtěli upozornit na existenci nového druhu stafylokoka úzce příbuzného se S. aureus. Nález S. argenteus v klinickém materiálu by měl být hlášen klinikovi a hodnocen v kontextu se stavem pacienta, neboť se zdá, že jeho klinický význam je podobný S. aureus. Ke kmenům S. argenteus rezistentním k oxacilinu by mělo být v rámci epidemiologických opatření přistupováno obdobně jako ke kmenům MRSA.

Recentně (srpen 2019) byl ze stejného oddělení zachycen z dýchacích cest pacienta další kmen, u kterého vyšla metodou MALDI-TOF MS shodná identifikace: S. argenteus  se skóre: 2,163.

Poděkování

Autoři děkují RNDr. Pavlu Švecovi, Ph.D. z České sbírky mikroorganismů (CCM) v Brně za provedení analýzy kmene S. argenteus J4348 metodou repetitivní PCR.

Práce byla podpořena projektem Ministerstva Zdravotnictví ČR – 17-28539A a částečně projektem MZ ČR – RVO („Státní zdravotní ústav – SZÚ, 75010330“).

Do redakce došlo dne 5. 9. 2019.

Mgr. Rudolf Kukla, Ph.D.

Ústav klinické mikrobiologie FN HK a LF HK

Sokolská 581

500 05 Hradec Králové

e-mail: rudolf.kukla@fnhk.cz