Molekulová patológia endometriálneho karcinómu – prehľad

Souhrn

Endometriálny karcinóm (EC) je vo vyspelých krajinách sveta najčastejšou malignitou ženského genitálneho traktu. EC sa na základe histomorfologických charakteristík delí na endometroidný a serózny karcinóm, resp. na ďalšie zriedkavejšie podtypy (svetlobunkový, mucinózny, neuroendokrinný, nediferencovaný karcinóm a karcinosarkóm). Endometroidný a serózny EC boli podkladom pre tzv. duálnu klasifikáciu EC (typ I a typ II), ktorá zohľadňovala najmä ich epidemiologické, klinické a endokrinné charakteristiky. Ukázalo sa, že časť high-grade seróznych karcinómov (typ II) môže vznikať z endometroidných EC ďalším hromadením genomických zmien a že existujú aj EC, v ktorých sa prekrývajú oba základné typy. Dnes je známe, že za klinickú a histomorfologickú prezentáciu EC sú zodpovedné genetické a epigenetické alterácie, ktoré najčastejšie postihujú gény PTEN, PIK3CA, KRAS, CTNNB1 a TP53, resp. rezultujú do mikrosatelitnej instability. Tieto zmeny sú variabilne zastúpené v oboch typoch EC, a preto sa duálne delenie EC ukázalo ako veľmi rigidné.

Nové klasifikácie by mali predstavovať integrovaný systém, ktorého súčasťou budú aj výsledky analýz génovej expresie a multiparalelného sekvenovania DNA. Na základe súčasných poznatkov boli EC rozdelené do 4 molekulových skupín: a) POLE/ultramutované; b) hypermutované mikrosatelitne instabilné; c) „copy number low“ a d) „copy number high“ podobné seróznym karcinómom. Toto rozdelenie lepšie vystihuje biologické charakteristiky každého EC a je prípravou na individualizáciu terapie.

Kľúčové slová:
endometrium – karcinóm – imunohistochémia – genetika

Endometriálny karcinóm (EC) je vo vyspelých krajinách sveta najčastejšou malignitou ženského genitálneho traktu (1-4). Ročne je na celom svete diagnostikovaných približne 150 000 nových prípadov EC. Závažným epidemiologickým fenoménom pri EC je neustály nárast jeho incidencie (2,4). Preto je potrebné zintenzívniť štúdium etiopatogenetických a rizikových faktorov a hľadať možnosti adekvátnej individualizovanej liečby založenej na identifikácii prognosticky a prediktívne relevantných molekulových parametrov.

Väčšina prípadov (až 75 %) EC je diagnostikovaná vo včasných štádiách ochorenia, t.j. v štádiách I a II FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics), v ktorých 5 rokov prežíva 74 - 91 % pacientok. Na druhej strane v pokročilom štádiu ochorenia, t.j. v IV. štádiu podľa FIGO, sa 5 rokov dožíva len jedna štvrtina, resp. jedna pätina pacientok s EC (4).

Predkladaná práca prezentuje prehľad historických, súčasných a perspektívnych pohľadov na taxonómiu EC, zohľadňujúci úroveň súčasného poznania najmä so zameraním sa na molekulovú podstatu tohto ochorenia.

TAXONÓMIA ENDOMETRIÁLNYCH KARCINÓMOV 

1. Patologická klasifikácia EC

EC predstavuje heterogénne nádorové ochorenie s viacerými histomorfologickými podtypmi vzniknutými na podklade rozličných rizikových faktorov a prekurzorových lézií a vykazujúcimi rozdielnu prognózu (5). V súčasnosti sa v každodennej klinickej praxi využíva klasifikácia EC založená na histopatologických kritériách bunkového typu, stupňa diferenciácie a štádia ochorenia. Na základe komplexného posúdenia týchto parametrov je pacientka následne liečená (6-8). Najčastejším typom EC je endometroidný endometriálny karcinóm (EEC); menej časté sú serózne a svetlobunkové karcinómy, resp. zriedkavejšie typy, ako sú mucinózny, neuroendokrinný, nediferencovaný karcinóm a karcinosarkóm (8). Pacientky vo včasnom štádiu EEC sú liečené len adjuvantnou rádioterapiou, avšak prípady so seróznym typom EC a EEC v pokročilom štádiu ochorenia sú liečené chemoterapiou. Preto je exaktná typizácia kritická pre výber primeranej adjuvantnej terapie (9).

Na základe poznatkov molekulovej biológie je dnes jasné, že iniciácia, progresia a metastázovanie EC sú asociované s genetickými a epigenetickými alteráciami (10,11). Z toho vyplýva, že rozličné podtypy EC sú spojené s rozdielnymi molekulovými zmenami (5). Ukázalo sa, že približne 25 % nádorov, ktoré boli patológmi klasifikované ako high-grade EEC vykazuje molekulový fenotyp podobný seróznym EC, napr. s častými mutáciami TP53 a extenzívnymi somatickými alteráciami počtu kópií celých génov alebo úsekov DNA (somatic copy number alterations - SCNA) (9). Preto diagnostika EC by nemala vystihovať len izolované histomorfologické charakteristiky, ale mala by zohľadňovať aj molekulové alterácie zodpovedné za fenotypové charakteristiky a biologické správanie jednotlivých EC.

2. Duálna klasifikácia EC

Na základe epidemiologických, klinických, metabolických a endokrinných charakteristík boli pred tridsiatimi rokmi EC rozdelené do dvoch patogenetických podtypov, a to na typ I a typ II (12). Základné klinické a patologické charakteristiky oboch typov sú uvedené v tabuľke 1.

Typ I endometriálnych karcinómov

Typ I EC reprezentuje najčastejšiu formu sporadických EC so 70 - 80 % podielom zo všetkých EC (13). Ide o nádory vzniknuté na podklade excesu estrogénov, nulliparity, obezity, zvýšenej expresie hormónových receptorov a endometriálnej hyperplázie. Z hľadiska histopatológie sú to dobre a stredne diferencované EEC s priaznivou prognózou (13,14). 

Molekulová patogenéza EEC

Molekulovo-genetické alterácie, ktoré sú zahrnuté v evolúcii EEC sú sčasti rozdielne oproti tým, ktoré sú zahrnuté pri vývoji typu II EC (ne-endometroidné EC – NEEC) (3) – tab. 2. Potvrdzujú to výsledky komplementárnych DNA analýz, ktoré jasne poukázali na rozdielne génové expresie medzi týmito typmi nádorov. Charakteristickými molekulovými črtami EEC sú najmä mikrosatelitná instabilita (MSI) a mutácie PTEN (Phosphatase and tensin homoloque), PIK3CA (Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphonate 3-kinase, catalytic subunit alpha), KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) a CTNNB1 (β-catenin). Podobne ako pri iných orgánoch, napr. prsník a ovárium, približne 90 % EC je sporadických a zostávajúcich 10 % má hereditárny pôvod (14,15).

MSI bola pôvodne opísaná u pacientov s hereditárnym ne-polypóznym kolorektálnym karcinómom (HNPCC) a tiež v sporadických kolorektálnych karcinómoch. MSI sa vyskytuje v približne 75 % EC asociovaných s HNPCC a v 25-40 % sporadických EC, ale len v ojedinelých prípadoch NEEC (1,4). U pacientov s HNPCC sú prítomné zárodočné mutácie v „mismatch repair“ (MMR) génoch MLH1 (mutL homolog 1), MSH2 (mutS homolog 2), MSH6 (mutS homolog 6) a PMS2 (postmeiotic segregation increased 2) ako prvý zásah (first hit) a EC sa vyvinie až po delécii alebo mutácii v druhej alele týchto génov (second hit) (16). V etiopatogenéze EC sú v súvislosti s Lynchovým syndrómom (LS) najčastejšie a najvýznamnejšie mutácie v MSH6. Ak sa u pacientky s LS vyvinú viaceré nádory, tak EC obvykle vzniká ako neskoršie nádorové ochorenie. Preto má veľký význam genetická konzultácia aj s následnými genetickými testami za účelom dôkazu alebo vylúčenia zárodočných mutácií v MMR génoch, napríklad u pacientov s prvotným kolorektálnym karcinómom (17). Pri sporadických EC je hlavnou príčinou inaktivácie MHL1 hypermetylácia jeho promotora, čím dochádza k MMR deficiencii, ktorá následne vedie k akumulácii mutácií v kódujúcich aj nekódujúcich sekvenciách DNA (tzv. mikrosatelitoch) v dôležitých génoch, ako sú napr. MSH3, BAX, MSH6, BCL10 a APAF1 (3). Tieto alterované gény by mohli byť potenciálnymi cieľmi v procese nádorovej progresie v EC s MSI (1).

PTEN je tumor supresorový gén lokalizovaný na chromozóme 10q23.3. Proteín PTEN plní dve základné biochemické funkcie, a to jednak cestou aktivity lipidovej a na druhej strane aj proteínovej fosfatázy. Lipidová fosfatáza má úlohu v PI3K signálnej ceste, kde negatívne kontroluje PI3K fosforyláciu. Takto zastavuje bunkový cyklus v G1/S cez nadmernú reguláciu inhibítoru cyklín-dependentných kináz (napr. p27) (18). Aktivita proteínovej fosfatázy je zahrnutá v inhibícii fokálnych adhezívnych formácií a potlačení migrácie a tiež v inhibícii rastovým faktorom stimulovanej MAPK signálnej cesty. Ak dôjde k stratám aktivity lipidovej a proteínovej fosfatázy, tak sa zvýši bunkový rast, bunky unikajú apoptóze a môže dôjsť k ich abnormálnej migrácii (13). Inaktivácia PTEN môže byť navodená rôznymi mechanizmami, ako sú delécie (strata heterozygozity - LOH), bodové mutácie alebo hypermetylácia promotora. LOH sa na chromozóme 10q23 vyskytuje v 40 % EC. Somatické mutácie PTEN sú prítomné v 37 - 78 % EEC (1,3,4,16) a sú častejšie v MSI-pozitívnych prípadoch EEC (60 - 80 %) ako v MSI-negatívnych EEC (24 - 35 %) (1,18). Paradoxne, prípady EC s alterovaným génom PTEN sú spojené s lepšou prognózou (1).

PIK3CA je gén lokalizovaný na 3q26.32, ktorý kóduje 110α katalytickú jednotku PI3K (fosfoinozitol 3-kinázu). Mutácie PIK3CA môžu byť lokalizované na helikázovej (exón 9) alebo kinázovej (exón 20) doméne a menej často na exónoch 1-7. Tieto mutácie boli zaznamenané v 24 - 52 % prípadov EC, pričom často koexistujú s mutáciami PTEN. Zaujímavosťou je, že mutácie v exóne 20 sú asociované s nepriaznivými prognostickými faktormi, ako sú high-grade a hlbšia myometriálna invázia (1,3,4). Mutácie PIK3CA sú súčasťou alterácií PI3K-AKT signálnej dráhy v EC a okrem EEC sa vyskytujú aj v NEEC, resp. zmiešaných EEC-NEEC. Navyše až v 43 % EEC sú prítomné aj mutácie PIK3RI, čo je gén kódujúci P85a, ktorý predstavuje inhibičnú podjednotku PI3K (1).

Mutácie KRAS boli zaznamenané v 10 - 43 % prípadov EEC a spolu so zriedkavými alteráciami BRAF sa podieľajú prostredníctvom RAS-RAF-MEK-ERK signálnej dráhy na tumorigenéze EC (1,3,4). Jedným z efektorov RAS je RASSF1A, ktorý zohráva inhibičnú úlohu. Tento býva inaktivovaný v priebehu karcinogenézy a jednou z významných ciest jeho vyradenia z funkcie je hypermetylácia jeho promotora, ktorá bola dokázaná v 85,4 % EEC. Táto alterácia bola zároveň spojená s nepriaznivými prognostickými znakmi, ako sú vyšší histologický grade, hlbšia myometriálna invázia a metastázy v panvových lymfatických uzlinách (19).

Beta-katenínový gén (CTNNB1) je lokalizovaný na 3p21 a kóduje β-katenín, ktorý je zahrnutý v komplexe s E-kadherínom. Tento komplex zohráva dôležitú úlohu v bunkovej diferenciácii a zachovaní normálnej tkanivovej mikroarchitektoniky (1). Pri mutácii v 3. exóne CTNNB1 dochádza k stabilizácii β-katenínového proteínu a jeho cytoplazmatickej a jadrovej akumulácii, a tým k účasti na transdukcii signálu a transkripčnej aktivácii cestou formovania komplexu s DNA viažúcimi proteínmi. Mutácie v 3. exóne sa vyskytujú v 14 - 44 % EEC a pravdepodobne sú spojené s dobrými prognostickými znakmi (1,4).

Z ostatných génov, u ktorých boli opísané mutácie a súvislosť so vznikom EC je ARID1A. Tento gén predstavuje komponent komplexu remodulujúceho chromatín. Mutácie ARID1A alebo strata expresie jeho proteínového produktu BAF250a boli zaznamenané v 29 % low-grade EEC a v 39 % high-grade EEC, resp. 26 % svetlobunkových EC a v 18 % seróznych EC (4).

Pri korelácii low-grade EEC s high-grade EEC sa ukázalo, že oba podtypy vykazujú často mutácie PTEN, PIK3CA, ARID1A, KRAS and CTNNB1, pričom v low-grade EEC chýbajú mutácie TP53. Na druhej strane high-grade EEC majú síce rovnaké mutácie vyššie uvedených génov ako v low-grade EEC, ale navyše sú u nich časté mutácie TP53. Časté mutácie PTEN v EEC potvrdzujú jeho účasť vo včasných štádiách nádorovej progresie. MSI sa vyskytuje rovnako v low-grade EEC ako v high-grade EEC, čo svedčí o tom, že väčšina high-grade EEC môže vznikať progresiou z low-grade EEC (5).

V súvislosti s hereditárnymi formami EC sú okrem vyššie uvedeného LS spomínané Cowdenov syndróm (CS) a Peutz-Jeghersov syndróm (PJS). Ide o autozomálne dominantné hereditárne ochorenia. Pri CS sa vyskytujú hamartómy vo viacerých lokalitách a pacienti sa vyznačujú zvýšeným rizikom vzniku malígnych nádorov v prsníku, štítnej žľaze a v endometriu. Približne 80 % pacientok s CS má zárodočnú mutáciu v géne PTEN. Pri PJS sú časté početné hamartomatózne polypy v gastrointestinálnom trakte a mukokutánne pigmentácie. Pacienti s PJS majú zvýšené riziko vzniku nádorov práve v gastrointenstiálnom trakte a približne 9 % celoživotné riziko pre rozvinutie EC. Približne 80-94 % pacientov s PJS má mutácie génu LKB1, ktorý kóduje serín/threonínovú kinázu, ktorá priamo fosforyluje centrálny metabolický senzor AMPK, a tým sa podieľa na regulácii metabolizmu glukózy, lipidového metabolizmu, bunkovej proliferácie a bunkovej polarite (17).

Prekurzory EEC

Bezprostredným prekuzorom typu I EC je endometriálna intraepitelová neoplázia (EIN), ktorá vzniká z latentných prekanceróznych zmien v morfologicky normálnych endometriálnych žľazách, ktoré vykazujú somatické mutácie PTEN. Výskyt PTEN deficientných latentných prekanceróznych zmien je častý, vyskytujú sa u 43 % premenopauzálnych žien (20-22). Napriek tejto vysokej prevalencii latentných prekanceróznych zmien je výskyt EC relatívne nízky, o čom svedčí celoživotné riziko EC len okolo 2,6 % (22). Ak sa EIN vyvinie, tak až jedna tretina pacientok má zároveň okultný karcinóm a tie pacientky, u ktorých ešte EC nie je vyvinutý, tak tieto majú až 45-násobné riziko vzniku EC v porovnaní s pacientkami s endometriálnou hyperpláziou bez EIN (23). Evolučnú asociáciu medzi EIN a EC dotvárajú aj poznatky o podobných genetických alteráciách medzi EIN a EC. Okrem alterácií PTEN ide o MSI a mutácie CTNNB1. Včasnou zmenou v patogenéze EEC je tiež hypermetylácia MLH1, ktorá sa zvyčajne vyskytuje už v prekurzorových léziách typu atypickej endometriálnej hyperplázie (16,18). Taktiež mutácie CTNNB1 boli opísané už v atypických hyperpláziách endometria, a to najmä v tých, ktoré boli spojené so známkami skvamóznej metaplázie a s tvorbou morúl (1). Strata vyššie opísaného proteínu BAF250a pri mutáciách ARID1A bola zaznamenaná v 16 % komplexných a atypických endometriálnych hyperplázií (1). 

Typ II endometriálnych karcinómov

Typ II EC tvorí približne 10 - 20 % EC. Tento typ vzniká u starších, štíhlych žien, bez hormonálnych alebo metabolických zmien a podkladom jeho vzniku je atrofické endometrium. Ide o NEEC, ktoré sú spojené so zlou prognózou (4,12-14). Tento typ je charakterizovaný seróznym EC a pravdepodobne sem možno zaradiť časť iných zle diferencovaných fenotypov, ako sú svetlobunkový EC, high-grade EEC, nediferencovaný karcinóm a karcinosarkóm (22,24).

Molekulová patogenéza NEEC

Na molekulovej úrovni sú NEEC spojené s mutáciami p53, značne redukovanou expresiou E-kadherínu, amplifikáciou HER2 alebo nadmernou expresiou HER2 proteínu, alteráciami p16 a tiež génmi zúčastňujúcimi sa na regulácii kontrolného bodu pre správnu funkciu deliaceho vretienka (mitotic spindle checkpoint) (1,3). Výraznou molekulovou črtou NEEC je chromozómová instabilita. Tento fenomén je charakterizovaný viacpočetnými získaniami alebo stratami častí chromozómov a je spojený s aneuploidiou (16).

Primárnym genetickým defektom pri NEEC sú teda mutácie p53, ktoré sa vyskytujú v 75 - 100 % NEEC, pričom vo vyššie opísaných EEC sú alterácie p53 zaznamenané len v približne 10-20 % prípadov, a to najmä v high-grade nádoroch (1,3,4,18). Za normálnych okolností po poškodení DNA nastáva akumulácia p53 v jadre, čo vedie k zastaveniu bunkového cyklu inhibíciou cyklín D1 fosforylácie Rb génu a zahájením apoptózy. Pri mutáciách p53 dochádza k akumulácii nefunkčného p53 proteínu, ktorý pôsobí ako dvojito negatívny inhibítor „wild-type“ p53, čím dochádza k propagácii aberantných buniek (18).

HER2/neu je onkogén, ktorý kóduje transmembránový receptor s tyrozín-kinázou funkciou, ktorý je zahrnutý v prenose signálu (18). Amplifikácia HER2 alebo nadmerná expresia jeho proteínu bola zaznamenaná v 27 - 44 % NEEC (1,4,16).

Inaktivácia regulátora bunkového cyklu p16 bola dokázaná v 40-45 % NEEC, v porovnaní s 10 % EEC (16,18). Tumor supresorový gén p16 je lokalizovaný na 9p21 a kóduje regulátorový proteín bunkového cyklu. Pri inaktivácii p16 dochádza k nekontrolovanému bunkovému rastu (18). Hlavnými mechanizmami inaktivácie p16 sú delécie a hypermetylácia (16).

Redukovaná expresia E-kadherínu môže byť spôsobená LOH alebo hypermetyláciou promotora. Strata heterozygozyty 16q22.1 bola zaznamenaná v 60 - 62 % seróznych karcinómov a v 87 % svetlobunkových karcinómov, ale len v 22 % EEC (16,18). E-kadherín je transmembránový proteín, ktorého intracelulárna doména sa viaže pomocou katenínu na cytoskeletálny aktín. Znížená expresia E-kadherínu je spojená so stratou medzibunkových kohezívnych spojení a uľahčuje motilitu nádorových buniek. Nádory s negativitou E-kadherínu sú zle diferencované NEEC asociované so zlou prognózou (18). Medzi gény zodpovedné za reguláciu deliaceho vretienka patria STK15, BUB1 a CCNB2. Z nich STK15 je esenciálny pre segregáciu chromozómov a funkciu centrozómov. Tento gén je často amplifikovaný v NEEC (3,16).

Ďalším génom opísaným najmä v súvislosti s vývojom NEEC je PPP2R1A, ktorý kóduje a-izoformu podjednotky PP2A holoenzýmu, ktorý je považovaný za predpokladanú súčasť tumor supresorového komplexu. Mutácie PPP2R1A boli identifikované v približne 40 % seróznych EC a v 5 % EEC (1,3,4). Hladina hormónových receptorov je v NEEC podstatne nižšia ako v EEC (1,3,4,9). Ako už bolo vyššie spomenuté, menej častými alteráciami v NEEC v porovnaní s EEC sú alterácie typu MSI, mutácie PTEN, KRAS, CTNNB1 a PIK3CA (1).

Prekurzory NEEC

V roku 2004 bol postulovaný nový model karcinogenézy seróznych karcinómov (25-27), podľa ktorého serózne EC vznikajú predovšetkým v atrofickom endometriu. V ňom najprv nastáva akumulácia p53 v morfologicky normálnych endometriálnych bunkách (tzv. p53 signatúra) a neskôr dochádza k vytvoreniu tzv. endometriálnej glandulárnej dysplázie (EGD) s prechodom do serózneho endometriálneho intraepitelového karcinómu (EIC), z ktorého sa v konečnom štádiu vyvinie invazívny serózny karcinóm (7,22,26,27). EGD sa vyskytuje v 53 % prípadov s EIC, resp. seróznym EC (22). EGD vykazuje cytologické zmeny a alterácie medzi normálnym endometriom a seróznym EIC (25), ide o stratu bunkovej polarity, nukleárny hyperchromatizmus a trojnásobne zväčšené jadrá so zreteľnými jadierkami a minimálne formovanie papíl. V EGD boli zaznamenané alterácie p53, HER2, CDKN2A, Nrf2 a IMP3. Účasť EGD v karcinogenéze NEEC bola potvrdená aj na myšacom modeli. V štádiu EIC sa ďalej pridružujú molekulové abnormity PPP2R1A, FBXW7 a PI3K (27). Vzhľadom k tomu, že boli opísané prípady s propagáciou EIC do peritoneálnej dutiny, mal by EIC byť považovaný za bezprostredný prekurzor serózneho EC. EIC sa vyskytuje v približne 90 % prípadov s invazívnym seróznym EC (22) a len zriedka je diagnostikovaný bez vyvinutého serózneho EC. EIC vykazuje obdobné mutácie p53 a bunkové atypie ako okolitý serózny EC (22). Mutácie p53 sú prítomné v 80 % EIC. Bolo postulované, že mutácia p53 v jednej alele sa vyskytuje vo včasnej fáze karcinogenézy serózneho karcinómu a následná alterácia druhej alely sa objavuje neskôr pri progresii do karcinómu (18). Intenzita farbenia p53 proteínu v seróznych léziách je charakteru „všetko alebo nič“, čo svedčí pre bodové alebo „nonsence“ mutácie génu p53. Na porovnanie je expresia p53 v EEC len sporadická, t.j. len v ojedinelých bunkách (27). Niektoré ďalšie alterácie, napr. polymorfizmy exónu 4 BsTUI p53, sú taktiež spojené so vznikom EC alebo s nepriaznivými prognostickými ukazovateľmi (stupeň diferenciácie, typ II, angioinvázia a hĺbka myometriálnej invázie (28,29).

Limity duálnej klasifikácie EC

Duálny model sa ukázal byť užitočnou pomôckou pri zaraďovaní EC podľa daných kritérií, pretože sčasti zohľadňoval molekulové charakteristiky. Oba typy podľa Bokhmana boli na molekulovej úrovni definované ako homogénne entity s charakteristickými genetickými alteráciami, avšak ako sa neskôr ukázalo, takmer všetky známe molekulové zmeny sa môžu nájsť v oboch typoch EC, aj keď v rozdielnej, resp. štatisticky významnej distribúcii (4). Pritom odlíšenie oboch typov EC je dôležité, pretože oba typy vyžadujú odlišný terapeutický prístup a majú rozdielnu prognózu (30). Časom sa ukázali viaceré limity duálneho rozdelenia, a tieto nedostatky si vyžiadali revíziu a najmä inkorporovanie nových poznatkov o genomike do nových klasifikačných systémov. Pôvodná duálna klasifikácia EC bola zostavená Bokhmanom v roku 1983. Jeho model bol založený na klinických a epidemiologických charakteristikách žien s EC v bývalom Sovietskom zväze a rozlíšenie oboch typov bolo realizované na morfologickej báze (12,13). Aj keď išlo nesporne o nadčasovú klasifikáciu, podľa ktorej je možné aj v súčasnosti klasifikovať väčšinu EC, predsa len došlo k viacerým novým poznatkom a faktorom, ktoré v čase jej vzniku neboli známe, resp. došlo k ich zavedeniu v nedávnej dobe, napr. poznatky v oblasti molekulovej genetiky a zavedenie hormónovej substitučnej liečby. V pôvodnom Bokhmanovom modeli taktiež neboli zahrnuté ostatné high-grade EC, ako sú svetlobunkové a nediferencované karcinómy a karcinosarkómy (4) a neboli zohľadnené ani hereditárne syndrómy, ako je LS, CS a PJS.

Časom sa ukázalo, že okolo 10 - 19 % EEC je high-grade a majú klinické, histopatologické a molekulové črty prekrývajúce sa s oboma typmi EC. Podobne nie všetky serózne EC sú prototypmi typu II EC, napr. približne 2 % seróznych EC vzniká na podklade endometriálnej hyperplázie a až jedna pätina seróznych EC nie je spojených s hlbokou myometriálnou inváziou (4). Podľa novších poznatkov niektoré z NEEC pravdepodobne vznikajú z EEC formou ďalšej nádorovej progresie, resp. dediferenciácie (3,13,31). Preto nie je prekvapujúce, že niektoré z nádorov vykazujú zmiešané charakteristiky na klinickej, patologickej a molekulovej úrovni (3,31). V súčasnosti sa tieto nádory označujú ako hybridné alebo morfologicky indeterminované karcinómy, keď vykazujú prekrývajúce sa črty najmenej dvoch entít, napr. endometroidný verzus serózny karcinóm, alebo serózny verzus svetlobunkový karcinóm a mali by sa zároveň odlíšiť od zmiešaných epitelových nádorov, v ktorých sú prítomné najmenej dve separátne a odlišné komponenty a každý z komponentov sa prezentuje aspoň 10 %-ným podielom (32). V niektorých nediferencovaných karcinómoch sa nachádzajú okrsky dobre, resp. stredne diferencovaného EEC. Takéto nádory by sa mali označovať ako dediferencované karcinómy. Predominantnou molekulovou črtou vo väčšine z nich je MSI. V ostatných takýchto nádoroch nebola prítomná MSI, ako črta EEC, ale boli dokázané mutácie p53 a amplifikácia alebo nadmerná expresia HER2, ako výsledok neskorých alterácií v priebehu progresie z EEC. Samozrejme, že ak sa tieto alterácie vyskytnú hneď na začiatku nádorového procesu, tak vznikajú de novo zle diferencované EEC alebo ide o serózne karcinómy, ktoré sa vyvinú z EEC (13). Ak sa v zmiešaných EEC-NEEC vyskytuje MSI a alterácie PTEN, KRAS a CTNNB1, tak s veľkou pravdepodobnosťou ide o NEEC, ktoré vznikli z EEC v rámci nádorovej progresie. Na druhej strane je niekedy veľmi ťažké oddiferencovanie high-grade EEC od NEEC, pretože v niektorých high-grade EEC sú prítomné molekulové alterácie charakteristické pre NEEC, ako napr. mutácie p53 (obr. 1, 2) (1). Rozdelenie EC do dvoch typov sa preto ukázalo ako veľmi umelé a príliš rigidné.

Pomerne málo sa vie o molekulových alteráciách karcinosarkómov (malígne zmiešané mülleriánske tumory alebo sarkomatoidné karcinómy), ktoré predstavujú menej ako 5 % EC. Sú to nádory, ktoré vykazujú bifázické črty, t.j. kombináciu malígneho epitelového nádoru so sarkomatoidným komponentom. Na základe súčasných poznatkov by sa mali tieto nádory označovať ako metaplastické karcinómy. Vznikajú na podklade epitelovo-mezenchymálneho prechodu (epithelial to mesenchymal transition - EMT) v EC. EMT predstavuje proces bunkovej transdiferenciácie, pri ktorom epitelové bunky strácajú polaritu a medzibunkový kontakt, reorganizujú svoj cytoskelet, získavajú expresiu mezenchýmových markerov a prejavujú sa migračným fenotypom. Pri EMT bunky získavajú charakteristiky karcinómových kmeňových buniek (CSC) a stávajú sa chemorezistentné (31). Iniciácia EMT môže byť navodená rozličnými signálmi a signálnymi dráhami, ako napr. transformujúcim rastovým faktorom (TGF-beta), tyrozín-kinázovými receptormi a/alebo Wnt. Aktivácia jednej alebo viacerých ciest konverguje v skupine transkripčných faktorov, ako sú Snail1, Slug, ZEB1, ZEB2, E47, E2-2 a Twist, pričom väčšina z nich má schopnosť potláčať E-kadherín, ktorý je zodpovedný za bunkové adhézie a polaritu (1). Fenomén EMT sa prechodne vyskytuje aj v konvenčných EC pri myometriálnej invázii, avšak v karcinosarkómoch je expresia EMT permanentná a vedie k represii niektorých epitelových markerov (napr. E-kadherínu) a k zvýšenej expresii mezenchýmových markerov, čím sa zvýrazňuje sarkomatózny vzhľad v týchto nádoroch. Taktiež dochádza k nadmernej expresii HMGA2 a k mikroRNA signatúre, ktoré sú charakteristické pre karcinosarkómy (3). Štúdie ukázali, že centrálnym mechanizmom kontrolujúcim EMT/CSC predstavuje PI3K/AKT signálna dráha (31). V karcinosarkómoch boli doteraz zaznamenané mutácie TP53 v 44 - 64 %, mutácie PTEN v 11 - 33 %, PIK3CA v 22 - 29 %, PIK3RI v 6 %, ARID1A v 24 %, KRAS v 17 %, PPP2R1A v 21 % a CTNNB1 do 5 % (4). Predpokladá sa, že existujú dve skupiny karcinosarkómov, a to skupina s endometroidným typom mutácií (PTEN a ARID1A) a skupina so seróznym typom mutácií (TP53 a PPP2R1A)(5). 

Epigenetické alterácie

V súčasnosti je karcinóm považovaný za dôsledok genetických a epigenetických alterácií. Oba druhy abnormít veľmi často úzko súvisia a dochádza k ich synergickému efektu, napr. mutovaný PTEN pôsobí ako kľúčový mediátor signálnej dráhy, ale navyše funkcia tohto génu môže byť narušená aj histónovou deacetyláciou v promotorovej oblasti. V ostatných génoch, ako sú p16 a Rb boli taktiež zaznamenané genetické alterácie aj epigenetické zmeny. Epigenetické alterácie sú spojené so zmenami génovej expresie bez korešpondujúcich štrukturálnych zmien genómu. Na rozdiel od genetických abnormít sú epigenetické alterácie reverzibilné a vplyvom nových terapeutických modalít je možné obnoviť narušenú funkciu niektorých génov. Základnými epigenetickými alteráciami sú zmeny metylácie DNA (metylácia/demetylácia DNA) a modifikácie histónov (acetylácie/deacetylácie, metylácie/demetylácie, fosforylácie, ubiquitylácie, sumoylácie) (11,33). Aberantná hypermetylácia je obvykle detekovateľná už v prekanceróznych léziách a je signifikantne zvýšená v malígnych léziách v porovnaní s benígnymi nádormi. Okrem spomínaného MLH1, ďalšími génmi alterovanými hypermetyláciou sú estrogénový receptor a (ERa), progesterónový receptor (PR), inhibítor cyklín-dependentnej kinázy 2A/p16 (CDKN2A/P16), SFRP1 (secreted frizzed-related protein1), SFRP2 a SFRP5 (17), ako aj RASSF1A, GSTP1 a CDH1 (19). V iných prácach bola dokázaná signifikantne vyššia metylácia v géne CDH13 v EC v porovnaní s nenádorovým endometriom. Taktiež bola dokázaná vyššia metylácia v génoch WT1 a GATA5 v pokročilejších štádiách EC a v zle diferencovaných EC. Okrem štúdií, ktoré analyzovali epigenetické alterácie jednotlivých génov sa nedávno podarilo zhodnotenie kompletného DNA metylómu v oboch typoch EC aj s komparáciou s normálnym endometriom. V práci bolo zaznamenaných 27009 metylovaných oblastí v EEC a 15676 epigeneticky alterovaných oblastí v NEEC, ktoré boli rozdielne oproti normálnemu endometriu (34).

Štúdium epigenetických mechanizmov má za úlohu sledovanie dvoch základných cieľov, a to identifikáciu nových nádorových biomarkerov (štúdium uplatňovania globálnej hypometylácie a lokálnej hypermetylácie v promotorovej oblasti supresorových génov v procese karcinogenézy) a hľadanie nových terapeutických možností, napr. cestou regulácie týchto epigenetických modifikácií, napr. cez inhibítory DNA metyltransferáz, resp. demetylujúce látky, inhibítory histónovej deacetylázy (11,33-35). Koncept epigenetických regulácií sa preniesol aj do oblasti regulácie nekódujúcej RNA (33). 

Nekódujúca RNA

Na vzniku malígneho nádoru sa okrem alterácií kódujúcich génov podieľajú aj tzv. nekódujúce RNA, ktoré môžu byť vo forme mikroRNA alebo v podobe dlhej nekódujúcej RNA.

MikroRNA

MikroRNA (miRNA) sú malé nekódujúce molekuly RNA, ktoré na posttranskripčnej úrovni kontrolujú transláciu a stabilitu mRNA. Sú tvorené 20 - 23 pármi báz (17). Jednotlivé miRNA sa môžu súčasne naviazať na viaceré mRNA a ovplyvňovať ich expresiu. Strata tumor-supresorových miRNA a/alebo získanie onkogenických miRNAs vedie ku tumorigenéze a progresii (1,31). V EC, a hlavne v EEC, môžu byť rôzne miRNA znížene (down-regulated) alebo zvýšene regulované (up-regulated). So zníženou reguláciou sú v literatúre uvedené miR-200a, miR-200b, miR-200c, miR-429, miR-203, miR-205, miR-210 a so zvýšenou reguláciou sú spájané miR-410, miR-15b, miR-17-5p, miR-221, miR-222, miR-424 a ďalšie. Napr. prípady EC s metastázami v lymfatických uzlinách bývajú asociované s expresiou miR-200a, miR-203 a miR-429, a to s 80% senzitivitou a 79% špecificitou (17). Expresia miRNA môže byť spôsobená aberantnou DNA hypermetyláciou, o čom svedčí práca Hirokiho et al. (2012), ktorí dokázali zníženú reguláciu 113 a 54 miRNA v EEC a v NEEC. Jedna z miRNA (miR-34b) bola značne znížene regulovaná, a to práve cestou hypermetylácie (36). V poslednom čase sa ukázalo, že miRNA predstavujú kľúčové regulátory viacerých génov a tiež signálov zahrnutých v získaní EMT/CSC charakteristík, napr. v PI3K/AKT signálnej ceste a ovplyvnení génu HMGA-2 (1,31). Niektoré miRNA môžu tiež slúžiť ako diagnostické biomarkery a pre monitorovanie terapie v EC (17). 

Dlhé nekódujúce RNA

Dlhé nekódujúce RNA (lncRNA) sú rozsiahlejšie transkripty (>200 nukleotidov) z intergenických a introgenických oblastí ľudského genómu bez schopnosti kódovať proteíny. Pravdepodobne zohrávajú úlohu pri naväzovaní komplexov modifikujúcich históny na chromatín a pri regulácii transkripcie. Niekoľko lncRNA bolo identifikovaných v súvislosti s vývojom EC, napr. pseudogén PTENP1, ktorý môže regulovať tumor supresorovú úlohu PTEN kompetitívnou väzbou ku niektorým miRNA (1).

3. Genomická klasifikácia

Väčšina doterajších štúdií bola realizovaná na výlučne endometroidných EC a seróznych EC a boli hodnotené len jednotlivé gény alebo signálne dráhy. Až štúdie založené na multiparalelnom sekvenovaní alebo sekvenovaní novej generácie (next-generation sequencing) odhalili široké spektrum genetických alterácií v genóme.

Pri viacúrovňovej evolúcii EC bola zaznamenaná účasť viacerých signálnych dráh, ako sú PI3K/AKT/mTOR, Wnt/β-katenínová signálna transdukčná kaskáda (s APC/β-katenínovou cestou), MAPK/ERK, VEGF/VEGFR ligand-receptorová signálna dráha, Erb signálna cesta, p53/p21 a p16INK4a/pRB (33), z ktorých najvýznamnejšími dráhami s najčastejšími genetickými alteráciami sú PI3K/AKT/mTOR signálna dráha, ktorá reguluje bunkový rast a prežívanie a Wnt/β-katenínová signálna dráha, ktorá reguluje génovú transkripciu a vývoj (4).

Nedávno boli vytvorené viaceré klasifikačné modely na rozlíšenie typu I od typu II EC. Jedným z nich je model založený na analýze rozdielnej expresie 19 génov, pomocou ktorého je možné zaradiť EC do jedného z hlavných typov. V NEEC bola zaznamenaná signifikantná nadmerná expresia v šiestich génoch, a to v L1CAM, CLDN6, RSPO4, PLAG1, FCHO1 a DHCR24 a na druhej strane v EEC bola nadmerná expresia v ostatných 13 génov (PIGR, IHH, TFF3, SPDEF, KIAA1324, C9ORF152, FOXA2, CNGA1, HHAT, UQCR11, MDM2, SORBS2 a PPAP2C). Z týchto génov napr. KIAA1324 je indukovaný estrogénmi, a teda predstavuje dobrý biomarker asociovaný s hyperestrogenickým stavom a s typom I EC. Podobne pri rozlíšení týchto dvoch typov by mohla byť využitá rozdielna expresia klaudínu 1 (CLDN1) a klaudínu 2 (CLDN2) (30).

Najnovšie molekulárne analýzy endometroidných aj seróznych EC založené na erejových technikách (array-based) a multiparalelnom sekvenovaní boli realizované viacerými nezávislými laboratóriami a tiež prostredníctvom projektu The Cancer Genome Atlas (TCGA). Tieto analýzy odhalili niektoré nové štatisticky signifikantne mutované gény v týchto nádoroch (9,37-41). Ide o gény, ktoré sú mutované na štatisticky významnej hladine v porovnaní s normálnym endometriom, a ktoré predstavujú tzv. kandidátne nádorové gény (candidate cancer genes) (42). Na základe výsledkov týchto genomických, transkriptomických a proteomických analýz boli EC rozdelené do štyroch zreteľných molekulových skupín: a/ ultramutované/s mutáciou POLE; b/ hypermutované/s mikrosatelitnou instabilitou (MSI); c/ „copy number low“/mikrosatelitne stabilné (MSS) a d/ „copy number high/serous-like“ (9) – tab. 3.

1. POLE mutované/ultramutované tumory sú charakterizované vysokým mutačným pomerom a „hotspot“ mutáciami v exonukleázovej doméne POLE. Ide o podjednotku DNA polymerázy ε, ktorá zohráva úlohu v replikácii DNA. Ďalej sú prítomné aberácie počtu kópií, narastajúca frekvencia C∀A transverzií a mutácie PTEN, PIK3R1, PIK3CA, FBXW7 a KRAS. Táto skupina EC je mikrosatelitne stabilná, má málo SCNA a je spojená s dobrou prognózou;

2. mikrosatelitne instabilná/hypermutovaná skupina EEC je typicky spojená s MSI spôsobenou metyláciou MLH1 promotora, vysokým mutačným pomerom, niekoľkými aberáciami počtu kópií, rekurentnými posunovými mutáciami RPL22 a mutáciami KRAS a PTEN;

3. „copy-number low“ karcinómy sú mikrosatelitne stabilné nádory charakteru grade 1 a 2 EEC, s nízkym mutačným pomerom, vyznačujúce sa častými mutáciami CTNNB1, ale bez mutácií p53;

4. „copy-number high“ tumory (serous-like) sú charakterizované extenzívnymi „copy-number“ aberáciami a nízkym mutačným pomerom, s rekurentnými mutáciami TP53, FBXW7 a PPP2R1A, zriedkavými mutáciami PTEN a KRAS a sú spojené so zlou prognózou. V tejto genomickej kategórii sú všetky serózne a zmiešané EEC-NEEC a štvrtina EEC s grade 3 (4,9).

Výsledky TCGA štúdie priniesli možnosti praktického uplatnenia v patológii. Hodnotenie génov alebo ich produktov môže poskytnúť dôležité informácie potrebné k spresneniu diagnózy. V diferenciálnej diagnostike endometroidných a seróznych EC je možné použiť sekvenovanie (alebo imunohistochémiu) k vyšetreniu stavu génu TP53 (proteínu p53), PTEN (PTEN), PPP2R1A (PPP2R1A) a ARID1A (ARID1A) alebo vyšetrenie DNA MMR génov (alebo ich proteínov) k stanoveniu exaktnej diagnózy. Napríklad, nádory s mutovaným (alterovaným) TP53 (TP53) alebo PPP2R1A (PPP2R1A), pri „wild“- type (nezmenenom) PTEN (PTEN), ARID1A (ARID1A) alebo DNA MMR génov (alebo ich proteínov) môžu byť diagnostikované ako serózne EC, zatiaľ čo opačný genetický profil svedčí pre endometroidné EC (4).

Treba si však uvedomiť, že doterajší katalóg genetických cieľov v EEC aj NEEC bol spracovaný z analýz primárnych nádorov pred liečbou, takže vyvstáva otázka, či sa v budúcnosti neobjavia nové genetické ciele alebo zmeny v rekurentných alebo perzistujúcich nádoroch refraktérnych na liečbu alebo v ich metastázach. Taktiež neboli patrične analyzované iné zriedkavé podtypy EC, ako sú mucinózne, skvamózne a malobunkové karcinómy a pod. U nich sa predpokladá identifikácia ďalších génov alebo nová kombinácia somatických genetických alterácií, ktoré budú špecifické pre tieto nádorové podtypy (4,42). Vyššie spomínané analýzy realizované TCGA poukázali na to, že serózne EC vykazujú určité prekrývajúce črty s ovariálnymi seróznymi karcinómami a s bazaloidnými prsníkovými karcinómami, napr. mutácie p53 sa vyskytujú v 91 % a 96 % endometriálnych a ovariálnych seróznych karcinómov a v 84 % prsníkových bazaloidných karcinómov. Na druhej strane mutácie PTEN sú vo všetkých týchto nádoroch zriedkavé – len v 1 - 2 %. Tieto poznatky by mohli viesť k novým možnostiam pri vytváraní spoločných terapeutických paradigiem (9).

Z hľadiska aplikácie výsledkov nových genomických analýz do duálneho modelu predstavujú typ I (low-grade) EC heterogénnu skupinu nádorov s MSI (hypermutované), POLE (ultramutované) a s „copy-number low“ fenotypmi, zatiaľ čo do typu II (high-grade) EC sú zaradené serózne karcinómy a časť high-grade endometroidných EC (4).

ZÁVER

Primárna diagnostika EC je založená na histomorfogickom vyšetrení, ktoré poskytuje základné informácie o typizácii, stupni diferenciácie a štádiu ochorenia týchto nádorov. Duálna klasifikácia je nesporne užitočným nástrojom v diagnostike EC, avšak nedokáže klasifikovať časť high-grade EC a EC s prekrývajúcimi sa črtami medzi oboma typmi. Štúdium molekulových mechanizmov nám poskytlo cenné informácie pre pochopenie karcinogenézy EC a zaujatie postoja k predikcii prognózy. Nové poznatky v oblasti genomiky EC poukazujú na nevyhnutnosť integrácie molekulových alterácií do klasifikačných schém a využitie molekulových cieľov pri hľadaní nových terapeutických stratégií (4,18), čo však presahuje rámec predkladaného prehľadu 

POĎAKOVANIE

Autori ďakujú Lige proti rakovine za podporu Projektu nádorovej biobanky a FISH diagnostiky na Ústave patológie SZU a OÚSA v Bratislave. 

PREHLÁSENIE

Autor práce prehlasuje, že v súvislosti s témou, vznikom a publikácií tohto článku nie v konflikte záujmov a vznik ani publikácia článku neboli podporené žiadnou farmaceutickou firmou. Toto prehlásenie sa týka i všetkých spoluautorov.

Adresa pre korešpodenciu:

Doc. MUDr. Karol Kajo, Ph.D.

Ústav patológie SZU a OÚSA

Heydukova 10, 812 50 Bratislava

tel.: +421 2 3224 9536, fax: +421 2 3224 9515

e-mail: karol.kajo@ousa.sk