MOŽNOSTI IN VIVO KONFOKÁLNÍ MIKROSKOPIE NERVOVÝCH VLÁKEN ROHOVKY U DIABETIKŮ

Stáhnout PDF English version

Autoři: M. Česká Burdová ¹; T. Lainová Vrabcová ¹; D. Dotřelová ¹; G. Mahelková ^1,2
Působiště autorů: Oční klinika dětí a dospělých 2. LF UK a FN Motol ¹; Ústav fyziologie 2. LF UK ²
Vyšlo v časopise: Čes. a slov. Oftal., 73, 2017, No. 4, p. 161-167
Kategorie: Původní práce

Souhrn

In vivo konfokální mikroskopie rohovky (CCM) představuje novou, neinvazivní, rychle se rozvíjející vyšetřovací metodu rohovky, která umožňuje zobrazit jednotlivé vrstvy rohovky na buněčné úrovni. Rohovka je průhledná a zároveň nejvíce inervovaná tkáň lidského těla. Diabetická neuropatie (DN) představuje závažnou, až život ohrožující komplikaci diabetes mellitus (DM). Byla prokázána úzká souvislost mezi rozvojem diabetické neuropatie a patologickými změnami subbazálního plexu rohovky. V současné době se věnuje velká pozornost možnosti použití CCM k časnému stanovení DN. Je zajímavé, že morfologické změny nervové pleteně v rohovce předcházejí klinickým projevům DN. Naše práce si klade za cíl podat ucelený přehled o současných možnostech a trendech použití in vivo CCM v souvislosti s hodnocením DN. In vivo CCM se stává důležitá ve vyhledávání pacientů s rizikem rozvoje DN, v diagnostikování již časného stupně DN v presymptomatologickém období, v kvantifikování závažné DN, při sledování a hodnocení terapeutické odpovědi na léčbu DM. Kromě diagnosticko-preventivního významu, představuje stále i výzkumný nástroj důležitý k pochopení patofyziologie změn při DM.

Klíčová slova:
konfokální mikroskopie, rohovka, neuropatie tenkých vláken, diabetes mellitus, diabetická neuropatie

ÚVOD

V současné době narůstá zájem o neinvazivní metody umožňující zobrazit a studovat in vivo tkáně na buněčné úrovni. V oftalmologii je věnována značná pozornost možnostem využití in vivo konfokální mikroskopie rohovky (CCM). O možnostech této nové vyšetřovací metody publikovala již v roce 2010 Pirnerová a kol. [61].

Počet pacientů s DM 1. typu (DM 1) a 2. typu (DM 2) v posledních letech celosvětově značně narůstá. Od počátku 21. století se hovoří již o epidemii DM [78]. Diabetická neuropatie (DN) a retinopatie jsou spolu s diabetickou nefropatií nejvážnější mikroangiopatické komplikace DM. Incidence DN stoupá s délkou trvání diabetu, přičemž její prevalence je až 50 % [16].

V oftalmologii se u pacientů s diabetes mellitus (DM) vedle diabetické retinopatie v současné době věnuje značná pozornost změnám v rohovce a v ostatních tkáních povrchu oka [37].

Abnormality rohovky u pacientů s DM jsou označovány termínem diabetická keratopatie, která zahrnuje i rohovkovou neuropatii. Ta je důsledkem narušení celistvosti nervové pleteně rohovky [78, 37]. V současnosti můžeme nervová vlákna rohovky zobrazit pomocí in vivo CCM. Otevírá se tím prostor pro širokou mezioborovou spolupráci mezi oftalmology, diabetology a neurology. Dosavadní studie naznačují velmi dobrou korelaci úbytku nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky, hodnoceného pomocí CCM, a diabetickou neuropatií (DN) zjištěnou v současnosti používanými klinickými a paraklinickými vyšetřovacími postupy [34].

Společný patofyziologický podklad uváděný v patofyziologických, epidemiologických a některých genetických studiích naznačuje závislost výskytu změn povrchu oka, diabetické retinopatie (zejména těžších stupňů) a DN [28]. Naše práce přináší souhrnný přehled využití CCM k posouzení morfologie nervů rohovky a jejich patologických změn u pacientů s DM.

Nervové zásobení rohovky

Anatomii inervace lidské rohovky se věnovala celá řada studií pomocí světelné a elektronové mikroskopie a v posledních letech také pomocí konfokální mikroskopie rohovky [3, 2, 41].

Rohovka patří mezi tkáně s nejbohatší inervací v lidském těle, s přibližně 7 000 volnými epiteliálními nervovými zakončeními na mm². Hustota nervového zakončení je 300–400krát větší než v lidské pokožce [48]. Nervové zásobení rohovky je tvořeno volnými terminálními zakončeními senzitivních nervových vláken nn. ciliares longi (n. ophthalmicus via n. nasociliaris) pocházejících z n. trigeminus. Nervová vlákna se radiálně větví a procházejí v oblasti limbu do rohovky a vytvářejí stromální nervová vlákna. Přibližně po 1 mm ztrácejí perineurinum a myelinové pochvy, v hloubce 293 ± 106 μm od povrchu rohovky jsou obalené pouze Schwannovými buňkami. Stromální periferní nervy zahrnují jak myelinizované, tak nemyelinizované nervové svazky. V centru stromatu jsou již jen nemyelinizované nervové svazky obsahující axony obklopené amorfní extracelulární matrix [47]. Před průchodem Bowmanovou membránou, v prostoru mezi Bowmanovou mebránou a vrstvou bazálního epitelu, se vlákna větví a vytváří subbazální nervový plexus. Přitom se vlákna otáčí o 90 stupňů směrem k povrchu rohovky, prochází Bowmanovu membránou a končí jako volná subepiteliální nervová zakončení [22, 70]. Vlákna subbazálního nervového plexu probíhají paralelně s povrchem rohovky, proto jsou velmi dobře hodnotitelná ve svém průběhu pomocí nově se rozvíjející zobrazovací metody – in vivo CCM [81]. Nervová vlákna subbazálního plexu jsou směrem od limbu ke středu rohovky stočena ve směru hodinových ručiček a vytvářejí inferonazálně od centra přeslenovitou strukturu. Tato představuje místo s nejhustší sítí nervových vláken [55]. Předpokládá se, že inferonazální posunutí je důsledek smykové síly pohybu víčka během mrkání [15]. Rohovka je zásobována i autonomními sympatickými nervovými vlákny, které pocházejí z nadřazeného cervikálního ganglionu [42]. Není jasné, zda rohovka obsahuje i parasympatická nervová vlákna [47]. Převážnou část vláken tvoří heterogenní senzorická vlákna z 1. větve n. trigeminus. Jednou z hlavních funkcí je přenášet tepelné, mechanické a chemické podněty v podobě bolesti. Smyslové nervy mají svou anatomickou a funkční organizaci. Z pohledu anatomie některé nervy běží paralelně s povrchem oka, zatímco jiné se otáčejí kolmo k povrchu rohovky. Funkčně se liší ve svém chemickém složení, elektrofyziologických vlastnostech a dle odpovědi na excitační stimuly [9]. Podle jejich myelinizace a rychlosti impulzu vodivosti jsou nervy rohovky klasifikovány na:

a) tenká myelinizovaná vlákna (typ A-delta s rychlým vedením s průměrnou rychlostí 6 m/s, vedou ostrou, dobře ohraničenou bolest),
b) nemyelinizovaná vlákna (typ C s pomalým vedením s průměrnou rychlostí menší než 2 m/s, vedou difúzní bolest) [9]. Na základě podnětů, která aktivují nervová zakončení, jsou rozděleny na:

a) mechano-nociceptory (20 % z celkového počtu senzorických nervů rohovky, typ A-delta, zprostředkovávají akutní ostrou bolest v závislosti na mechanickém kontaktu s rohovkou),
b) polymodální nociceptory (70 % všech senzorických nervů rohovky, většinou typ C, přenášejí ostrou a trvalou bolest jako reakci na mechanické, tepelné, exogenní chemické a endogenních zánětlivé látky rohovky),
c) chladové receptory (10 % z celkového počtu senzorických nervových vláken rohovky, kombinace typu A-delta a C, aktivují se v reakci na odpařování slzného filmu, při kontaktu povrchu rohovky se studeným roztokem nebo studeným vzduchem, nebo při poklesu povrchové teploty rohovky pod 33 °C) [9].

Velikost recepční oblasti se mění podle funkční klasifikace nervů. Polymodální nociceptory a mechano-nociceptory mají velkou percepční oblast, zatímco studené receptory jsou nejvíce v perilimbání oblasti [9].

In vivo konfokální mikroskopie rohovky

Pomocí této metody lze hodnotit změny struktury všech vrstev rohovky na mikroskopické úrovni, včetně nervových vláken subbazálního nervového plexu rohovky [20, 31, 33].

Současné metody zjišťování periferní neuropatie zahrnují odebrání anamnézy a klinické vyšetření periferní citlivosti, elektrofyziologie, invazivní biopsie nervových vláken, ev. včetně genetického vyšetření [28, 59, 76, 81]. Naproti tomu in vivo CCM poskytuje rychlé, neinvazivní, optické řezy rohovkou a tím umožňuje kvantitativní analýzu nervových vláken rohovky [25, 76]. Lidská nervová vlákna rohovky jsou obtížně studovatelná ex vivo. Již za 14 hodin po smrti degenerují [9]. Stromální nervy rohovky jsou robustnější a přežívající posmrtně déle oproti subbazálním nervům a jsou proto vhodnější pro in vitro studie rohovky [67].

Pomocí in vivo CCM byly stromální nervy zkoumány méně intenzivně než nervová vlákna subbazálního plexu. Výsledky studií, které se zaměřily na kvantifikaci stromálních nervů [50], nebyly vzhledem k nepříznivému šikmému průběhu pro skenování a řídkému výskytu jednoznačné [26]. Subbazální nervová pleteň je pomocí in vivo CCM velmi dobře zachytitelná a hodnotitelná pro svůj paralelní průběh k povrchu rohovky, který je snímán právě ve frontální rovině [50].

Ke studiu změn nervových vláken subbazálního plexu rohovky je v průběhu posledních dvou dekád používáno několik typů konfokálního mikroskopu rohovky. Používané typy přístrojů mají odlišné technické parametry a používají různé typy skenovacích paprsků. V důsledku technických možností použitých přístrojů se výsledné hodnoty sledovaných parametrů nervových vláken liší. Při porovnání jednotlivých měření je proto nutno brát zřetel na typ mikroskopu. Vzájemně porovnatelné jsou pouze hodnoty z jednoho typu přístroje.

Hodnocení skenů

Hodnocen je celý získaný sken [76] nebo vzhledem k snižující se kvalitě snímků v okrajových částech je možné vyhodnocovat pouze centrální, kvalitně zachycenou část snímku [8].

Pro srovnání výsledků studií je zásadní přesná definice pojmů při hodnocení parametrů skenovaného subbazálního plexu rohovky. Za nejpřesněji hodnotitelné, přesně definovatelné a srovnatelné jsou považovány počet a délka vláken subbazálního nervového plexu [25]. Dalšími hodnocenými parametry jsou počet vedlejších větví (větvení) nervových vláken či počet bodů křížení. Nejobtížněji definovatelná je tortuozita vláken. Přesná definice hodnocených parametrů se vyvíjí postupně. V současnosti většina studií definuje hustotu subbazálních nervových vláken jako celkový počet hlavních nervů na jednotku plochy (CNFD, počet/mm²) [1, 18, 30, 44, 39, 77]. Některé starší studie však uváděly pod tímto termínem počet nervů na snímek [45] nebo také celkovou délku nervů na snímek (mm/snímek) [19, 21], což může být při porovnávání výsledků matoucí. Někdy bývá uváděn počet všech zachycených nervových vláken, hlavních nervových kmenů a větví (t-CNFD, počet/ mm² ev. počet/snímek). Obdobně hustota nervových větví (větvení) bývá definována jako celkový počet nervových větví na jednotku plochy (CBFD, počet/ mm²) [76]. Celková délka nervových vláken je definovaná jako délka všech zachycených nervových vláken na jednotku plochy (CNFL, mm/ mm², ev. mm/snímek) [76] Nejednotnost v metodice je ještě výraznější při stanovení tortuozity. Ve starších studiích byla tortuozita hodnocena subjektivně na stupnici 1–4 [13, 44]. Některé další studie zaváděly automatizované či semiautomatizované hodnocení tortuozity za asistence individuálně zhotoveného softwaru, ale výsledky jsou nejednoznačné [23, 53, 54]. Další možností bylo hodnocení tortuozity dle metodiky, jež byla použita při posuzování tortuozity drobných tepen v kardiologii (CNFT, bezrozměrné číslo, poměr absolutní délky zachyceného nervového vlákna k délce spojnice krajních bodů hodnoceného vlákna) [8, 24]. Při poškození vláken subbazálního nervového plexu klesá hodnota CNFD, t-CNFD, CBFD a CNFL, naopak tortuozita CNFT vláken narůstá. Messmer a kol. upozorňují na fakt, že při současném úbytku nervových vláken (pokles CNFD a CNFL) nemusí být nárůst tortuozity prokázán [44]. Novým parametrem zachytitelným in vivo CCM po několikanásobném zvětšení obrazu je „korálkovitý“ charakter nervového vlákna [32]

Nejednotnost panuje ohledně minimálního počtu snímků potřebných pro reprezentativní kvantitativní analýzu [8, 69, 80].

Diabetická neuropatie

Diabetes mellitus je onemocnění s rostoucím globálním významem. Onemocnění postihuje několik orgánových systémů. Mikroangiopatické komplikace probíhají pod obrazem diabetické nefropatie, retinopatie a neuropatie. Zmíněné komplikace, končící nezřídka selháním ledvin, slepotou nebo amputací končetiny, vedou ke snížení kvality života a celosvětově narůstající zátěži na zdravotní péči a sociální systém.

Snaha odhalit tyto komplikace včas a zamezit jejich další progresi vede k neustálému hledání nových vhodných screeningových metod, které by byly schopné odhalit tyto komplikace v jejich nejranějším stadiu. Proto je také věnována značná pozornost možnému vztahu mezi úbytkem nervových vláken rohovky a přesnější klasifikací DN. Mezi nejčastější DN patří neuropatie senzomotorická [17].

Již v roce 1977 byla popsána souvislost mezi neurotropními vředy rohovky a diabetes mellitus [29]. Následně bylo ex vivo prokázáno snížení hustoty nervů rohovky u experimentálně navozeného diabetu krys [82].

V roce 2000 popsal Rosenberg a kol. souvislost změn subbazálního nervového plexu rohovky a snížení citlivosti rohovky s použitím bezkontaktní esteziometrie u pacientů s DN [65]. Od té doby další studie ukázaly na možnost přesněji kvantifikovat změny subbazálního nervového plexu rohovky [35, 39, 44, 45, 65, 70, 75, 77]. Běžné metody používané ke zjištění DN mají omezenou citlivost pro její detekci v časném stadiu [4, 46, 64]. Potencionálně objektivní, citlivější a přesnější bioptické metody nejsou zase běžně použitelné pro svou invazivitu.

Studie ukázaly, že pacienti s DM 1 nebo DM 2 vykazují výrazné snížení počtu subbazálních nervů rohovky ve srovnání se zdravými subjekty [56, 76, 81]. Bohatá nervová pleteň rohovky zdravého jedince je zachycena na obr. 1. Výrazný úbytek nervové pleteně u pacienta s DM 1 je patrný na obr. 2. Hodnota CNFD rohovky koreluje s klinicky a elektrofyziologicky zhodnoceným stupněm DN [59, 64, 77]. Pokles počtu subbazálních nervů je spojen s příznaky periferní neuropatie a snížením počtu intraepidermálních nervů [64, 77]. In vivo CCM prokázala a kvantifikovala časné poškození malých nervových vláken [27, 39, 77] s dobrou citlivostí a specifičností [77]. Detekována byla již mírná neuropatie [18]. Zejména délka nervových vláken rohovky má vysokou citlivost (91 %) a specifičnost (93 %) pro identifikaci diabetické senzorimotorické polyneuropatie [1, 25]. Ve studiích bylo ověřeno, že změny subbazálního nervového plexu rohovky předcházejí jiným klinickým či elektorfyziologický projevům DN [27, 36, 46, 63]. Je zajímavé, že pokles počtu nervových vláken subbazálního nervového plexu předchází rovněž klinickým příznakům diabetické retinopatie a mikroalbuminurie [8, 59]. Až 50 % pacientů s DM, kteří neměli žádné klinické příznaky DN, již mělo abnormální změny subbazálního nervového plexu. Byly prokázány snížené hodnoty CNFL nejen u jedinců se zvýšenou hodnotou glykovaného hemoglobinu, ale již s poruchou glukózové tolerance. Časný nástup degenerace nervových vláken rohovky při poruše glukózové tolerance a novém záchytu DM 2 [4, 5, 83] podporují hypotézu, že patofyziologie diabetické neuropatie začíná velmi časně po nástupu onemocnění [4, 5, 7, 52, 59, 64]. Ve dvou longitudinálních studiích bylo potvrzeno, že pokles délky nervových vláken rohovky (CNFL) předchází nástupu klinických projevů DN u subjektů s DM 1. Diabetická polyneuropatie (nebo senzomotorická neuropatie) se u těchto subjektů projevila do 3,5–4 let [36, 63]. Longitudinální studie Dehghani a kol. byla zaměřená na rizikové faktory u subjektů se změnami subbazálního nervové plexu bez přítomnosti DN. Po čtyřech letech sledování prokázala úbytek vláken subbazálního nervového plexu v závislosti na klinických a metabolických faktorech jako je věk, hladina glykovaného hemoglobinu a porucha lipidového metabolismu [14]. Změny nervové pleteně byly popsány rovněž u dětí s DM 1 typu [66].

**Obr. 1. Nervová vlákna subbazálního nervového plexu u zdravého subjektu**

**Obr. 2. Nervová vlákna subbazálního nervového plexu u pacienta s diabetes mellitus 1.typu**

Nově byl hodnocen hyperglykémií indukovaný rozvoj korálkovitého charakteru nervových vláken rohovky. Předpokládá se, že je způsoben nahromaděnými mitochondriemi, glykogenovými částicemi a vezikulami. Nárůst korálkovitého charakteru nervového vlákna rohovky byl prokázán ve skupině bez DN a stoupal s narůstajícím stupněm DN. Pozitivně koreloval s poklesem hodnot CNFD a CNFL [32].

Tavakoli a kol. [71] prokázali pokles počtu, délky i větvení nervových vláken pomocí CCM rovněž u skupiny s prokázanou diabetickou autonomní neuropatii (DAN) ve srovnání s DM bez DAN a s kontrolní skupinou zdravých subjektů. Změny korelovaly se stupněm DAN s vysokou citlivostí a specifičností. In vivo CCM by se tak mohla stát také neinvazivním markerem DAN. Tyto výsledky je však třeba ještě ověřit [38, 46].

Pomocí in vivo CCM byla dále prokázána regenerace nervových vláken rohovky u pacientů s DM 1 po transplantaci slinivky břišní, kombinované transplantaci ledvin a slinivky břišní [43, 49, 74], po převedení na kontinuální subkutánní infuzi inzulinu [6] a po zlepšení základních rizikových faktorů vedoucích k DN (především hodnoty glykovaného hemoglobinu, cholesterolu a krevního tlaku) [73].

Jak již zmíněno, degenerace vláken subbazálního nervového plexu rohovky předchází také další cévní mikroangiopatické komplikace DM, diabetickou retinopatii či nefropatii [4, 5, 7, 8, 59, 64, 83]. Studie zaměřená na využití in vivo CCM pro předvídání následného rozvoje diabetické retinopatie a nefropatie však zatím publikována nebyla.

Současné úskalí a omezení in vivo CCM

Při sledování nervových vláken rohovky jsou běžně využívány snímky z centrální oblasti rohovky. Nejvyšší počet nervových vláken rohovky je ve skutečnosti inferonazálně od centra rohovky. Pokles celkové délky nervových vláken v oblasti inferonazálního přeslenu bylo však u pacientů s periferní DN srovnatelné s poklesem CNFL v centrální oblasti rohovky [60]. Přestože v oblasti přeslenu byl snímek více specifický pro periferní diabetickou neuropatii [62, 79], snímání centrální části rohovky nepřineslo snížení využitelnosti in vivo CCM jako diagnostického testu [60].

Někteří autoři upozorňují na možná omezení hodnocení relativně krátkých nervů avaskulární rohovky pro využití sledování poškození dlouhých somatických nervů [40]. Bylo však prokázáno, že změny subbazální nervové pleteně rohovky velmi dobře korelují s poklesem počtu intraepidermálních nervových vláken hodnocených z bioptických vzorků [64] a měřením funkčních změn nervových vláken při DN [68].

Na zvířecích modelech s DN byl navíc prokázán pokles krevního průtoku v zadní ciliární arterii a současný pokles počtu vláken zjištěných pomocí in vivo CCM. Následné zlepšení krevního průtoku po podání inhibitoru vazopeptidázy vedoucí k vazodilataci vedlo k obnově nervové pleteně rohovky [11, 12].

Hodnocení změn nervových vláken rohovky může dále komplikovat prokázaný fyziologický pokles počtu a délky nervových vláken s věkem a nelze vyloučit vliv pohlaví. Proto je snaha vytvořit normativní databázi, která by tyto změny hodnot zohledňovala [35,72]. Nadále existuje nejistota ohledně rasových rozdílů. Dalším úskalím je samotné hodnocení snímků vyžadující zkušenost a také časová náročnost ručního hodnocení obrazu. V současnosti je proto velká pozornost věnována vývoji automatické analýzy obrazu pro rychlou kvantifikaci rohovkových změn [56, 57], která by vykazovala vysokou korelaci s ručním hodnocením, zejména počtu a délky nervových vláken [10, 51, 58]. Standardizace analýzy obrazu in vivo CCM prostřednictvím centralizovaných čtecích center by mohla mít zásadní význam v budoucnosti [56].

In vivo CCM se jeví jako ideální neinvazivní klinická technika, která může hodnotit změny v buněčné patologii rohovky. Z pohledu diabetologie je zájem soustředěn především na subbazální nervovou pleteň v souvislosti s kvantifikací změn malých nervových vláken. S rozvojem automatizované analýzy obrazu a ověřením normativních databází je pravděpodobný rychlý nárůst klinické využitelnosti in vivo CCM při hodnocení nejen DN.

Cílem bude vyhledat pacienty s rizikem rozvoje DN, identifikovat minimální DN, kvantifikovat závažné DN a sledovat průběh nebo posoudit terapeutickou odpověď na léčbu. In vivo CCM tak může do budoucna představovat nejen významný výzkumný, ale také preventivní a diagnostický nástroj.

Podpořeno projektem Ministerstva zdravotnictví koncepčního rozvoje výzkumné organizace 00064203 FN MOTOL a projektem CZ.2.16/3.1.00/24022.

Autoři práce prohlašují, že vznik i téma odborného sdělení a jeho zveřejnění není ve střetu zájmu a není podpořeno žádnou farmaceutickou firmou.

Do redakce doručeno dne 5. 6. 2017

Do tisku přijato dne 20. 10. 2017

Marie Česká Burdová

Oční klinika dětí a dospělých 2. LF UK

a FN Motol

V Úvalu 84

150 06 Praha 5

e-mail: marie.ceska-burdova@fnmotol.cz

Zdroje

1. Ahmed, A., Bril, V., Orszag, A., et al: Detection of diabetic sensorimotor polyneuropathy by corneal confocal microscopy in type 1 diabetes: a concurrent validity study. Diabetes Care, 35(4); 2012: 821–828.

2. Al-Aqaba, M.A., Alomar, T., Miri, A. et al.: Ex vivo confocal microscopy of human corneal nerves. Br J Ophthalmol, 94; 2010: 1251–7.

3. Al-Aqaba, M.A., Fares, U., Suleman, H. et al.: Architecture and distribution of human corneal nerves. Br J Ophthalmol, 94; 2009: 784–9.

4. Asghar, O., Petropoulos, I.N., Alam, U. et al.: Corneal confocal microscopy detects neuropathy in subjects with impaired glucose tolerance. Diabetes Care, 37; 2014: 2643-2646.

5. Azmi, S., Ferdousi, M., Petropoulos, I.N. et al: Corneal Confocal Microscopy Identifies Small-Fiber Neuropathy in Subjects with Impaired Glucose Tolerance Who Develop Type 2 Diabetes. Diabetes Care, 38; 2015: 1502–1508.

6. Azmi, S., Ferdousi, M., Petropoulos, I.N. et al: Corneal confocal microscopy shows an improvement in small-fiber neuropathy in subjects with type 1 diabetes on continuous subcutaneous insulin infusion compared with multiple daily injection. Diabetes Care,38: 2015: e3–e4.

7. Bitirgen, G., Ozkagnici, A., Malik, R.A. et al.: Corneal nerve fibre damage precedes diabetic retinopathy in patients with Type 2 diabetes mellitus. Diabetic Medicine, 31(4); 2014: 431–438.

8. Burdová M.Č., Vrabcová, T.L., Dotřelová, D. et al: Diabetická retinopatie a změny nervových vláken hodnocené konfokální mikroskopií rohovky. Česk Slov Neurol N, 80/113(1); 2017: 59-65.

9. Cruzat, A., Qazi, Y., Hamrah, P.: In vivo confocal microscopy of corneal nerves in health and disease. The Ocular SUrface, 15(1); 2017: 15–47.

10. Dabbah, M.A., Graham, J., Petropoulos, I.N. et al: Automatic analysis of diabetic peripheral neuropathy using multi-scale quantitative morphology of nerve fibres in corneal confocal microscopy imaging. Med Image Anal, 15(5); 2011: 738–747.

11. Davidson, E.P., Coppey, L.J., Holmes, A. et al: Changes in corneal innervation and sensitivity and acetylcholine-mediated vascular relaxation of the posterior ciliary artery in a type 2 diabetic rat. Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(3); 2012: 1182–1187.

12. Davidson, E.P., Coppey, L.J., Yorek, M.A.: Early loss of innervation of cornea epithelium in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats: improvement with ilepatril treatment. Invest Ophthalmol Vis Sci, 53(13); 2012: 8067–8074.

13. De Cilla, S., Ranno, S., Carini, E. et al.: Corneal subbasal nerves changes in patients with diabetic retinopathy: an in vivo confocal study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 50; 2009: 5155–5158.

14. Dehghani, C., Pritchard, N., Edwards, K. et al.: Risk Factors Associated With Corneal Nerve Alteration in Type 1 Diabetes in the Absence of Neuropathy: A Longitudinal In vivo Corneal Confocal Microscopy Study. Cornea, 35; 2016: 847–852.

15. Doane, M.G.: Interactions of eyelids and tears in corneal wetting and the dynamics of the normal human eyeblink. Am J Ophthalmol, 89; 1980: 507–16.

16. Dyck, P.J., Kratz, K.M., Karnes, J.L. et al.: The prevalence by staged severity of various types of diabetic neuropathy, retinopathy, and nephropathy in a population-based cohort: the Rochester Diabetic Neuropathy Study. Neurology, 43; 1993: 817–824.

17. Dyck, P.J., Overland, C.J., Low, P.A. et al.: Signs and symptoms versus nerve conduction studies to diagnose diabetic sensorimotor polyneuropathy: CI vs. NPhys trial. Muscle and Nerve, 42(2); 2010:157–164.

18. Edwards, K., Pritchard, N., Vagenas, D. et al: Utility of corneal confocal microscopy for assessing mild diabetic neuropathy: baseline findings of the LANDMark study. Clin Exp Optom, 95(3); 2012: 348–354.

19. Erie, J.C., McLaren, J.W., Hodge, D.O. et al: The efect of age on the corneal subbasal nerve plexus. Cornea, 24(6); 2005:705–709.

20. Erie, J.C., McLaren, J.W., Patel, S.V.: Confocal microscopy in ophthalmology. Am J Ophthalmol, 148; 2009: 639–646.

21. Grupcheva, C.N., Wong, T., Riley, A.F., McGhee, C.N. et al: Assessing the sub-basal nerve plexus of the living healthy human cornea by in vivo confocal microscopy. Clin Experiment Ophthalmol, 30(3); 2002: 187–190.

22. Guthoff, R.F., Wienss, H., Hahnel, C. et al.: Epithelial innervation of human cornea: a three-dimensional study using confocal laser scanning fluorescence microscopy. Cornea, 24; 2005: 608–613.

23. Guthoff, R.F., Zhivov, A., Stachs, O.: In vivo confocal microscopy, an inner vision of the cornea – a major review. Clin Experiment Ophthalmol, 37; 2009: 100–117.

24 Heneghan, C., Flynn, J., O’Keefe, M. et al.: Characterization of changes in blood vessel width and tortuosity in retinopathy of prematurity using image analysis. Med Image Anal, 6; 2002: 407–429.

25. Hertz, P., Bril, V., Orszag, A. et al.: Reproducibility of in vivo corneal confocal microscopy as a novel screening test for early diabetic sensorimotor polyneuropathy. Diabetic Medicine, 28(10); 2011:1253–1260.

26. Hoşal, B.M., Ornek, N., Zilelioğlu, G. et al: Morphology of corneal nerves and corneal sensation in dry eye: a preliminary study. Eye (Lond), 19(12); 2005:1276–1279.

27. Hossain, P., Sachdev, A., Malik, R.A. et al: Early detection of diabetic peripheral neuropathy with corneal confocal microscopy. Lancet, 366(9494); 2005: 1340–1343.

28. Hosseini, S.M., Boright, A.P., Sun, L. et al.: The association of previously reported polymorphisms for microvascular complications in a meta-analysis of diabetic retinopathy. Hum Genet, 134; 2015: 247-257.

29. Hyndiuk, R.A., Kazarian, E.L., Schultz, R.O. et al: Neurotrophic corneal ulcers in diabetes mellitus. Arch Ophthalmol, 95(12); 1977: 2193–2196.

30. Chang, P.Y., Carrel, H., Huang, J.S. et al: Decreased density of corneal basal epithelium and subbasal corneal nerve bundle changes in patients with diabetic retinopathy. Am J Ophthalmol, 142(3); 2006: 488–490.

31. Chiou, A.G.Y., Kaufman, S.C., Kaufman, H.E., et al.: Clinical corneal confocal microscopy. J. Survophthal, 51; 2006: 482–500.

32. Ishibashi, F., Kojima, R., Taniguchi, M. et al.: The Expanded Bead Size of Corneal C-Nerve Fibers Visualized by Corneal Confocal Microscopy Is Associated with Slow Conduction Velocity of the Peripheral Nerves in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus. Journal of Diabetes Research, 2016; 2016: 3653459.

33. Jalbert, I., Stapleton, F., Papas, E. et al.: In vivo confocal microscopy of the human cornea. Br J Ophthalmol, 87; 2003: 225–236.

34. Jiang, M.S., Yuan, Y., Gu, Z.X. et al.: Corneal confocal microscopy for assessment of diabetic peripheral neuropathy: a meta-analysis. Br J Ophthalmol, 100; 2015: 9–14.

35. Kovalová, I., Horáková, M., Vlčková, E. et al.: Hodnocení rohovkové inervace pomocí konfokální mikroskopie. Česk Slov Neurol N, 80/113(1); 2017: 49–57.

36. Lovblom, L.E., Halpern, E.M., Wu, T. et al.: In vivo corneal confocal microscopy and prediction of future-incident neuropathy in type 1 diabetes: a preliminary longitudinal analysis. Can J Diabetes, 39; 2015: 390–397.

37. Lutty, G.A.: Effects of diabetes on the eye. Invest Ophthalmol Vis Sci, 54; 2013: 81–87.

36. Zochodne, D.W.: Diabetes mellitus and the peripheral nervous system: manifestations and mechanisms. Muscle Nerve, 36; 2007: 144–166.

38. Maddaloni, E., Sabatino, F., Del Toro, R. et al: In vivo corneal confocal microscopy as a novel non-invasive tool to investigate cardiac autonomic neuropathy in Type 1 diabetes. Diabet Med, 32(2); 2015: 262–6.

39. Malik, R.A., Kallinikos, P., Abbott, C.A. et al: Corneal confocal microscopy: a non-invasive surrogate of nerve fibre damage and repair in diabetic patients. Diabetologia, 46(5); 2003: 683–688.

40. Malik, R.A., Newrick, P.G., Sharma, A.K. et al: Microangiopathy in human diabetic neuropathy: relationship between capillary abnormalities and the severity of neuropathy. Diabetologia, 32(2); 1989: 92–102.

41. Marfurt, C.F., Cox, J., Deek, S. et al: Anatomy of the human corneal innervation. Exp Eye Res, 90; 2010: 478-92.

42. Marfurt, C.F., Kingsley, R.E., Echtenkamp, S.E.: Sensory and sympathetic innervation of the mammalian cornea. A retrograde tracing study. Invest Ophthalmol Vis Sci, 30; 1989: 461–72.

43. Mehra, S., Tavakoli, M., Kallinikos, P.A. et al.: Corneal confocal microscopy detects early nerve regeneration after pancreas transplantation in patients with type 1 diabetes. Diabetes Care, 30; 2007: 2608–2612.

44. Messmer, E.M., Schmid-Tannwald, C., Zapp, D. et al.: In vivo confocal microscopy of corneal small fiber damage in diabetes mellitus. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 248; 2010: 1307–1312.

45. Midena, E., Brugin, E., Ghirlando, A. et al: Corneal diabetic neuropathy: a confocal microscopy study. J Refract Surg, 22(9 Suppl); 2006: 1047–1052.

46. Misra. S.L., Craig, J.P., Patel, D.V. et al.: In vivo Confocal Microscopy of Corneal Nerves: An Ocular Biomarker for Peripheral and Cardiac Autonomic Neuropathy in Type 1 Diabetes Mellitus. Invest Ophthalmol Vis Sci, 56; 2015: 5060–5065.

47. Muller, L.J., Marfurt, C.F., Kruse, F. et al: Corneal nerves: structure, contents and function. Exp Eye Res, 76; 2003: 521–42.

48. Muller L.J., Vrensen, G.F., Pels, L. et al.: Architecture of human corneal nerves. Invest Ophthalmol Vis Sci, 8; 1997: 985–994.

49. Navarro, X., Sutherland, D.E.R., Kennedy, W.R.: Long-term effects of pancreatic transplantation on diabetic neuropathy. Annals of Neurology, 42(5); 1997: 727–736.

50. Oliveira-Soto, L., Efron, N.: Morphology of corneal nerves using confocal microscopy. Cornea, 20; 2001: 374–384.

51. Ostrovski, I., Lovblom, L.E., Farooqi, M.A. et al: Reproducibility of In vivo Corneal Confocal Microscopy Using an Automated Analysis Program for Detection of Diabetic Sensorimotor Polyneuropathy. PLoS One, 10: 2015: e0142309.

52. Papanas, N. Vinik, A.I., Ziegler, D. et al: Neuropathy in prediabetes: does the clock start ticking early? Nat Rev Endocrinol, 7; 2011: 682–690.

53. Papanas, N., Ziegler, D.: Corneal confocal microscopy: Recent progress in the evaluation of diabetic neuropathy. J Diabetes Investig, 6; 2015: 381–389.

54. Patel, D.V., McGhee, C.N.: In vivo confocal microscopy of human corneal nerves in health, in ocular and systemic disease, and following corneal surgery: a review. Br J Ophthalmol, 93; 2009: 853–860.

55. Patel, D.V., McGhee, C.N.: In vivo laser scanning confocal microscopy confirms that the human corneal sub-basal nerve plexus is a highly dynamic structure. Invest Ophthalmol Vis Sci, 49; 2008: 3409–12.

56. Patel, D.V., McGhee, C.N.: Quantitative analysis of in vivo confocal microscopy images: a review. Surv Ophthalmol, 58; 2013: 466–75.

57. Petroll, W.M., Weaver, M., Vaidya, S. et al: Quantitative 3-dimensional corneal imaging in vivo using a modified HRT-RCM confocal microscope. Cornea, 32(4); 2013: e36–e43.

58. Petropoulos, I.N., Alam, U., Fadavi, H. et al.: Rapid automated diagnosis of diabetic peripheral neuropathy with in vivo corneal confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 55; 2014: 2071–2078.

59. Petropoulos, I.N., Green, P., Chan, A.W. et al.: Corneal confocal microscopy detects neuropathy in patients with type 1 diabetes without retinopathy or microalbuminuria. PLoS One, 10; 2015: e0123517.

60. Petropoulos, I.N., Ferdousi, M., Marshall, A. et al.: The inferior whorl for detecting diabetic peripheral neuropathy using corneal confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci, 56; 2015: 2498–504.

61. Pirnerová, L., Horáčková, M., Vlková, E. et al.: Využití konfokální mikroskopie rohovky v klinické praxi. Čes a Slov Oftal, 66 (6); 2010: 239–247.

62. Pritchard, N., Dehghani, C., Edwards, K. et al.: Utility of assessing nerve morphology in central cornea versus whorl area for diagnosing diabetic peripheral neuropathy. Cornea, 34; 2015: 756-61.

63. Pritchard, N., Edwards, K., Russell, A.W. et al: Corneal confocal microscopy predicts 4-year incident peripheral neuropathy in type 1 diabetes. Diabetes Care, 38; 2015: 671–675.

64. Quattrini, C., Tavakoli, M., Jeziorska, M. et al.: Surrogate markers of small fiber damage in human diabetic neuropathy. Diabetes, 56(8); 2007: 2148–2154.

65. Rosenberg, M.E., Tervo, T.M., Immonen, I.J. et al: Corneal structure and sensitivity in type 1 diabetes mellitus. Invest Ophthalmol Vis Sci, 41(10); 2000: 2915–2921.

66. Sellers, E.A., Clark, I., Tavakoli, M. et al: The acceptability and feasibility of corneal confocal microscopy to detect early diabetic neuropathy in children: a pilot study. Diabet Med, 30(5); 2013: 630–631.

67. SimoMannion, L., Tromans, C., O’Donnell, C. et al: An evaluation of corneal nerve morphology and function in moderate keratoconus. Cont Lens Anterior Eye, 2005; 28(4); 2005: 185–192.

68. Sivaskandarajah, G.A., Halpern, E.M., Lovblom, L.E. et al: Structure-function relationship between corneal nerves and conventional small-fiber tests in type 1 diabetes. Diabetes Care, 36(9); 2013:2748-55.

69. Smith, A.G., Kim, G., Porzio, M. et al.: Corneal confocal microscopy is efficient, well-tolerated, and reproducible. J Peripher Nerv Syst, 18; 2013: 54–58.

70. Stachs, O., Zhivov, A., Kraak, R. et al.: In vivo three-dimensional confocal laser scanning microscopy of the epithelial nerve structure in the human cornea. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 245; 2007: 569–575.

71. Tavakoli, M., Begum, P., McLaughlin, J. et al: Corneal confocal microscopy for the diagnosis of diabetic autonomic neuropathy. Muscle Nerve, 52(3); 2015: 363–70.

72. Tavakoli, M., Ferdousi, M., Petropoulos, I.N. et al.: Normative values for corneal nerve morphology assessed using corneal confocal microscopy: a multinational normative data set. Diabetes Care, 38; 2015: 838-843.

73. Tavakoli, M., Kallinikos, P., Iqbal, A, et al: Corneal confocal microscopy detects improvement in corneal nerve morphology with an improvement in risk factors for diabetic neuropathy. Diabet Med, 28; 2011:1261–1267.

74. Tavakoli, M., Mitu-Pretorian, M., Petropoulos, I.N. et al.: Corneal confocal microscopy detects early nerve regeneration in diabetic neuropathy after simultaneous pancreas and kidney transplantation. Diabetes, 62; 2013: 254–260.

75. Tavakoli, M., Petropoulos, I.N., Malik, R.A. et al: Assessing corneal nerve structure and function in diabetic neuropathy. Clin Exp Optom, 95(3): 2012: 338–347.

76. Tavakoli, M., Petropoulos, I.N., Malik, R.A.: Corneal Confocal Microscopy to Assess Diabetic Neuropathy: An Eye on the Foot. Journal of Diabetes Science and Technology, 7(5); 2013: 1179–1189.

77. Tavakoli, M., Quattrini, C., Abbott, C. et al: Corneal confocal microscopy: a novel noninvasive test to diagnose and stratify the severity of human diabetic neuropathy. Diabetes Care, 33(8); 2010: 1792–1797.

78. Threatt, J., Williamson, J.F., Huynh, K. et al.: Ocular disease, knowledge and technology applications in patients with diabetes. Am J Med Sci, 345; 2013: 266–270.

79. Utsunomiya, T., Nagaoka, T., Hanada, K. et al.: Imaging of the Corneal Subbasal Whorl-like Nerve Plexus: More Accurate Depiction of the Extent of Corneal Nerve Damage in Patients with Diabetes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 56; 2015: 5417–5423.

80. Vagenas, D., Pritchard, N., Edwards, K. et al: Optimal image sample size for corneal nerve morphometry. Optom Vis Sci, 89(5); 2012: 812–817.

81. Wang, B.E.F., Misra, S.L., Patel, D.V. et al.: In vivo Confocal Microscopy of the Human Cornea in the Assessment of Peripheral Neuropathy and Systemic Diseases. BioMed Research International, 2015; 2015: 951081.

82. Yamada, J., Dana, M.R., Sotozono, C. et al.: Kinoshita S. Local suppression of IL-1 by receptor antagonist in the rat model of corneal alkali injury. Exp Eye Res, 76(2); 2003: 161–167.

83. Ziegler, D., Papanas, N., Zhivov, A. et al.: Early detection of nerve fiber loss by corneal confocal microscopy and skin biopsy in recently diagnosed type 2 diabetes. Diabetes, 63; 2014: 2454–2463