Histologické hodnocení vlivu in vivo aplikace biomateriálů na hojení chrupavky, kosti a kůže

Souhrn

Cílem příspěvku je ukázat přínosy i omezení histologického hodnocení ovlivnění hojení při implantaci podpůrných biomateriálů. Podáváme přehled a fotodokumentaci histologických přehledných a imunohistochemických metod využitelných pro posouzení žádoucích i nežádoucích účinků biomateriálů při hojení tvrdých i měkkých tkání. Diskutujeme jednak mikroskopické hodnocení hojení s využitím semikvantitativních skórovacích systémů, jednak kvantifikaci složení tkáně pomocí jednotlivých spojitých proměnných, které popisují např. počet buněk v jednotkovém objemu, délky cév či vláknitých struktur matrix, plochy povrchů, plošné a objemové podíly složek tkáně, shlukování a kolokalizaci mikroskopických objektů. Strategie systematického nestranného náhodného výběru vede v histologii k významné redukci variability kvantitativních dat.

Klíčová slova:
tkáňové inženýrství – stereologie – imunohistochemie

ÚVOD

Termínem biomateriál označujeme podpůrný prostředek určený k ochraně, posílení nebo náhradě tkání, orgánů nebo tělesných funkcí, používaný v těsném kontaktu s živou tkání (1). Může jít o materiál živočišného či rostlinného původu nebo inspirovaný přírodou. Funkcí biomateriálů je nejčastěji mechanická opora buněk, ale mohou být také modifikovány k podnícení buněčné reakce (např. k adhezi molekul) nebo ke změně jejich chemických vlastností v čase (např. uvolňování růstových faktorů) (2). Od takového podpůrného prostředku očekáváme biokompatibilitu s přijatelnou odezvou u příjemce. Jednou z možností, jak ověřujeme bezpečnost a zároveň účinnost zdravotního prostředku, je analýza vlivu in vivo aplikovaného biomateriálu. Náš příspěvek je zacílen na histologické vyšetření, které je součástí hodnocení účinnosti biomateriálu při in vivo implantaci.

HODNOCENÍ BIOMATERIÁLŮ

Biokompatibilita materiálů je testována z bezpečnostního hlediska jak in vitro, tak in vivo podle vyhlášky ISO 10993 s názvem „Biologické hodnocení zdravotnických prostředků“ (3).

K in vitro analýze například patří zkoušky na cytotoxicitu in vitro, zkoušky interakce s krví a zkoušky na genotoxicitu, karcinogenitu a reprodukční toxicitu.

In vivo analýza zahrnuje zkoušky na dráždivost a přecitlivělost oddáleného typu, zkoušky systémové toxicity, zkoušky lokálních účinků po implantaci a kvalitativní a kvantitativní stanovení degradačních produktů z prostředků zdravotnické techniky vyrobených z polymerních materiálů (4).

Při in vivo hodnocení účinků biomateriálu na hojení se využívají modelová zvířata. Biomateriál je jim implantován do poškozeného orgánu a v různě dlouhých časových úsecích jsou odebírány vzorky pro analýzu. Hojení defektu poté hodnotíme pomocí neinvazivních zobrazovacích metod (skiagrafie, výpočetní tomografie, ultrasonografie, magnetická rezonance) nebo histologickým vyšetřením.

HISTOLOGICKÉ HODNOCENÍ VLIVU BIOMATERIÁLŮ

Při hodnocení vhodnosti biomateriálu lze s výhodou kombinovat testy mechanické, biochemické a histologické. Komplementárně k makroskopickým zobrazovacím metodám, biochemickému vyšetření a mechanickému testování poskytuje histologie informaci o mikroskopické morfologii, lokalizaci, historii i aktuální fázi hojení, tvorbě extracelulární matrix (ECM), vaskularizaci, architektonice tkáně, zánětlivé reakci na přítomnost biomateriálu aj. U vzorků měkkých tkání je nejběžnější metodou chemická fixace a parafinový proces, avšak teplota parafínu při zalévání bločků (56 °C) vede k poškození termolabilních materiálů. Alternativně lze tedy obejít parafinový proces zmražením (cca –25 °C) a pořídit řezy na zmrazovacím mikrotomu.

U vzorků tvrdých tkání lze volit dvojí cestu – výbrusy nedemineralizovanou tkání nebo odvápnění a klasické histologické řezy. Pro techniky výbrusů jsou vzorky po odvodnění zality do pryskyřice (často epoxidové či polymetylmetakrylátové) a cca 0,5 mm tenké plátky uříznuté na přesné pile jsou dále broušeny na tloušťku kolem 60–80 µm a leštěny na konečných 30–60 µm. K získání výbrusů jsou velmi vhodné pomaloběžné pily a poloautomatické brusky používané v petrografii. Výbrus dobarvujeme např. toluidinovou modří, která dokáže odlišit plnohodnotně mineralizovanou kostní tkáň od dosud nekalcifikovaného osteoidu (5). Pokud chceme využít imunohistochemické metody na standardních 3–5 µm silných řezech, bločky tkáně nejprve demineralizujeme působením naředěných anorganických či slabších organických kyselin (kyselina dusičná, kyselina mravenčí aj.) nebo roztokem disodné soli kyseliny etylendiaminotetraoctové (EDTA) (6). Takto demineralizovanou tkáň pak můžeme zalít do parafínu a s využitím speciálních žiletek krájet obdobně jako běžné měkké tkáně.

Části buněk a orgánů na sebe vážou různá barviva, díky tomu jsme pak schopni v mikroskopu odlišit jednotlivé buňky a tkáně při vhodně zvolené metodice barvení. Ke specifickému průkazu antigenů proteinové povahy využíváme jeho reakce s protilátkou. Tabulka 1 shrnuje přehledné barvící metody a běžně využívané imunohistochemické metody využitelné v histologii pro in vivo hodnocení hojení tkání. Některé z těchto metod jsou ilustrovány na obrázku 1 a 2.

Úkolem histologa při hodnocení vlivu biomateriálů je také vybrat správnou techniku hodnocení. Jednou z možností jsou skórovací systémy, v nichž jsou vyšetřované parametry klasifikovány pomocí semikvantitativní bodovací škály, do níž se promítají např. buněčná morfologie, pozitivita pojivové matrix na neutrální či kyselé glykosaminoglykany, pravidelnost povrchu, strukturální integrita, tloušťka, míra integrace s přilehlou tkání, celularita, shlukování chondrocytů, přítomnost degenerativních změn aj. (24,25). Výhodou je relativní robustnost škál umožňující posoudit heterogenní skupiny vzorků a integrálně zhodnotit řadu vlastností do celkové pozice na škále, jejímž jednotlivým parametrům může být přiřazována různá váha dle jejich biologické důležitosti. Na druhou stranu se do výsledků značně promítají zkušenosti hodnotitele, což negativně ovlivňuje reprodukovatelnost výsledků. Robustnost skórovacích systémů se může projevit i jako jejich slabina, protože nadprůměrně dobré skóre v některých parametrech může být kompenzováno podprůměrnými výsledky v parametrech jiných a v celkovém pořadí mohou skončit vzorky s naprosto odlišným biologickým chováním blízko sebe.

Odlišnou strategií je proto kvantifikace složení tkáně pomocí jednotlivých spojitých proměnných, které popisují např. počet buněk v jednotkovém objemu, délky cév či vláknitých struktur matrix, plochy povrchů, plošné a objemové podíly složek tkáně, shlukování a kolokalizaci mikroskopických objektů. V současnosti je pro výzkumné účely k dispozici řada technik analýzy obrazu, která většinou vychází z automatické či poloautomatické segmentace obrazu pomocí prahování v barevných či fázových prostorech, eventuálně může kombinovat více kritérií pro automatické odlišení tkáňových komponent (např. kritéria založená na analýze kontrastu a tvarových charakteristikách). Obrazová analýza dokáže zpracovat velké objemy dat, vyžaduje však vysokou uniformitu vstupních obrazů. Ta nebývá i přes pečlivou laboratorní práci v histologii vždy dosažitelná a spolu s přítomností artefaktů (prachové částečky, precipitáty barviva, mikrotrhliny ve vzorcích) zvyšuje riziko jak nadhodnocení, tak podhodnocení. Proto v řadě aplikací kvantitativní mikroskopie dominují postupy stereologie, s jejíž pomocí můžeme získat informace o trojrozměrném objektu z měření provedených na dvourozměrných rovinných řezech (26). Na rozdíl od prahovacích postupů využívaných v analýze obrazu je ve stereologický přístup založen na efektivním využití stochastické geometrie, kdy jednotlivé charakteristiky vzorku jsou statisticky vypočítávány z interakce hodnocených preparátů s geometricky definovanými testovacími mřížkami. U interaktivních stereologických metod je obvykle posuzování pozitivity histologických struktur ponecháno na posouzení hodnotitele. Vedle vlastního hodnocení mikroskopických objektů je nezbytně nutné zachovat na všech úrovních, kdy dochází k redukci materiálu, nevychýlenou strategii vzorkování (systematický náhodný sběr tkáňových bločků z celého orgánu, výběr histologických řezů k hodnocení a výběr mikroskopických zorných polí při zvětšení potřebném pro jednoznačnou identifikaci mikrostruktur). Zachování strategie systematického nestranného náhodného výběru vede pak k významné redukci variability kvantitativních dat (26). Příklady interpretace takto získaných kvantitativních parametrů jednotlivých tkáňových komponent podává tabulka 2.

Biomateriály, u nichž in vitro a in vivo analýza neprokáže negativní vliv na buňky nebo organismus zvířete a u nichž po analýze usoudíme, že jsou účinnější, postupují dále do jednotlivých fází klinického testování.

SHRNUTÍ

Hodnocení in vivo experimentů při aplikaci biomateriálů zahrnuje analýzu jak měkkých tkání s konvenční metodikou, tak tkání tvrdých, které vyžadují méně obvyklé postupy. Histologie má při in vivo hodnocení vlivu biomateriálů na hojení nezastupitelnou úlohu, protože poskytuje informaci o distribuci a vzájemných vztazích tkáňových nosičů, buněk i mezibuněčné hmoty. Histologie je tak vhodným doplňkem k biochemické a molekulárně-biologické analýze tkáňových vzorků. Zatímco biochemické analýzy vykazují obvykle vysokou reprodukovatelnost i přesnost, často navíc kontrolovanou akreditacemi a kontrolami laboratoří s vyšetřováním testovacích vzorků, jejich data jsou často založena na vyšetření supernatantů a extraktů z tkáňových homogenátů. Při homogenizaci vzorků je však strukturální informace ztracena. Histopatologické vyšetření dále odráží i historii vzorku, a umožňuje tak odlišit déletrvající procesy hojení od akutních změn. Vhodný výběr přehledných či histochemických metod je spolu s náležitými víceúrovňovým vzorkováním orgánů, tkáňových bločků a řezů základem pro kvantitativní posouzení jak žádoucích, tak nežádoucích účinků biomateriálů.

Seznam zkratek

CD cluster of differentiation

ECM extracellular matrix

EDTA etylenediaminetetraacetic acid

HE hematoxylin-eosin

ISO International Organization for Standardization

MAC macrophage

PAS periodic acid Schiff

Práce byla podpořena projektem ED2.1.00/03.0076 Evropského fondu pro regionální rozvoj a částečně financováno z Univerzity Karlovy v Praze, projektem č. SVV266801, projektem PRVOUK č.P36 a projektem č. LO1309 Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy na podporu výzkumu, experimentálního vývoje a inovací Národní program udržitelnosti.

Konflikt zájmů: žádný.

ADRESA PRO KORESPONDENCI:

Mgr. Tereza Kubíková

Ústav histologie a embryologie a Biomedicínské centrum LF v Plzni UK v Praze

Karlovarská 48, 301 66 Plzeň

e-mail: tereza.kubikova@lfp.cuni.cz