Prediktivní diagnostika NSCLC: Jaké jsou standardy v roce 2020?

prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph.D.
Fingerlandův ústav patologie LF UK a FN Hradec Králové

Úvod

Současná diagnostika a nové léčebné metody u některých solidních nádorů velmi názorně ilustrují, jak obrovský skok udělala medicína v posledních 10–15 letech. Pro kvalifikované rozhodování o volbě optimální onkologické léčby je tak na patologa kladeno stále více požadavků. Doby, kdy v patologické diagnostice nádorů postačovalo stanovení vlastní diagnózy (typu nádoru), grade a stadia TNM, jsou nenávratnou minulostí. Součástí vyšetření mnoha různých nádorů je dnes stanovení řady dalších parametrů – morfologických, imunohistochemických i molekulárně genetických, které klinickému lékaři slouží jako prognostické a zejména prediktivní markery. Zatímco prognostický marker nám poskytuje informaci o vyhlídkách (prognóze) nemocného, tedy jak se bude onemocnění u konkrétního pacienta pravděpodobně chovat, prediktivní marker předpovídá (predikuje), která léčba bude pro daného pacienta nejvhodnější.

V onkologii se v posledních dekádách prosadil koncept tzv. personalizované terapie – tedy správné léčby určené správnému pacientovi ve správné chvíli. Tento koncept vychází ze skutečnosti, že neexistují dva identičtí pacienti se dvěma identickými nádorovými onemocněními, a proto je nutné hledat pro každého jednotlivého pacienta optimální nastavení léčby. S rozšiřujícím se poznáním v oblasti etiopatogeneze nádorových onemocnění však narůstá nejistota, co je tou nejsprávnější léčbou pro konkrétního pacienta nebo kolik vyšetření a prediktivních testů je třeba použít, abychom měli jistotu, že nemocnému opravdu nabízíme na míru ušité léčebné řešení, které mu zajistí v rámci možností maximální klinický benefit a současně minimalizuje nežádoucí účinky, jež s sebou každá léčba přináší. Pomoc v tomto dilematu přinášejí vedle klinických vyšetření právě také výsledky prediktivních vyšetření prováděných v laboratořích molekulární patologie.

Prediktivní diagnostika u maligních nádorů je jednou z nejdynamičtěji se rozvíjejících oblastí diagnostické patologie a slouží ke zpřesňování a lepšímu cílení léčby nádorových onemocnění. Principiálně spočívá v detekci znaků ve tkáni, resp. v nádorových buňkách, jejichž přítomnost je jedním ze zcela zásadních faktorů rozhodujících o tom, který typ systémové terapie je pro daného pacienta optimální, tj. s nejlepší nadějí na efekt léčby a současně s minimalizací rizika vzniku nežádoucích účinků. Tyto prediktivní znaky mohou mít povahu abnormálně exprimovaných nebo naopak chybějících proteinů, přestaveb genů či bodových mutací.

Koncepce cílené léčby vychází z předpokladu, že v patogenezi některých nádorů hraje zásadní roli unikátní genetická alterace (mutace, genová přestavba či amplifikace genu), označovaná jako somatická řídicí mutace (driver mutation). Ta je zodpovědná za aktivaci některé ze signálních drah, což vyústí v nekontrolovaný buněčný růst, invazivnost apod. Schematicky lze říci, že pokud je možné nějakým lékem tuto signální dráhu zablokovat, je buněčná proliferace zpomalena nebo zcela zastavena a tím je potlačen růst nádoru. Mutace, které lze takto léčebně ovlivnit, se označují jako drugable mutations (český ekvivalent by mohl být „cílitelné“ či „lékem zasažitelné“ mutace).

Karcinom plic – heterogenní skupina nádorů

Jen málokterá oblast patologie prodělává v poslední době tak dynamický rozvoj jako klasifikace nádorů plic. S rozvojem cílené biologické léčby stoupá význam detailní klasifikace karcinomu plic na molekulární úrovni. Nasazení této terapie je bezpodmínečně závislé na histologické typizaci nádoru patologem a následném stanovení prediktivních markerů. Zpřesňování klasifikace ve skupině tzv. nemalobuněčných karcinomů plic (NSCLC) je zásadním předpokladem identifikace pacientů vhodných pro jednotlivé druhy protinádorové léčby. Oba dva přístupy – tj. přesné morfologické zařazení nádoru i průkaz specifických genetických změn – si navzájem nekonkurují, ale naopak se velmi vhodně doplňují. Konkrétně, v případě nemalobuněčných karcinomů plic je klinicky relevantní identifikace mutací genu EGFR (a to jak mutací tzv. aktivačních, tak rezistentních), přestavby genů ALK a ROS1 a potenciálně i dalších mutací (např. BRAF, KRAS či HER2 nebo fúze genů RET či NTRK).

Jaká prediktivní vyšetření by tedy měla být standardem u všech nemocných s neoperabilním nebo metastatickým nemalobuněčným karcinomem plic v roce 2020? Odpověď na tuto otázku se bude lišit podle toho, o jaký konkrétní typ NSCLC se jedná. Bez stanovené morfologické diagnózy NSCLC totiž nelze racionálně indikovat molekulárně genetická vyšetření. U nemocných s neskvamózním karcinomem (tato „neoficiální“, avšak v klinické terminologii často používaná kategorie zahrnuje zejména 2 skupiny nádorů – adenokarcinomy a jim příbuzné jednotky /nádory s alespoň parciální žlázovou diferenciací/ a nediferencované karcinomy řazené do kategorie NSCLC NOS /not otherwise specified/) je indikované reflexní – tedy automatické – molekulárně genetické vyšetřování všech markerů využitelných v současnosti pro cílenou léčbu, která je hrazena z veřejného zdravotního pojištění; jsou to jmenovitě mutace EGFR a přestavba genu ALK a ROS1. U karcinomů skvamózních (také označovaných jako dlaždicobuněčné či epidermoidní) je výskyt výše uvedených mutací tak vzácný, že reflexní testování není opodstatněné (náklady na identifikaci mutace by byly naprosto nepřiměřené). I u těchto nádorů lze ovšem samozřejmě vyšetření provést na vyžádání ošetřujícího onkologa – děje se tak zejména u pacientů, kteří z nějakého důvodu nezapadají do typického klinického obrazu dlaždicobuněčného karcinomu (např. mladí pacienti, nekuřáci).

Vyšetření EGFR

EGFR je transmembránový receptor kódovaný genem na 7. chromosomu, jehož aktivace vazbou ligandu vede ke spuštění intracelulární signální kaskády. V konečném důsledku dojde k ovlivnění exprese genů vedoucí k buněčné proliferaci. Terapie inhibitory tyrosinkinázy receptoru epidermálního růstového faktoru (erlotinib, gefitinib, afatinib) je indikovaná k léčbě nemocných primárním plicním adenokarcinomem s aktivujícími mutacemi EGFR, četnost se v české populaci pohybuje mezi 10–15 %.

Vyšetření mutací EGFR se provádí v DNA izolované z nádorové tkáně pomocí různých modifikací technologie PCR (nejčastěji real-time PCR), využít lze i metodu sekvenování nové generace (NGS – next generation sequencing).

Materiálem potenciálně použitelným pro molekulárně-genetické vyšetření je jakýkoliv materiál vhodný pro morfologickou diagnózu, tedy vzorek jak cytologický, tak histologický. Podmínkou je přítomnost dostatečného množství (absolutního i relativního) nádorových buněk ve vzorku.

Vyšetření ALK a ROS1

Relativně malou podskupinu adenokarcinomů plic představují nádory, jejichž vznik je patogeneticky dáván do souvislosti s přestavbou genu anaplastické lymfomové kinázy (ALK). U karcinomu plic dochází k inverzi genu ALK a jeho fúzi s různými partnery, nejčastěji se vznikem fúzního genu EML4/ALK. Přestavba genu ALK není častá, dle literárních údajů připadá na < 5 % všech NSCLC. Velmi podobná je situace u nádorů s přestavbou genu ROS1. I zde dochází k intrachromosomovým zlomům a spojení genu ROS1 s různými fúzními partnery. Nádorů vykazujících pozitivitu ROS1 je ještě méně než nádorů ALK-pozitivních, jejich zastoupení se pohybuje mezi 1 a 2 %.

Z výše uvedeného vyplývá, že klíčovým bodem pro cílenou léčbu inhibitory ALK či ROS1 je optimální způsob identifikace pacientů vhodných pro tento typ terapie. Vyšetření se v současné době provádí v první řadě imunohistochemicky – tedy detekcí abnormálně zvýšeně exprimovaných proteinů ALK a ROS1. V případě ALK stačí jasná pozitivita imunohistochemie pro indikaci inhibitorů ALK a metodou fluorescenční in situ hybridizace (FISH) se ověřují jen případy se sporným či nejednoznačným imunohistochemickým výsledkem. V případě imunohistochemické pozitivity ROS1 je vyžadováno ověření pomocí FISH u všech pozitivních případů, pokud má být zahájena cílená léčba.

NGS vyšetření

V případě NSCLC, zejména pak neskvamózních karcinomů, existuje řada nádorů, které obsahují i další řídicí mutace nebo přestavby genů – příklady jsou zmíněny v úvodu textu. Zásadním problémem však je, že velikost podskupin s jednotlivými mutacemi, jejichž výskyt je zpravidla vzájemně se vylučující, je většinou velice malá a často se frekvence jednotlivých mutací pohybuje pod 1 % ze všech neskvamózních karcinomů. Identifikace těchto nádorů (respektive jednotlivých mutací v nádorech) je tak při použití tradičního přístupu se sekvenční detekcí jednotlivých markerů velmi obtížná a náročná jak na množství tkáně, jež musí být k dispozici, tak na finanční zajištění testování. Pokud totiž bude mutace přítomná v 1 % nádorů a náklady na test budou představovat 7000 Kč (běžná cena prediktivního testu PCR), znamená to, že na nalezení jednoho pozitivního případu je nutno otestovat 100 nádorů a náklady na jeho identifikaci dosáhnou 3/4 milionu korun.

Jediným způsobem jak tyto vzácné mutace identifikovat je proto paralelní testování mnoha genových alterací současně – tento požadavek splňuje technologie masivního paralelního testování (známá jako sekvenování nové generace – NGS). Tímto přístupem lze za cenu jednoho vyšetření otestovat až několik desítek potenciálně terapeuticky využitelných mutací. Limitací tohoto přístupu jsou – kromě dostupnosti cílené léčby pro jednotlivé mutace – vyšší náklady na test, jež odpovídají zhruba 50 tisícům Kč na 1 pacienta, vyšší nároky na množství materiálu (ovšem pouze srovnáváme-li jej s vzorkem potřebným pro provedení 1 testu PCR; při provádění více testů by byla situace opačná) a delší doba odezvy – výsledek testování je v optimálním případě dostupný za 3 týdny, zatímco při testování např. jen EGFR je výsledek k dispozici zpravidla do 5 pracovních dnů. Přes uvedené limitace doporučují mezinárodní guidelines zavedení NGS jako plošné metody testování NSCLC pro možnost detekce řady minoritních či vzácných mutací a obdobný vývoj lze velmi brzy očekávat i v České republice.

Vyšetření PD-L1

Jiná je situace u prediktivního vyšetření pro indikaci imunoterapie, tj. léčby pomocí inhibitorů imunitních kontrolních bodů (immune checkpoint), což jsou léky ovlivňující interakci mezi molekulami PD-1 a PD-L1. Zde je nezbytné před zahájením imunoterapie v 1. linii systémové léčby provedení vyšetření exprese proteinu PD-L1 v nádorových buňkách. Vyšetření se provádí opět imunohistochemicky reflexně, v tomto případě však nikoliv pouze u neskvamózních karcinomů, ale rovněž u karcinomů dlaždicobuněčných.

Na rozdíl od genových alterací nelze vyšetření PD-L1 nahradit např. metodou NGS a i nadále zde zůstane imunohistochemie zlatým standardem. Pro toto vyšetření je proto nezbytný materiál, který lze zpracovat histologicky – tedy buď tkáňový vzorek (optimálně), nebo alespoň cytologický materiál (např. z endobronchiální ultrasonografie – EBUS) zpracovaný metodou cytobloku. Vyšetření PD-L1 v cytologických nátěrech je zatíženo neúnosnými artefakty, a proto se neprovádí.

Závěr

Základem moderní diagnostiky nádorových lézí plic je – podobně jako v jiných oblastech medicíny – úzká spolupráce multioborového týmu, jehož nedílnou součástí je patolog. Standardem vyšetření u všech nemocných, kteří jsou potenciálními kandidáty systémové léčby, by mělo v současnosti být otestování mutací genu EGFR, přestavby genů ALK a ROS1 a vyšetření exprese PD-L1. Základem pro prediktivní testování je správná morfologická typizace každého NSCLC, protože od histologického typu se odvíjí indikace prediktivních testů. Zatímco první tři uvedené markery jsou testovány reflexně u neskvamózních karcinomů a dále na vyžádání onkologem u nemocných s dlaždicobuněčným karcinomem, vyšetření PD-L1 se provádí reflexně u všech NSCLC bez ohledu na histologický subtyp.

Prediktivní testování NSCLC musí probíhat zásadně na pracovištích patologie, která se na tento typ vyšetření specializují – jedná se o síť tzv. referenčních laboratoří, jejichž seznam je uveden na webových stránkách Společnosti českých patologů ČLS JEP (www.patologie.info) i České onkologické společnosti ČLS JEP (www.linkos.cz). Vyšetření v této síti laboratoří garantuje, že molekulární test bude optimálně indikován a jeho výsledek správně interpretován v kontextu komplexního morfologického nálezu.