Dlouhé nekódující RNA v patofyziologii aterosklerózy

Overview

Lidský genom obsahuje asi 22 000 protein kódujících genů, které dávají vznik ještě většímu množství messengerové RNA (mRNA). Výsledky projektu ENCODE z roku 2012 však ukazují, že byť je až 90 % našeho genomu aktivně přepisováno, tak mRNA dávající vznik proteinům tvoří pouze 2–3 % z celkového množství přepsané RNA. Zbývající RNA transkripty nedávají vznik proteinům a nesou proto označení „nekódující RNA“. Dříve se nekódující RNA považovala za „temnou hmotu genomu“, nebo za „odpad“, který se v naší DNA nahromadil v průběhu evoluce. Dnes již víme, že nekódující RNA plní v našem těle celou řadu regulačních funkcí – zasahují do epigenetických procesů od remodelace chromatinu k metylaci histonů, nebo do vlastního procesu transkripce, či do posttranskripčních procesů. Dlouhé nekódující RNA (lncRNA) jsou jednou ze tříd nekódujících RNA s délkou nad 200 nukleotidů (nekódující RNA s délkou pod 200 nukleotidů označujeme jako krátké nekódující RNA). lncRNA představují velice pestrou a rozsáhlou skupinu molekul s rozličnými regulačními funkcemi. Můžeme je identifkovat ve všech myslitelných buněčných typech, či tkáních, nebo dokonce v extracelulárním prostoru, a to včetně krve, potažmo plazmy. Jejich hladiny se mění v průběhu organogeneze, jsou specifické pro jednotlivé tkáně a k jejich změnám dochází i při vzniku různých onemocnění, včetně aterosklerózy. Cílem tohoto souhrnného článku je jednak představit problematiku lncRNA a některé jejich konkrétní zástupce ve vztahu k procesu aterosklerózy (popsat zapojení lncRNA do biologie endotelových buněk, hladkosvalových buněk cévní stěny, či buněk imunitních), a dále poukázat na možný klinický potenciál lncRNA, ať již v diagnostice či terapii aterosklerózy a jejích klinických manifestací.

Klíčová slova:
ateroskleróza – lincRNA – lncRNA – MALAT – MIAT

Úvod

V posledních 2 dekádách došlo k masivnímu rozvoji metod molekulární biologie, který umožnil přesun z výzkumu jednotlivých genů, molekul RNA či proteinů až na úroveň genomů (veškerého obsahu DNA v buňce), transkriptomů (veškerého obsahu RNA v buňce) či proteomů (všech proteinů v buňce) [1]. Tyto velké pokroky rovněž zásadním způsobem změnily náš pohled na genovou expresi – výzkum předchozích let se zaměřoval spíše na tzv. protein kódující geny, tedy geny, uložené v DNA, z níž je v procesu transkripce vytvořena předloha (messengerová RNA – mRNA), která je na ribozomech v procesu translace přeložena z tripletů bází do jednotlivých aminokyselin budoucích proteinů. Projekt ENCODE studující 147 různých buněčných typů a využívající nejmodernější „omics“ technologie ukázal, že až 90 % genomu je v průběhu ontogeneze aktivně přepisováno, avšak jen 2–3 % tvoří protein kódující geny [2]. Zbývající transkripty byly dříve považovány za „odpadní materiál“ (vznikající z tzv. „junk DNA“) nebo za nadbytečnou „temnou hmotu genomu“ vzniklou v průběhu evoluce. Díky pokračujícímu výzkumu v této oblasti se význam této „temné hmoty“ daří pozvolna odkrývat – hovoříme o tzv. nekódujících RNA, tedy RNA, ze kterých nevznikají proteiny a které jsou cílem transkripce samy o sobě [1]. Nekódující RNA mají v našem těle regulační funkci – regulují výše popsaný proces genové exprese na různých úrovních, čímž zajišťují jeho správný a delikátní průběh v jednotlivých tkáních, orgánech a také v jednotlivých časových okamžicích našeho vývoje. Množství protein kódujících genů mezi člověkem a jinými organizmy (např. myší) je více méně podobný [3], avšak v množství nekódujících RNA se mezi sebou jednotlivé druhy významně liší a právě množství nekódujících RNA spíše koreluje s komplexitou eukaryotických organizmů než jen množství protein kódujících genů (graf) [4].

S ohledem na velké množství RNA transkriptů, které se v buňkách nacházejí, bylo nutné vytvořit několik různých klasifikačních systémů, které se snaží do této pestré skupiny molekul vnést řád. Základní dělení je na krátké nekódující RNA (small non-coding RNAs – sncRNAs) a na dlouhé nekódující RNA (long non-coding RNAs – lncRNAs); umělá hranice mezi těmito 2 skupinami byla stanovena délkou 200 nukleotidů [5]. sncRNA se dle své funkce a způsobů vzniku pak dělí na celou řadu podskupin (mikroRNA, PIWI-interagující RNA, malé nukleární nebo nukleolární RNA a další), kterým v tomto souhrnném článku nebudeme věnovat bližší pozornost (o zapojení mikroRNA do patofyziologie aterosklerózy pojednává např. souhrnný článek v časopise AtheroReview [6]). Zaměříme se na dlouhé nekódující RNA, které jsou ještě pestřejší skupinou molekul, neboť délka 200 nukleotidů je pouze začátkem – většina lncRNA dosahuje délky přes 100 000 nukleotidů a v současné době je dle databáze „NON-CODE“ (www.noncode.org) známo 96 308 genů pro lncRNA a z těchto 96 308 genů je známo 172 216 různých lncRNA transkriptů. Tyto transkripty dnes dělíme do 4 základních tříd (obr. 1), přičemž tato klasifikace odráží vznik lncRNA a její vztah k okolním protein kódujícím genům. lncRNA mohou vznikat ze stejného transkriptu jako mRNA nejbližšího protein kódujícího genu nebo naopak z vlákna, které je k tomuto transkriptu komplementární – hovoříme o „sense“ a „anti-sense“ lncRNA. Dále mohou pocházet z intronů již známých genů, poté hovoříme o „intronových“ lncRNA, nebo se v genomu nacházejí v prostoru mezi dvěma kódujícími geny – tyto lncRNA označujeme jako dlouhé intergenní RNA (zkracováno v literatuře jako lincRNA) [5]. Zda všechny lncRNA plní v organizmu určitou biologickou funkci ještě musí být objasněno, už nyní je ale jasné, že jejich význam v regulaci genové exprese není možné opomíjet.

První známou lncRNA objevenou již v 90. letech minulého století je Xist (X-inactive specific transcript) – jedná se o lncRNA, která v buněčném jádře „navádí“ specifické proteiny (v tomto případě jde o PRC2 protein) ke chromo­zomu X, čímž se podílí na jeho inaktivaci [7]. Krom této epigenetické „naváděcí“ funkce se lncRNA v jádře podílejí na regulaci genové exprese na úrovni transkripce – mohou regulovat aktivitu transkripčních faktorů, blokovat promotorové oblasti, či v komplexu s regulačními proteiny zasáhnout do jednotlivých kroků transkripčního procesu. Stejně jako malé nekódující RNA (např. miRNA) se i lncRNA podílejí na posttranskripční regulaci (tj. interferují s již vytvořeným transkriptem), tím že zasahují do procesů alternativního sestřihu, ovlivňují stabilitu mRNA, či způsobují její degradaci [8].

Z výše uvedeného výčtu různých funkcí lncRNA je patrné, že se do procesu aterosklerózy mohou zapojovat na úrovni epigenetické, transkripční a posttranskripční regulace, a to v jednotlivých buněčných typech, či tkáních zapojených v procesu aterogeneze (tj. v endoteliích, hladkosvalových buňkách cévní stěny – VSMC, či makrofázích). Zapojení vybraných lncRNA znázorňuje obr. 2, který je dále rozebrán v následujícím textu.

lncRNA a funkce endotelu

Jedním z prvních kroků v procesu aterosklerózy je dysfunkce endotelových buněk – dysfunkční endotel je více permeabilní, je v něm zvýšená exprese adhezivních molekul, a to následně rezultuje v migraci a infiltraci stěny cév bílými krvinkami. Dochází rovněž k patologické angiogenezi, která je charakteristická zvýšenou proliferací endotelových buněk, jejich migrací a formováním nových cév [9–11].

V prvním kroku neoangiogeneze dochází k diferenciaci pluripotentních kmenových buněk do buněk endotelových a v tomto procesu jsou zapojeny 3 lncRNA: terminator, alien a punisher. Terminator je lncRNA zapojená zejména do udržování pluripotence, punisher se podílí na procesech mitózy, formování extracelulárního prostoru a buněčné adhezi, a alien reguluje expresi genů zapojených do vlastní angiogeneze, zrání cév a remodelaci mezibuněčné matrix [12]. Další lncRNA regulující proliferaci, zrání cév a buněčnou migraci jsou NRON, Tie-1 AS, MIAT a MALAT. S využitím gain- a loss-of-function experimentů bylo prokázáno, že NRON je schopen vázat NFAT (transkripční faktor) a zvýšená exprese NRONu v endoteliích inhibuje funkci NFAT, což vede k zpomalení proliferace, migrace i novotvorby cév [13]. Podobný efekt na novotvorbu cév má Tie-1 AS, což je lncRNA namířená proti tyrozinkináze Tie-1. Tie-1 je důležitou tyrozinkinázou v rámci VEGF signalizace [14] a její utlumení pomocí Tie-1 AS rovněž zpomaluje novotvorbu cév [13]. MIAT se rovněž podílí na výše uvedených procesech a rovněž zasahuje velice komplexním způsobem do VEGF signalizace; MIAT totiž funguje jako „molekulární houba“ (molecular sponge) pro mikroRNA-150 (miR-150). miR-150 je známá tím, že blokuje mRNA pro VEGF, která má ve své struktuře pro miR-150 tři vazebná místa. Přítomnost MIAT však molekuly miR-150 vychytá („nasaje je jako houba vodu“), čímž se znovuobnoví exprese VEGF a dochází k neoangiogenezi [15]. Bylo již prokázáno, že ke zvýšené expresi MIAT (a tím i zvýšené expresi VEGF) dochází vlivem zvýšené hladiny glukózy, což bylo na zvířecím modelu pozorováno jako zvýšená neovaskularizace v sítnici, čímž by se MIAT mohla podílet i na progresi diabetické retinopatie [16]. V neposlední řadě lncRNA MALAT, zasahuje přes regulaci proteinů buněčného cyklu (CCNA2, CCNB1 a CCNB2), do funkce endotelií tak, že reguluje přepínání mezi proliferačním a promigračním fenotypem – utlumením MALAT pomocí interferujících siRNA dochází ke snížení proliferačního potenciálu a zvýšením hladin MALAT je proliferace endotelií stimulována [17].

Z výše uvedeného je patrné, že řada různých lncRNA ovlivňuje a reguluje již známé procesy probíhající v endotelových buňkách, jejich proliferaci, migraci, či vyzrávání, a za patologických podmínek jsou zapojeny i do procesu aterogeneze.

lncRNA v biologii hladkosvalových buněk cévní stěny

Endotelová dysfunkce je neodvratně spojována s následnou remodelací cévní stěny: hladkosvalové buňky cévní stěny (VSMC) mění svůj kontraktilní fenotyp na fenotyp proliferační a navíc se z cévní medie přesouvají do intimy, čímž dále podporují růst a remodelaci aterosklerotického plátu [9–11].

Jednou z prvních lncRNA popisovaných ve vztahu k VSCM byl ANRIL. Gen pro ANRIL nacházíme na lokusu 9p21, v němž byla již v minulosti pomocí genome wide-association studies (GWAS) nalezena řada různých SNP, které asociovaly právě s aterosklerózou a infarktem myokardu [18]. Přítomnost rizikových SNP expresi ANRIL zvyšuje, a to jak v aterosklerotickém plátu, tak v periferní krvi [19]. Mechanisticky vede zvýšená exprese ANRIL k ovlivnění celé řady proteinů buněčného cyklu a jeho nepřítomnost nebo inhibice vede ke zpomalení růstu VSMC [9]. Podobnou funkci plní lncRNA SENCR, která down-reguluje geny nezbytné pro správnou kontraktilní funkci (např. Myocd) a up-reguluje geny nezbytné pro migraci (např. Mdk), čímž přispívá k přechodu z kontraktilního do migračního fenotypu [20].

Další tři lncRNA jsou s funkcí VSMC spojeny tím, že jsou prekurzorem pro vznik různých mikroRNA, jejichž zapojení do funkce VSMC již bylo prokázáno. Konkrétně jde o H19 lincRNA [21], která ve své struktuře kóduje mj. i miR-675, o Lnc-Ang362 [22], která ve své struktuře kóduje miR-221 a miR-222 a o E330013P06 [23], která ve své struktuře kóduje miR-143/145. H19 lincRNA je funkčně propojena s proteinem H19, o němž je již řadu let známo, že je zvýšeně exprimován v aterosklerotických plátech a jehož polymorfizmy asociují s vyšším rizikem rozvoje ICHS. Lnc-Ang362 byla objevena při profilování VSMC stimulovaných angiotenzinem II (ve srovnání s nestimulovanými buňkami) a její knock-down vedl ke snížení hladin miR-221/222, což vedlo k zpomalení proliferace VSMC. Poslední jmenovaná lncRNA E330013P06 byla identifikována jak ve VSMC, tak v makrofázích. Ve VSMC její nedostatek (s následným nedostatkem miR-143/145) narušuje schopnost kontraktility (čímž vychyluje rovnováhu mezi kontraktilním a proliferačním fenotypem ve prospěch proliferačního), v makrofázích zase její zvýšení způsobuje větší tvorbu prozánětlivých cytokinů a progresi zánětu.

Další lncRNA zapojené do biologie VSMC zahrnují např. HAS2–AS1 (spojenou s produkcí hyaluronanu, jehož nadbytečná produkce urychluje aterosklerózu [24]), HIF1α-AS1 (lncRNA spojená s hypoxií a apoptózou identifikovaná v SMC ze vzorků aortálních aneuryzmat [25]), lncRNA-GAS5 (lcnRNA identifikovaná v SMC z varikózních žil, která in vitro zpomaluje proliferaci VSMC [26]). Všechny tyto a jistě i řada dalších lncRNA si zaslouží další detailnější výzkum v biologii VSMC.

Imunitní buňky a lncRNA

V neposlední řadě se do tvorby aterosklerotické léze zapojují i buňky imunitního systému (z makrofágů derivované pěnové buňky) a ukládají se do nich lipoproteiny, potažmo cholesterol, což vede k uvolnění prozánětlivých cytokinů a rozvoji lokální zánětlivé reakce [9–11].

V současné době byly popsány 3 lncRNA, které se zapojují do přeměny makrofágů v pěnové buňky a zároveň ovlivňují metabolizmus cholesterolu v pěnových buňkách – lincRNA-DYNLRB2–2, lncRNA-RP5–833A20.1 a E330013P06. První dvě jmenované pocházejí ze studií od Hu et al a prokazují, že obě dvě jsou zapojeny v regulaci exprese prozánětlivých cytokinů (konkrétně IL1β, IL6 a TNFα) a zároveň regulují expresi ABCA1, jednoho z nejdůležitějších transportérů zapojených do effluxu cholesterolu [27,28]. Výše zmíněná E330013P06 je pak třetí lncRNA, jejíž zvýšená exprese rovněž stimuluje produkci prozánětlivých genů (Il6, Nos2 a Ptgs2) [23].

Klinický potenciál lncRNA

Výše uvedené lncRNA umožňují lépe pochopit patofyziologii aterosklerózy, což by mohlo rezultovat ve vývoj nových léčiv – experimentálně jsme již dnes schopni lncRNA zablokovat, či uměle zvýšit její expresi. Ke zvýšení exprese chybějících lncRNA jsou nejvíce vy­užívány virové vektory, avšak jejich klinické využití je zatíženo nežádoucími účinky, jakými jsou např. karcinogeze nebo imunogenicita [29]. Přímé dodání chybějící lncRNA by fungovalo na stejném principu jako dodání chybějící mRNA („mRNA substituční terapie“), avšak i tento přístup vstupuje do klinické praxe velice pomalu a zatím není možné jej robustně rozšířit [30]. Jako slibnější postup se jeví inhibice nadbytečně exprimovaných lncRNA aplikací anti-sense oligonukleotidů (ASO) a siRNA (small-interfering RNA) [31]. ASO blokují lncRNA přímo v jádře, siRNA v cytoplazmě – oba tyto přístupy jsou nyní intenzivně zkoumány, neboť je stále nutné vytvořit bezpečné přístupy dodání konkrétních ASO/siRNA do konkrétních tkání, či zajistit dostatečnou specifitu a stabilitu podávaných molekul, avšak jak již víme ze zkušenosti s inhibicí PCSK9 pomocí inklisiranu (což je ve své podstatě oligonukleotid, siRNA, namířený proti mRNA pro PCSK9 [32]), je tento přístup možný a v budoucnu se možná právě tento přístup dočká nejvíce klinických aplikací.

Další oblastí, ve které by bylo možné lncRNA využít, je jejich stanovení v tělních tekutinách, zejména v plazmě. Oproti v současnosti intenzivně studovaným mikroRNA vykazují lncRNA mnohem menší stabilitu, jsou citlivější na zpracování i k degradaci a doposud nebyl vytvořen uniformní postup k jejich stanovení [33]. I přesto již existují první studie, které poukazují na možný význam některých lncRNA. První byla průřezová studie zaměřující se na lncRNA ANRIL u pacientů s ICHS, která zahrnovala 1 134 jedinců. Hladiny ANRIL nezávisle korelovaly s tíží ICHS a ukázalo se, že ANRIL je zvýšeně exprimován u jedinců, v jejichž genomu se nacházejí již dříve identifikované rizikové jednonukleotidové polymorfizmy [19]. lncRNA zvaná LIPCAR zase odráží srdeční remodelaci a její hladiny predikují kardiovaskulární mortalitu jak u pacientů po infarktu myokardu, tak u pacientů se srdečním selháním [34]. Další zkoumané lncRNA v plazmě u pacientů po infarktu myokardu zahrnují KCNQ1OT1, MALAT1, MIAT, či HIF1αAS2 [9–11], avšak jejich využití a klinický význam je zatím nejasný. Studie v této oblasti jsou teprve ve svých počátcích, nelze nyní tedy jednoznačně říci, zda cirkulující lncRNA přinesou do klinické praxe nové informace, které neposkytují v současnosti užívané biomarkery.

Závěr

lncRNA představují relativně mladou a velice obsáhlou a komplexní skupinu molekul, která je zapojena do regulace genové exprese a podílí se na embryogenezi, funkci jednotlivých tkání a buněk a také na patofyziologii různých onemocnění, včetně aterosklerózy. Exprese většiny lncRNA je tkáňově specifická a lze tedy předpokládat, že po překonání všech technologických problémů bude možné jejich hladiny v budoucnu specificky terapeuticky ovlivnit s cílem vyhnout se nežádoucím účinkům v jiných tkáních. Stran využití v diagnostice bude zcela nezbytné vytvoření uniformních protokolů umožňujících standardizovanou izolaci a stanovení hladin lncRNA, a to jak v tkáních, tak ve vzorcích tělních tekutin. Nutno také podotknout, že většina doposud provedených výzkumů se odehrávala in vitro na buněčných kulturách – ověření výsledků in vivo na zvířecích modelech nebo ve vzorcích lidské tkáně je rovněž nezbytným předpokladem k prolomení pomyslné bariéry na cestě z laboratoře do klinické praxe.

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s názvem Cirkulující mikroRNA jako neinvazivní markery rejekce štěpu u pacientů po srdeční transplantaci s reg. č. 16-30537A.

Veškerá práva podle předpisů na ochranu duševního vlastnictví jsou vyhrazena.

MUDr. Jan Novák

jan.novak@fnusa.cz

II. nterní klinika LF MU a FN u sv. Anny v Brně

www.fnusa.cz

Doručeno do redakce 13. 11. 2017

Přijato po recenzi 5. 1. 2018