Analýza povrchu magnetických mikročástic prostřednictvím mikroskopie atomárních sil

Souhrn

Přesto, že se magnetické mikročástice začaly zkoumat již od 70ých let 20. století, hromadného rozšíření v nejrůznějších biochemických i lékařských aplikacích dosáhly zejména v posledním desetiletí. Hlavní výhodou použití těchto částic v laboratorní praxi je snadná manipulace prostřednictvím vnějších magnetických polí a možnost selektivní modifikace žádoucí funkční skupinou jejich relativně velkého povrchu. Tato studie analyzuje velikost a povrch čtyř odlišných typů magnetických mikročástic používaných k selektivní izolaci bakteriální DNA z reálných vzorků. Zkoumané částice byly zobrazeny mikroskopem atomárních sil a optickým mikroskopem. Z analyzovaných AFM snímků magnetických nosičů vyplynulo, že všechny čtyři nosiče vykazují značně nerovný povrch, hodnocena byla také distribuce velikosti studovaných částic. Diskutována je možnost AFM zobrazení adsorbované DNA na značně nerovném povrchu magnetického nosiče.

Klíčová slova:
magnetické porézní skleněné částice, mikroskopie atomárních sil, magnetické nosiče

Úvod

Využití magnetických mikro či nano částic se v posledních deseti letech značně rozšířilo do běžné praxe v různých biologických disciplínách, jako jsou biotechnologie, environmentální technologie či analytické aplikace.

Široké uplatnění nacházejí magnetické částice v lékařství, například v roli kontrastní či značící látky při zobrazení tkání magnetickou rezonancí [1, 2], jako nosiče pro cílený transport léčiv [3, 4], při magnetofekci v roli nosiče DNA v genové terapii [5,6], či jako zdroje tepla při cílené terapii nádorů hypertermií [4, 7-9]. Zapojení magnetických částic ve vývoji nových biosenzorů, ať už biokatalytických nebo bioafinitních [10-14], je velkou výzvou v rozvoji nových analytic-kých a diagnostických metod.

Mezi nejrozšířenější in vitro aplikace v biotechnologiích a biomedicíně patří izolace nukleových kyselin (DNA/RNA) ze složitých biologických systémů, jako jsou buněčné suspenze, homogenáty a fermentační média [15-18], selektivní izolace vybraných proteinů [19, 20], mikroorganismů, buněčných organel či celých buněk [21].

Princip jednoduché a rychlé separace či směrování v médiích spočívá v navázání cílové složky ze vzorku na magnetický nosič, který je po vhodné inkubační době ze vzorku separován společně s cílovou složkou pomocí vnějšího magnetického pole.

Magnetické nosiče musí být chemicky stabilní při různých hodnotách pH, vykazovat minimální agregaci a být biokompatibilní, jsou-li dále určeny pro lékařské účely. Měly by obsahovat vysoký obsah magnetického plniva, které je superparamagnetické a není toxické.

Právě unikátní magnetické vlastnosti magnetických nosičů pak spolu s možností vazby nejrůznějších biologicky aktivních látek na relativně velký povrch částice, řádově 100 m² až 1000 m²/g u částic s mikroporézním povrchem a póry pod 2 nm, umožňují efektivní vazbu a následnou selektivní separaci či transport působením vnějšího magnetického pole [18].

Magnetické mikročástice mají většinou charakter kompozitních materiálů, které jsou složeny z vlastní fero- nebo ferimagnetické složky zodpovědné za interakci s vnějším magnetickým polem (tzv. magnetické jádro) a složky diamagnetické, umožňující interakci s biologickým systémem, tvořeným nejčastěji z polymerních materiálů (tzv. obal).

Metody syntézy magnetických částic se zaměřují na přípravu práškových materiálů obsahujících mikročástice či nanočástice maghemitu, magnetitu, směsných oxidů železa nebo feritů, na přípravu tzv. magnetických kapalin a na syntézu magnetických částic přímo v prostředí obalového („bio“) polymerního materiálu. Obal magnetického nosiče slouží ke stabilizaci, dispergaci a funkcionalizaci povrchu nosiče, brání agregaci či precipitaci magnetických částic a minimalizuje nežádoucí interakce v biologickém prostředí. Konečná velikost a tvar distribuce velikosti syntetizovaných částic závisí na způsobu přípravy, reakční teplotě, pH, iontové síle, použitém obalovém materiálu apod. [22, 23].

Jednodoménové magnetické nanočástice však mohou syntetizovat také magnetotaktické bakterie, které produkují intracelulární krystaly magnetitu (Fe₃O₄), greigitu (Fe₃S₄) či pyrrhotitu (Fe₇S₈). Tyto biologicky syntetizované magnetické částice, magnetosomy, jsou v těle bakterie uspořádány do podélného řetězce (celkový magnetický moment cca. 1x10^-15A.m²) a slouží bakteriím k orientaci v prostoru podél geomagnetického pole. Výhodou magnetosomů oproti laboratorně syntetizovaným jednodoménovým částicím je jejich velikost (cca 50 nm), úzká velikostní distribuce a přítomnost biokompatibilní lipidové membrány [24-26].

V současné době je dostupné široké spektrum ko-merčně dodávaných magnetických mikro a nanočástic, určených k MRI značení, separaci či značení buněk, organel a mikroorganismů a biologických molekul. Tím, že obal magnetického nosiče může nést funkční skupiny či specifické molekuly komplementárně intera-gující s biologickými funkčními molekulami (např. protilátky, afinitní ligandy, léčiva či značky) rozšiřuje se značně spektrum použití magnetických nosičů [18, 20-23, 27].

K imobilizaci méně častých ligandů je možno při-márně využít funkčních skupin exprimovaných na povrchu nosiče, a to v závislosti na typu obalového polymerního materiálu magnetického nosiče. Nejčastěji se jedná o následující skupiny – OH (silikagel, porézní borosilikátové sklo), – NH₂ (např. silanizované částice), – COOH, apod.

Mezi největší dodavatele vyrábějící magnetické nosi-če patří Invitrogen (PureBiotech), Advacned Magnetics (USA) a Miltenyi Biotec (Německo) [28].

Praktická aplikace magnetických nosičů při izolaci genetického materiálu z komplexních vzorků (buněčná suspenze, homogenát, fermentační médium apod.) či přímo z hrubého lyzátu buněk je velmi jednoduchá a časově nenáročná. Princip separace spočívá v reverzibilní adsorpci nukleové kyseliny na povrch magnetického nosiče v přítomnosti vysoké koncentrace chaotropních činidel nebo PEG. S pomocí vnějšího magnetického pole vyvolaného silným magnetem, přiloženým ke stěně nádobky obsahující roztok s mag-netickými nosiči, dochází k efektivní a účinné separaci částic s navázanou DNA. Po separaci následuje promývací a eluční krok. Vzhledem k velké vizkozitě roztoku, v němž se odehrává adsorpce DNA na magnetický nosič, je žádoucí, aby magnetické částice nesly silné magnetické vlastnosti. Je zřejmé, že magne-tická separace zcela obchází použití centrifugy nebo porézní filtrace, čímž minimalizuje mechanický stres.

V našich experimentech byla studována povrchová topografie čtyř odlišných magnetických nosičů, dva komerčně dostupné nosiče pod označením MPG (magnetic porous glass, Invitrogen, resp. PurBiotech, USA) [29] a dva laboratorně syntetizované nosiče.

Materiál a metody

Magnetické nosiče

Každý ze studovaných nosičů vykazoval odlišné funkční skupiny na svém povrchu a reprezentoval tedy odlišný typ povrchové modifikace. Magnetické nosiče, jejichž polymerní obal je tvořen porézním borosilikátovým sklem a jádro superparamagnetickým oxidem železa, byly zakoupeny od firmy PurBiotech, a to ve dvou modifikacích: a) dále neupravené („uncoated“) magnetické nosiče s převažující -OH funkční skupinou exprimovanou na povrchu částic, MPG uncoated; a b) částice pokryté streptavidinem, MPG – STV coated.

Laboratorně připravené částice byly připraveny Ing. Danielem Horákem, CSc. (Ústav makromolekulární chemie AV ČR, Praha). Jednalo se o magnetické poly(glycidyl methakrylátové) mikročástice pokryté –COOH funkčními skupinami - PGMA-COOH (c) viz [30] a – magnetické poly(2-hydroxyethyl-co-glycidylmethakrylátové)mikročástice pokryté -NH₂ funkčními skupinami - P(HEMA-GMA)-NH₂(d).

Všechny zobrazované magnetické nosiče byly laboratorně ověřeny bioseparační metodou – izolací DNA z komplexních biologických vzorků [31].

Imobilizace studovaných magnetických nosičů

Jako substrát k uchycení magnetických nosičů byla použita krycí skla. Ta byla před nanesením agarózy očištěna inkubací v 10% HCl (P-lab, ČR), 2 x 5 min, následoval 2 x oplach deionizovanou vodou a sušení. Takto očištěná skla byla potažena 0,5% agarózou (Serva, Německo). Pro podporu zanoření magnetických částic do hladké agarózové vrstvy byl vlastní imobilizační krok podpořen neodymovým magnetem uchyceným na spodní straně krycího sklíčka, viz Obr. 1. Na krycí sklo potažené agarózou bylo napipetováno 20 μl suspenze magnetických nosičů o koncentraci 30 ng/ml (částice suspendované v deionizované vodě). Po inkubaci (5 min) následoval jemný oplach skla s částicemi (2x 1ml deionizované vody), poté byla skla nechána volně uschnout (RT). Měření mikroskopem atomárních sil (AFM) a zobrazení optickým mikroskopem proběhlo vždy týž den, jako příprava vzorků.

Lokace a analýza velikosti částic

K prvotní charakterizaci velikosti magnetických částic a jejich lokaci pro následné AFM měření byl použit inverzní optický mikroskop Olympus XI81 s DSU jednotkou (Olympus, Japonsko), propojený s AFM měřícím systémem, jak je zřejmé z Obr. 2. Protože optický mikroskop poskytuje pouze dvourozměrnou informaci, k rozlišení detailní povrchové struktury analyzovaných částic byl použit mikroskop atomárních sil Bioscope Catalyst (Bruker, USA).

AFM zobrazení

Všechny AFM snímky magnetických nosičů uvedené v této studii byly nasnímány mikroskopem atomárních sil Bioscope Catalyst, v pracovním režimu Scan Asyst. Tento moderní AFM režim je založen na proměření takzvané F-d křivky (viz Obr. 3) v každém bodu rastru a následné rekonstrukci obrazu z naměřených topografických či elastických dat.

Vyhodnocením F-d křivky a následnou aktualizací parametrů skenování v každém bodě rastru AFM systém umožňuje precizní kontrolu silových interakcí mezi zobrazujícím hrotem a zobrazovaným povrchem, a to v každém skenovaném bodě.

Použitím ScanAsyst pracovního režimu byla zajištěna minimalizace laterálního pohybu zkoumaného vzorku, vyvolaná působením skenujících sil v průběhu vlastního měření a znemožňující vlastní AFM měření.

Skenující sondou byl u všech měření hrot Scan Asyst (Bruker) s nominální konstantou tuhosti ~0,7 N/m, skenovací frekvence 1 kHz při rozlišení 512 pixelů. Všechny prezentované AFM snímky jsou proloženy rovinou druhého řádu bez dalších grafických úprav.

Analýza obrazu

K vyhodnocení distribuce velikosti studovaných magnetických nosičů byly vyhodnoceny snímky z optického mikroskopu Olympus XI81, a to v software excellence rt (Olympus, Japonsko).

Výsledky a diskuze

Distribuce velikosti analyzovaných částic

Zjištěná distribuce velikosti studovaných částic je ve shodě s údaji dostupnými v literatuře [17, 22, 23, 29], viz Graf 1 a Graf 2. Pro komerční částice MPG je v manuálu výrobce uváděna nominální hodnota velikosti částice 5 μm, pro laboratorně syntetizované částice P(HEMA-GMA)-NH₂ je uváděná nominální velikost částic 2,9 μm. Pro částice PGMA-COOH byla nezávislým měřením stanovena velikost částice 1,2 μm (nepublikovaná data, Daniel Horák, Ústav makromole-kulární chemie AV ČR). Nejširší distribuci velikosti vykazovaly komerční nosiče MPG a nejužší distribuci velikostí vykazovaly částice PGMA-COOH.

Právě jednotná velikost částic zajišťuje stejné fyzikální, chemické i biologické vlastnosti materiálu a je jedním z hlavních cílů syntézy magnetických nosičů.

AFM snímky zobrazovaných částic

AFM snímky potvrdily nepravidelný tvar sféroidu u obou studovaných komerčních borosilikátových mag-netických nosičů (Obr. 4 a Obr. 6). Z detailního skenu povrchu nosiče je zřejmá výrazná členitost částicového povrchu (Obr. 5 a Obr. 7), která výrazně zvyšuje aktivní povrch částice.

Na povrchu nemodifikovaných částic (Obr. 5) byly rozlišeny oblasti prohlubní a žlábků s nepravidelným tvarem a plochou cca 200 nm² až 600 nm². Obdobné závěry můžeme učinit i pro porézní magnetické nosiče modifikované streptavidinem (Obr. 6 a Obr. 7).

Z AFM snímků magnetických částic modifikovaných streptavidinem (Obr. 7) je taktéž zřejmá členitost povrchu nosiče, kdy výskyt žlábků a prohlubní zahrnuje plochy cca 300 nm² až 600 nm².

Syntetizované částice PGMA-COOH (Obr. 8 a Obr. 9), nesoucí na svém povrchu funkční skupiny – COOH, vykazovaly na AFM snímcích mnohem více symetrický, kulovitý tvar ve srovnání s komerčními magnetickými nosiči MPG. Z AFM snímků detailního povrchu částic (Obr. 9) je zřejmé, že jemný povrch částic PGMA-COOH je strukturován.

Poslední ze studovaných částic, P(HEMA-GMA)-NH₂, připravená chemickou koprecipitací železnatých a železitých solí obalených v polymerní matrix, vykazovala na AFM snímcích převážně sférický tvar. Povrch těchto částic, nesoucích -NH₂ funkční skupiny, byl však zřetelně méně členitý (Obr. 10 a Obr. 11).

Vyhodnocení porozity a RMS studovaných magnetických nosičů

Většina materiálů vykazuje určitou porozitu, případně nerovnost povrchu. Ovlivňování porozity je významný úkol při výrobě např. katalyzátorů, průmyslových adsorbentů, atd. Navíc je porozita jedním z fak-torů, který ovlivňuje chemickou reaktivitu pevných látek a fyzikální interakci látek s plyny a tekutinami.

Porozita povrchu může být definována jako poměr objemu pórů a objemu vzorku. Mezinárodní společnos-tí pro čistou a užitou chemii (IUPAC) byly póry rozděleny dle své velikosti do tří skupin: 1. mikropóry < 2 nm, 2. Mezopóry v rozmezí 2-50 nm, 3. makropóry > 50 nm.

Protože AFM rozlišení bývá běžně stanoveno z nejjemnějších detailů rozlišených na zobrazované struktuře, byly vyvinuty jiné, objektivní parametry, kterými lze charakterizovat zkoumané povrchy. Jedním z nejčastěji používaných parametrů pro posouzení drstnosti povrchu je RMS, střední kvadratická hodnota odchylky vůči střední rovině v obrazu. Pomocí této statistické veličiny jsou běžně klasifikovány materiálové plochy např. k posouzení vhodnosti při uchycení biologických vzorků či při posouzení výškové homogennosti zobrazovaných povrchů. Je třeba zmínit, že hodnota RMS je ovlivněna geometrií hrotu, zejména poloměrem zakřivení a oblastí kontaktu ze vzorkem a geometrií výškových nerovností na povrchu vzorku.

Z jemného detailu povrchu studovaných částic (Obr. 12 až Obr. 15) je zřejmá prostorová členitost povrchu všech studovaných magnetických nosičů. Dle IUPAC komerční nosiče vykazovaly porozitu druhé a třetí třídy. Tento údaj je ve shodě s údaji poskytnutými výrobcem, kdy uvedená nominální hodnota pórů je 50 nm [29].

Syntetizovaný magnetický nosič PGMA-COOH vy-kazoval převážně porozitu třetí třídy, tedy makropóry o průměru větším než 50 nm (Obr. 14 a Obr. 15). Syntetizovaný magnetický nosič P(HEMA-GMA)-NH₂ vykazoval sice zvrásněný povrch, hloubka rýh a žlábků však byla menšího rozsahu než průměr vyvýšených oblastí.

RMS částic zobrazených v této studii, vztažená k plo-še 50x50 nm², vykazovala hodnoty (18,4 ± 6,2) nm pro MPG – uncoated a (17,2 ± 8,1) nm pro MPG – STV coated. Pro částice PGMA-COOH povrch částice vykazoval hodnoty RMS (7,2 ± 4,1) nm a pro částice P(HEMA-GMA)-NH₂ (13,2 ± 6,1) nm (stanoveno pro deset nezávislých oblastí)_.

Závěr

Magnetické nosiče nacházejí uplatnění v mnoha oborech přírodních věd, při analytických aplikacích, v medicíně a biotechnologiích. Je zřejmé, že techniky založené na separaci magnetickými nosiči mají obrovský potenciál. Je tedy nutné hledat a rozvíjet nové možnosti syntéz magnetických nosičů tak, aby tyto pokryly současnou širokou a různorodou poptávku.

U nově syntetizovaných magnetických nosičů je nezbytné popsat nejen magnetické vlastnosti a toxicitu částic, ale i morfologii a detailní strukturu povrchu. Z tohoto důvodu je právě mikroskopie atomárních sil unikátním nástrojem, poskytujícím bohaté informace o detailní struktuře zkoumaných povrchů a přispívá tak kvalitativně k získání nových informací, nezbytných k charakterizaci nově vyvíjených nosičů.

V naší studii bylo prokázáno, že všechny studované nosiče vykazují značně nerovný povrch. Tento jev znemožňuje AFM zobrazení magnetického nosiče současně s adsorbovanou DNA tak, aby byla molekula DNA odlišena od pozadí tvořeného prostorově strukturovaným povrchem nosiče.

Lze předpokládat, že kombinace mikroskopie atomár-ních sil a simultánní optické fluorescenční mikroskopie by mohla tento problém obejít a rozlišit adsorbovanou DNA. Také AFM režim mapování elasticity, obecně pak plošné AFM snímání mechanických vlastností, může být jednou z dalších alternativ, jak prostřednictvím mikroskopie atomárních sil rozlišit adsorbované molekuly DNA na nerovném povrchu magnetického nosiče.

Je zřejmé, že mikroskopie atomárních sil je moderní mikroskopický nástroj s velmi bohatým a různorodým aplikačním potenciálem.

Poděkování

Autoři děkují Ing. D. Horákovi, CSc. (Ústav makro-molekulární chemie AV ČR, Praha) za poskytnutí magnetických částic, doc. RNDr. Španové, CSc. a doc. Ing. B. Rittichovi, CSc. (Ústav chemie potravin a bio technologií, Fakulta chemická, Vysoké učení technické v Brně) za cenné připomínky k rukopisu.

Tato práce byla podpořena projekty LF_2012_019, LF_2013_006 a Ústavem Molekulární a Translační Medicíny CZ.1.05/2.1.00/01.0030.

Mgr. Hana Zapletalová

Ústav lékařské biofyziky

Lékařská fakulta

Univerzita Palackého v Olomouci

Hněvotínská 3,CZ-775 15 Olomouc

E-mail: hana.zapletalova@upol.cz

Tel: +420 585 632 110