Transformace indolentního folikulární lymfomu v difuzní velkobuněčný B-lymfom – molekulární podstata „nádorové agresivity“

Souhrn

Východiska: Folikulární lymfom (FL) je nejčastějším indolentním non-Hodgkinským lymfomem v západním světě. U většiny pacientů se jedná o indolentní onemocnění, ale u cca 20 % případů dochází po úvodní léčbě k časnému relapsu, což je spojeno s kratším celkovým přežitím. Další prognosticky závažnou událostí je histologická transformace FL do agresivního lymfomu, nejčastěji do difuzního velkobuněčného B-lymfomu. Díky genomickým studiím a myším modelům se nám lépe daří chápat molekulární podstatu vzniku FL a evoluci „agresivních“ subklonů buněk. Zároveň se také v posledních letech podařilo popsat deregulace molekulárních drah přispívajících k histologické transformaci FL.

Cíl: V tomto přehledovém článku shrnujeme komplexní mechanizmy, které jsou na molekulární úrovni zodpovědné za vznik, progresi a agresivitu FL a jeho transformaci. Domníváme se, že tato pozorování u FL mají obecnější přesah pro pochopení mechanizmů, které vedou k evoluci „agresivity“ nádorového onemocnění jako je divergentní evoluce, intraklonální variabilita a nádorová plasticita.

Klíčová slova:

difuzní velkobuněčný B-lymfom – folikulární lymfom – transformovaný folikulární lymfom – histologická transformace – molekulární mechanizmy

Úvod

Folikulární lymfom (FL) je onemocnění vycházející z B-lymfocytů germinálních center lymfatických uzlin. S incidencí ~3 případy na 100 000 obyvatel za rok se jedná o druhý nejběžnější non-Hodgkinský lymfom po difuzním velkobuněčném B-lymfomu (diffuse large-cell B-lymphoma – DLBCL). Jednou z největších výzev pro léčbu FL je jeho charakteristický heterogenní klinický průběh. Přestože se jedná o nevyléčitelné onemocnění, u většiny pacientů (~80 %) má převážně indolentní průběh, s mediánem doby přežití ~14 let od diagnózy. Revoluci v léčbě pacientů s FL do jisté míry způsobilo uvedení monoklonální protilátky proti CD20 – rituximabu – která se v dnešní době již standardně podává pacientům, často v kombinaci s chemoterapeutiky (např. R-CHOP) jako iniciální léčba, přičemž po 1. linii imunochemoterapie může dále probíhat udržovací léčba samotným rituximabem [1]. U některých pacientů může během jejich dlouhodobé léčby docházet ke vzniku rezistence na léčbu či k opakovaným relapsům onemocnění. Přibližně u 20 % pacientů dochází k progresi onemocnění jíž během prvních 2 let od první léčby, což je spojeno se zkrácenou dobou celkového přežití [2]. Doby 5 let od diagnózy se dožívá přibližně jen 30 % pacientů s ranou progresí onemocnění, tedy takovou, která nastává do 2 let od zahájení léčby [2,3]. Další kritickou událostí v klinickém průběhu onemocnění je histologická transformace do agresivní formy lymfomu, nejčastěji do DLBCL. Dochází k ní u přibližně 1–3 % pacientů za rok a medián doby přežití po transformaci nyní představuje přibližně 50 měsíců [2], resp. celkové přežití 5 let od rané transformace je cca 30 % [3]. Použití rituximabu mimo jiné snížilo riziko vzniku histologické transformace u pacientů, jejichž iniciální terapie a/nebo udržovací terapie zahrnuje rituximab [3]. Obecně však histologická transformace i nadále představuje kritickou událost v klinickém průběhu FL, která je jednoznačně spojená s kratší dobou přežití a jejíž úspěšná predikce by mohla hrát významnou roli v terapii. V neposlední řadě se pak na biologické úrovní jedná o stále neúplně pochopený fenomén. Znalost molekulární podstaty komplexních jevů, k nimž dochází při histologické transformaci, je klíčovým prvním krokem k popisu nových biomarkerů a budoucímu zavedení cílené léčby subtypů FL a/nebo transformovaného FL (tFL).

Principy patogeneze FL

Prvním krokem k pochopení patogeneze FL byl objev „jednotící“ genomické aberace, kterou je translokace t (14; 18) (q32; q21), vyskytující se u ~90 % případů FL [4]. Bylo zjištěno, že chybou při procesu rekombinace subgenů (VDJ) pro těžký řetězec imunoglobulinu v kostní dřeni dochází k translokaci genu BCL2 z chromozomu 14 na chromozom 18 (obr. 1), kde se tento gen dostává pod transkripční kontrolu zesilovače promotoru imunoglobulinového těžkého řetězce (IgH), což vede ke zvýšení jeho exprese. Protein BCL2 funguje jako inhibitor apoptózy, tudíž B-lymfocyty s jeho zvýšenou expresí získávají výhodu k přežití oproti ostatním B-lymfocytům v germinálních centrech. Pouze tento samotný mechanizmus ovšem není dostačující k rozvoji FL, jelikož bylo prokázáno, že B-lymfocyty s touto translokací se v malých počtech vyskytují i v periferní krvi zdravých jedinců (> 50 % populace) [5]. Je tedy zřejmé, že t (14; 18) je ranou událostí v procesu patogeneze FL, ale pro rozvoj onemocnění musí dojít ke vzniku dalších aberací.

V současné době je tedy představa patogeneze FL taková, že u buněk s translokací BCL2 nedochází k apoptóze při jejich prvním vstupu do germinálního centra a zároveň zde nepodstupují izotypový přesmyk a tvoří tak populaci buněk označovanou jako buňky podobné buňkám FL (FL-like cells), které exprimují IgM (obr. 1). Díky selekční výhodě způsobené zvýšenou expresí BCL2 sou tyto buňky i přes expresi nízko afinitních povrchových imunoglobulinů (BCR) pozitivně selektovány k opakovaným vstupům do germinálních center, kde u nich opakovaně probíhá somatická hypermutace a proliferace [5,6]. Tímto mechanizmem tak může u společné progenitorové buňky FL (common progenitor cell – CPC) docházet ke vzniku dalších nových mutací, které mohou vést až ke vzniku populace plně maligních FL buněk (obr. 1). Tento proces je označován jako klonální evoluce CPC a ve většině případů neprobíhá pouhou lineární akumulací mutací v jednom klonu, ale divergentní evolucí za vzniku různých buněčných subpopulací (obr. 1) [7,8].

Je zřejmé, že kromě již zmíněné jednotící aberace t (14; 18) se v mutačním spektru FL objevují i další opakovaně se vyskytující mutace. Za druhou nejčastěji se vyskytující deregulaci charakteristickou pro FL jsou považovány mutace epigenetických regulátorů, které se vyskytují cca u 96 % případů FL [9]. Nejčastěji popsané mutace jsou pak u genů pro enzymy histonových metyltransferáz KMT2D (~75 % případů FL) a EZH2 (12–30 % FL) a histonové acetyltransferázy CREBBP (~65 % FL) [9,10]. Inaktivační, respektive aktivační účinky těchto mutací mohou být značně pleiotropní a ovlivňují expresi velkého množství genů. Výskyt mutací v epigenetických regulátorech u FL před i po transformaci naznačuje jejich roli v rané fázi klonální expanze CPC [11,12].

Dalším zajímavým poznatkem je, že i přes translokaci t (14; 18), která způsobuje narušení imunoglobulinového lokusu inaktivací jedné imunoglobulinové alely, dochází u FL díky neporušeným alelám IgH a IgL k formování funkčního BCR a zároveň část pacientů nese aktivující mutace v BCR dráze (cca 20–30 %). Jedním z možných mechanizmů aktivace BCR u FL je N-glykosylace variabilních oblastí imunoglobulinových řetězců oligomanózovými motivy (~80 % případů FL) [13,14]. Dochází při ní k interakci těchto karbohydrátových motivů s povrchovými receptory buněk nádorového mikroprostředí FL, například s C-lektinovým receptorem dendritických buněk (DC-SIGN), což má za důsledek konstantní BCR signalizaci [14,15]. Popsány jsou ale i případy tonické BCR signalizace, či aktivace vlastními antigeny [16,17]. Celkově se tak udržování aktivity BCR signalizační dráhy jeví jako jedna z dalších důležitých strategií k přežití FL.

Normální germinální centra lymfatických uzlin jsou směsí subtypů B-lymfocytů, specializovaných CD4⁺ T-folikulárních pomocných buněk (TFH lymfocyty), folikulárních dendritických buněk (FDC) a dalších buněčných populací, které v mikroprostředí FL mohou mít pro- nebo anti-lymfomové funkce [18]. Han et al. [19] nedávno provedli dosud nejkomplexnější disekci mikroprostředí FL s pomocí „single cell“ sekvenování. Ukázali, že FL obsahují proměnlivé podíly FDC, ale jak přesně tyto buněčné populace ovlivňují patogenezi onemocnění, není zcela jasné. Béguelin et al. [20] ukázali, že mutace EZH2 narušují interakce mezi B-lymfocyty v germinálních centrech a TFH buňkami, a zároveň posilují interakce s FDC, což je činí vysoce závislými na FDC. Han et al. se zaměřili spíše na podskupiny T-lymfocytů v mikroprostředí FL a identifikovali čtyři třídy dle T-subpopulací: „imunitně vyčerpané“, „naivní“, „vlažné“ a „intermediární“. „Vlažné“ FL mikroprostředí zahrnovalo vyčerpané CD8 buňky, TFH, regulační T-lymfocyty (Treg) a nově definovanou populaci cytotoxických CD4 buněk, zatímco na opačném spektru „imunitně vyčerpané“ FL mikroprostředí obsahovalo hojné lymfomové buňky a málo T-lymfocytů, což bylo spojeno s horší prognózou. Ostatní kategorie mikroprostředí dle T-lymfocytů vykazovaly příznivější a vzájemně podobnou prognózu. Zdá se, že u FL je mikroprostředí souhrou mezi somatickými mutacemi buněk FL a populacemi buněk, které jsou geneticky normální, ale funkčně jsou ovlivněny interakcí s nádorovými buňkami.

Klonální vztah FL a tFL

Jak již bylo výše zmíněno, ke klonální evoluci CPC u většiny případů FL nedochází lineární evolucí jednoho klonu, ale divergentní evolucí, která vede ke vzniku množství různých subpopulací buněk FL [7,8]. Současné poznatky také ukazují, že rozdílné subklonální populace buněk FL se mohou vyskytovat nejen v průběhu času u jednoho pacienta, ale i v různých nádorových uzlinách pacienta ve stejném okamžiku [21]. Tyto poznatky byly potvrzeny i v další studii, kde Haebe et al. [22] prokázali častou genetickou a fenotypovou diverzitu mezi subpopulacemi FL buněk v rámci různých lymfatických uzlin. Autoři navrhli hypotézu o původu této heterogenity, kde původní schopnost buněk migrovat mezi lymfatickými orgány je díky genetickým alteracím ztracena a dojde tak ke vzniku nové divergentní subpopulace FL buněk. Rozdíly pak byly popsány i v mutacích klíčových genů a signálních drah, čímž bylo potvrzeno, že k patogenezi FL patrně může dojít rozdílnými cestami. Kromě rozdílů v rámci subpopulací buněk FL pak byly popsány i rozdíly v rámci populace TFH-lymfocytů (tab. 1). Tyto CD4⁺ buňky jsou v současnosti považovány za klíčovou součást nádorového mikroprostředí, které je chápáno jako de facto nezbytná komponenta umožňující přežívání FL buněk (tab. 1, obr. 2). Složení mikroprostředí a aktivita jeho jednotlivých složek byla spojena s agresivitou FL a byl popsán jejich vztah k riziku transformace [23]. Je pravděpodobné, že heterogenita mezi jednotlivými lymfatickými uzlinami může také zvyšovat riziko rané progrese či histologické transformace [22].

Obecně alterace specifické pro tFL vykazují značnou heterogenitu mezi jednotlivými vzorky pacientů a zároveň u většiny FL pacientů byly pozorovány unikátní, klonálně zastoupené aberace, nezávisle získané dominantním klonem FL. Pouze cca 20 % vzorků tak vykazuje vznik transformace lineární kumulací aberací jednoho klonu FL, zatímco většina tFL vzniká tzv. divergentní evolucí [11]. Z uvedeného vyplývá, že za proces histologické transformace FL není pravděpodobně zodpovědná jedna klíčová mutace, ale jedná se o komplexní proces, ve kterém hraje roli narušení několika molekulárních mechanizmů a vliv má také nádorové mikroprostředí (tab. 1, obr. 2).

Klíčové buněčné procesy narušené při transformaci FL

Na buněčné úrovni dochází při histologické transformaci k zániku typické architektury lymfatické uzliny a germinálních center. Na molekulární úrovni pak současné porozumění biologii histologické transformace předpokládá kombinaci vlivu genetických a epigenetických faktorů s faktory závislými na nádorovém mikroprostředí (obr. 2). Jedním z nejčastěji pozorovaných jevů u tFL (~90 % případů tFL) je výskyt bodových mutací, malých delecí a duplikací postihující 5‘ koncové sekvence genů, které vznikly aktivitou enzymu AID (aktivací indukovaná deamináza) [11], který je za normálních okolností zodpovědný za somatické hypermutace imunoglobulinů. Tento jev je proto označován jako aberantní somatická hypermutace (aSHM) a může být jedním z faktorů vedoucích k transformaci FL (tab. 1). Potvrzují to i data, kde byl pozorován vyšší výskyt mutací způsobených aSHM u pacientů s tFL oproti pacientům s netransformovaným FL [11]. O důležitosti mechanizmu aSHM vypovídají i výsledky aktuální studie, která se pokusila o vytvoření molekulárních subtypů FL, a právě vzorky s vysokým výskytem aSHM představovaly jeden z klíčových faktorů heterogenity mezi různými subpopulacemi FL [24]. V neposlední řadě pak důležitost tohoto mechanizmu ukazuje fakt, že tento typ mutací byl pozorován jak u BCL2, tak u genů kódujících transkripční faktory (BCL6 a MYC), jejichž deregulace se jeví jako klíčová v procesu transformace FL (tab. 1, obr. 2) [11]. MYC a BCL6 mohou fungovat jako potenciální onkogeny (viz níže) (tab. 1, obr. 2). Mezi hlavní buněčné molekulární mechanizmy, za které jsou tyto signální dráhy zodpovědné, patří proliferace, kontrola buněčného cyklu, opravy DNA, dynamika procesů v germinálních centrech, únik imunitnímu systému a v neposlední řadě také deregulace exprese krátkých nekódujících RNA (miRNA) (obr. 2) [10,11,25,26].

Obecně se u agresivních B-lymfomů často vykazují buňky, u nichž došlo například k deregulaci kontroly buněčného cyklu a opravy DNA (obr. 2). Dobrým příkladem je delece genů CDKN2A/B, která se vyskytuje až u poloviny případů tFL a zároveň se tyto bialelické alterace téměř nevyskytují u FL (obr. 2, graf 1) [11]. Proteinové produkty (p14-ARF, p16-INK4A a p15-INK4B) těchto tumor supresorových genů fungují jako negativní regulátory progrese buněčného cyklu z G1 do S fáze a zároveň jako stabilizátory klíčového nádorového supresoru p53. Delece CDKN2A/B tak může negativně ovlivňovat nejen regulaci buněčného cyklu, ale také správnou funkci p53 při kontrole poškození DNA. Dalšími popsanými mechanizmy jsou přímé vyřazení genu TP53 z funkce (delece/mutace u~20 % případů tFL) či amplifikace jeho negativních regulátorů – MDM2 a MDM4 (~30 % případů tFL) [7,27] (tab. 1, obr. 2, graf 1). Deregulace signální dráhy p53 hraje konzistentní a důležitou roli v procesu transformace FL (obr. 2).

Role transkripčních faktorů u tFL

Tradičně se germinální centra lymfatických uzlin dělí na dvě histologické zóny – tmavou zónu, kde probíhá intenzivní proliferace centroblastů, a světlou, kde naopak centrocyty podstupují selekci na základě afinity k antigenům. Mezi oběma zónami probíhá intenzivní migrace B-lymfocytů a buňky v obou zónách germinálního centra tak považujeme za stejnou populaci v různé fázi aktivace [28]. Výše zmíněné procesy jsou v germinálních centrech řízeny množstvím signálních drah, které jsou definovány klíčovými transkripčními faktory. Za fyziologických podmínek pozorujeme ve světlé zóně zvýšenou aktivitu MYC a NF-kB a sníženou aktivitu BCL6, zatímco ve tmavé zóně zvýšenou aktivitu BCL6, která stimuluje aktivaci AID a souběžně také potlačuje expresi MYC a CDKN2A/B (tab. 1, obr. 2) [27].

Jedním z nejcharakterističtějších jevů přítomných u téměř 75 % případů transformace FL je zvýšení aktivity proto-onkogenu MYC (tab. 1, obr. 2). MYC je klíčový transkripční faktor se schopností regulovat stovky cílových genů zapojených do různých buněčných drah a procesů, jako je proliferace a buněčný cyklus, apoptóza, replikace a opravy DNA, únik imunitního systému, buněčný metabolizmus a signalizace BCR. Konkrétně se například zapojuje do inhibice genu CDKN1B a jeho produktu p27, který slouží jako negativní regulátor buněčného cyklu, což může v důsledku vést ke zvýšené proliferaci. Regulační účinek MYC je dále umocněn skutečností, že MYC také řídí expresi řady miRNA [25], z nichž mnohé zpětně modulují jeho vlastní expresi a vytvářejí tak komplexní regulační smyčky. Zisk aktivity MYC u tFL byl iniciálně popsán díky detekci jeho chromozomální translokace (25 % případů tFL) a amplifikace (33 % případů tFL) (graf 1) [11], přičemž u vzorků FL se tyto aberace téměř nevyskytují [10,11]. Existují však i jiné mechanizmy, které vedou ke zvýšené expresi MYC. Toto zvýšení aktivity MYC podporuje lymfomagenezi a histologickou transformaci „indolentních“ B-buněčných malignit [29]. Význam MYC byl rozpoznán také v klasifikaci lymfomů [30], kde byly B-lymfomy s translokací BCL2 a MYC vyčleněny jako specifický subtyp, tzv. lymfom se dvěma aberacemi (double-hit lymphoma). U části double-hit DLBCL lze předpokládat původ z FL [31]. Méně častý je pak také současný výskyt aberací MYC, BCL2 a BCL6 [31] a pak se hovoří o lymfomu se třemi aberacemi (triple-hit lymphoma).

Kromě translokací MYC byly popsány další způsoby, kterými dochází u lymfomů k deregulaci exprese MYC. Jedním z mechanizmů aktivace MYC, nezávislém na přímém zvýšení počtu jeho kopií či lokalizaci, je již dříve zmíněná chronicky aktivní signalizace BCR. Pro FL jsou typické oligomanózové motivy na BCR, které reagují s DC-SIGN lektinem na makrofázích v nádorovém mikroprostředí, což mimo jiné přispívá právě k aktivaci MYC, přičemž tento způsob aktivace MYC nebyl pozorován u normálních B-lymfocytů [14]. Aktivita MYC může být také důsledkem interakce buněk FL s T-lymfocyty poskytujícími CD40 ligand, což je mechanizmus dobře známý u chronické lymfatické leukemie [32,33].

Se zvýšenou aktivitou MYC dále také souvisí deregulace miRNA (obr. 2) [25, 26,29]. Nejčastěji zvýšená aktivita MYC vede ke snížení exprese miRNA u B-lymfocytů. U některých z nich se pak podařilo přímo popsat roli jejich deregulace v procesu transformace FL. Studie porovnávající vzorky FL a tFL ukázala, že zvýšená aktivita MYC přispívá ke snížení exprese miR-150 (obr. 2), což v důsledku vede ke zvýšené aktivitě transkripčního faktoru FOXP1 [25]. Ten funguje jako důležitý regulátor aktivace B-lymfocytů a jeho deregulace byla asociována s kratší dobou přežití u FL a zvýšenou aktivitou BCR dráhy [25,34,35]. Recentní studie pak popsala funkce další miRNA, k jejímuž snížení aktivity také dochází důsledkem aktivity MYC a je asociována se zhoršeným klinickým průběhem FL. Jedná se o miR-7e-5p (obr. 2), jejímž cílovým genem je gen kódující ligand Fas (FasL), který přispívá k transformaci FL pomocí imunosuprese nádorového mikroprostředí [36]. Aktivita MYC však může mít i opačný efekt na expresi miRNA, jako například u klastru miR-17-92 (obr. 2), u kterého dochází působením MYC k jeho zvýšené expresi (15 % vzorků tFL oproti 7 % vzorků FL) [27].

Masivní proliferace a genomová nestabilita, ke které by došlo u buněk s amplifikovaným MYC, by byla problematicky udržitelná i pro nádorové buňky. MYC totiž kromě proliferace a buněčného růstu zároveň podporuje senescenci a apoptózu buněk, jako kontrolní samoregulační mechanizmus [29,37]. Aktivita MYC tudíž musí být i u nádorových buněk balancována. Jedním z těchto mechanizmů je například inhibice translace MYC zprostředkovaná miR-17/20, které snižují expresi kinázy kódované Chek2, čímž dochází ke zvýšení homeostázy nádorových buněk [37].

Druhým zásadním transkripčním faktorem, jehož deregulace má vliv při patogenezi a transformaci FL, je BCL6 (tab. 1, obr. 2). Na rozdíl od MYC se jedná o klíčový transkripční faktor buněk tmavé zóny. Expresí BCL6 dochází k represi diferenciace B-lymfocytů na plazmatické buňky, zatímco aktivita transkripčních faktorů PRDM1 a IRF4 naopak podporuje diferenciace těchto buněk [27]. V souladu s těmito poznatky pak delece PRDM1 a IRF4 a/nebo amplifikace BCL6 byly pozorovány u nezanedbatelného množství případů tFL (43 % případů tFL), stejně jako mutace genu MEF2B (~20 % případů tFL), který kóduje transkripční aktivátor BCL6 [27] (graf 1). Blokace diferenciace B-lymfocytů v germinálních centrech se tak jeví jako důležitý faktor v procesu transformace FL. Zároveň je s aktivitou BCL6 spojen další důležitý transkripční faktor buněk tmavé zóny – FOXO1, jehož mutace byly také popsány u tFL a regulují aktivitu AKT dráhy (~15 % případů tFL) (obr. 2, graf 1) [11,38]. FOXO1 funkce jsou propojeny s funkcemi BCL6, neboť svou aktivitou udržuje „transkripční program tmavé zóny“, vč. aktivace transkripce chemokinového receptoru CXCR4, a ve spolupráci s BCL6 pak také potlačování exprese genů zodpovědných za aktivaci imunitního systému, opravy DNA a diferenciaci plazmatických buněk [39].

V neposlední řadě pak k nesmírné komplexnosti FL transformace přispívá i deregulace NF-kB dráhy, tj. signalizace typické pro buňky světlé zóny germinálního centra (tab. 1). Konstitutivní aktivace této anti-apoptotické dráhy je charakteristická pro tzv. ABC subtyp DLBCL, jeden ze dvou hlavních molekulárních podtypů DLBCL. Deregulace genů zapojených do této signální dráhy byly pozorovány i u tFL a jsou předpokládány podobné efekty těchto mutací [7,10]. Pozorovány byly například amplifikace REL (~30 % případů tFL), delece TNFAIP3 (~10 % případů tFL), mutace MYD88 (~11 % případů tFL) a mutace CARD11 (~17 % případů tFL) (graf 1) [10,27]. Mimoto je s NF-kB signalizací spojena také zvýšená exprese IRF4, která přispívá k diferenciaci buněk světlé zóny (tab. 1). Jedná se tak do jisté míry o protikladné tvrzení k výše zmíněnému, kde transformace FL byla spojována s aktivací BCL6, a naopak ztrátou IRF4 a PRDM1. Bylo však popsáno, že u některých případů tFL může zvýšená exprese IRF4 sloužit jako marker rané transformace FL (tab. 1) [40]. Ukazuje se tak, že u FL/tFL jsou signální dráhy a molekulární mechanizmy zodpovědné za buněčné programy v rámci germinálních center navzájem provázané a často i protisměrné. Jedná se tak o další důkaz plasticity a heterogenity nádorových B-lymfocytů, jejichž narušení může podporovat transformaci FL. Různě aktivní buněčné programy v rámci germinálních center pak přispívají k míře podobnosti tFL s různými subtypy de novo DLBCL (viz níže) [4,22,40].

Únik před imunitním systémem u tFL

Jedním z obecných mechanizmů při úniku nádorů před imunitním systémem bývá potlačení exprese antigen prezentujících molekul a ligandů receptorů smrti u nádorových buněk. Příkladem může být například mutace či delece člena rodiny faktorů nekrotizujících nádory (TNF) Fas (~30 % případů tFL) (tab. 1, obr. 2, graf 1) [11]. Receptor smrti Fas slouží jako důležitý mediátor apoptózy B-lymfocytů germinálních center s nízkoafinitními, popřípadě autoreaktivními BCR [41]. Situace je poněkud komplexnější u dalšího člena rodiny TNF – TNFRSF14 (HVEM), u kterého byly také popsány inaktivační mutace či delece, které byly již dříve dány do souvislosti se zhoršeným klinickým průběhem u FL (obr. 2) [42]. Protein kódovaný genem TNFRSF14 slouží jako buněčný membránový receptor, jehož ligandem je protein BTLA (B a T-lymfocytární atenuátor). Za fyziologických podmínek funguje signalizace HVEM-BTLA jako jistý kontrolní mechanizmus mezi buňkami imunitního systému díky negativní regulaci interakcí B-lymfocytů v germinálních centrech s TFH-lymfocyty. V případě vyřazení této signalizace dostávají nádorové buňky klíčové signály k přežití od svého buněčného mikroprostředí a dochází tak k podpoře lymfomageneze v germinálních centrech [43]. Inaktivační mutace či delece genu TNFRSF14 byly potvrzeny i u pacientů s tFL (~20 % případů tFL) [10] (graf 1). Jako další specifické mutace pro transformaci FL se pak jeví bialelické mutace či delece genů β2M (~11 % případů tFL) a CD58 (~4 % případů tFL) (obr. 2, graf 1) [11,27]. β2M kóduje podjednotku molekuly hlavního histokompatibilního systému 1. třídy (HLA-I), která slouží k prezenci antigenů CD8⁺ cytotoxickým T-lymfocytům, které v případě rozpoznání cizorodé struktury zahájí destrukci buňky. Podobnou funkci má také CD58, který funguje jako ligand pro receptor CD2, který je přítomný na T-lymfocytech a NK buňkách a umožňuje jejich správnou adhezi a aktivaci [44]. Je tedy zřejmé, že mechanizmy úniku před imunitním systémem jsou také součástí patogeneze FL a jeho následné transformace. Interakce nádorových a nenádorových buněk (tj. převážně jiných buněk imunitního systému) v nádorovém mikroprostředí hraje stěžejní roli v procesu patogeneze a transformace FL.

Zánik architektury uzlin u tFL a migrace z germinálního centra

Jako do jisté míry finální krok při transformaci FL můžeme chápat zánik tzv. folikulární architektury, tedy typického uspořádání buněk v lymfatických uzlinách u FL (obr. 2). Jedním z popsaných mechanizmů, díky kterému B-lymfocyty setrvávají v germinálních centrech, je exprese receptorů spřažených s G-proteinem (GCPR) S1PR2 a P2RY8 (obr. 2), které při vazbě s jejich asociovanými G-proteiny Ga12 a Ga13 aktivují GTPázu RhoA. Díky zvýšené aktivitě RhoA dochází k inhibici migrace B-lymfocytů a zároveň také k inhibici signální dráhy AKT [45]. Na myších modelech bylo prokázáno, že v důsledku inaktivačních mutací genů zapojených do inhibice migrace B-lymfocytů dochází k aktivaci AKT a šíření B-lymfocytů z germinálních center do periferní krve, lymfy a kostní dřeně, čímž dochází k zániku architektury germinálních center, typické pro FL [45]. U DLBCL se vyskytují inaktivující mutace genů zapojených do inhibice migrace B-lymfocytů (S1PR2, GN13) u ~30 % případů subtypu GCB-DLBCL [46]. Obdobné inaktivační mutace genů (např. S1PR2, GNA13, ARHGEF1, P2RY8) byly prokázány i u tFL (~22 % případů tFL), stejně jako mutace vedoucí k aktivaci signální dráhy AKT [10]. Zvýšená aktivita AKT pak v tomto případě podporuje přežívání a proliferaci buněk migrujících z germinálního centra. K zvýšení AKT aktivity mohou přispívat současně se vyskytující mutace signálních drah mTOR – například aktivační mutace RRAGC (17 % případů tFL) a PI3K/AKT/mTOR – například delece/ztráta funkce PTEN (~15 % případů tFL) (obr. 2). Inaktivační mutace genů zprostředkovávajících homeostázu germinálních center společně s aktivací signální dráhy AKT tak mohou představovat jeden ze zlomových momentů histologické transformace FL spojené se zánikem folikulárního uspořádání germinálních center.

Srovnání tFL s de novo DLBCL

Histologicky a morfologicky jsou tFL a de novo DLBCL téměř nerozlišitelné a otázkou tak zůstává, jaký je mezi těmito dvěma chorobami geneticky rozdíl. Některé z nejtypičtějších mutací pro FL a tFL byly popsány i u de novo DLBCL. Jedná se například o translokace genů BCL2, BCL6 a MYC (graf 2) a stejně jako FL/tFL, tak i de novo DLBCL může být klasifikován jako lymfom se dvěma (double hit) (MYC a BCL2 nebo BCL6) či třemi (triple hit) aberacemi (MYC, BCL2 a BCL6). U DLBCL s translokací BCL2 je do jisté míry předpokládán vznik z FL minimálně u části případů [31]. Mezi další společné klíčové dráhy pak může patřit zvýšená exprese MDM2, vedoucí k inhibici p53, aktivační mutace histonmetyltransferázy EZH2, aktivace signálních drah NF-kB (amplifikace REL) a PI3K/AKT/mTOR (delece PTEN), obdobný mechanizmus zajištující migraci z germinálních center (inaktivační mutace genů S1PR2, GNA13 aj.) a také výskyt aSHM [46,47]. Narušení těchto signálních drah se sice vyskytují u obou onemocnění, ovšem s rozdílnou frekvencí. U případů tFL se téměř vždy nachází translokace BCL2 a mutace epigenetických modifikátorů, a je tudíž alespoň částečně zachován typický expresní profil FL. Jiná situace pak nastává u de novo DLBCL, kde podle expresních profilů rozlišujeme dva základní molekulární podtypy – ABC a GCB-DLBCL, které mají svou charakteristickou a vzájemně rozdílnou expresi, přičemž exprese tFL se může přibližovat oběma z těchto podtypů [11].

Analýzy genové exprese obou onemocnění ze vzorků pacientů ukázaly, že některé expresní klastry genů vykazují podobnost mezi tFL a de novo DLBCL, zatímco jiné naopak poukazují na jejich rozdílnost [48]. Vzorky pacientů s de novo DLBCL vykazovaly vyšší expresi genů spojených s buněčnou proliferací, buněčným cyklem a také genů cílených MYC oproti vzorkům pacientů s tFL. Pro vzorky pacientů s tFL pak byla oproti vzorkům pacientů s de novo DLBCL identifikována zvýšená exprese genů spojených se signálními dráhami B-lymfocytů (např. SYK, LYN, BLK, CD79A, CD79B), anti-proliferačních genů (WEE1 a BTG1) a genů kódujících povrchové markery B-lymfocytů (MME/CD10, MS4A2/CD20 a CDw52/CAMPATH1) [48]. V novější studii pak byla ukázána i rozdílná exprese na úrovni miRNA mezi oběma onemocněními, kde bylo potvrzeno 14 rozdílně exprimovaných miRNA [49]. V čem naopak vzorky tFL a de novo DLBCL vykazovaly podobnou expresi, byly geny hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) (geny HLA, β2M, PSMB8, PSMB9), s výjimkou genu pro HLA-E, jenž funguje jako hlavní ligand pro inhibiční receptor NK buněk, který vykazoval významně vyšší hodnoty exprese u případů tFL oproti de novo DLBCL [48]. Celkové porovnání exprese výše zmíněných genů u vzorků v době diagnózy FL, v době vzniku transformace FL a při diagnóze de novo DLBCL ukázaly, že tFL má více podobnou expresi se vzorky FL než se vzorky de novo DLBCL [48]. Tyto závěry pak byly potvrzeny i výsledky pozdějších studií, kde bylo prokázáno, že mutace genů typické pro FL (KMT2D, CREBBP, BCL2) jsou výrazněji zastoupeny u tFL [11].

Ještě konkrétnější informace nám pak poskytují studie, které se zabývají podobností tFL se dvěma hlavními molekulárními subtypy de novo DLBCL, tedy GCB-DLBCL a ABC-DLBCL. Bylo zjištěno, že tFL na základě své exprese může být podobný oběma z těchto subtypů [10,11], přičemž klíčovou roli zde hraje rozdílná strategie proliferace, kde u tFL byl pozorován jak vzorec typický pro buňky tmavé zóny (na BCL6 závislý tFL, podobný GCB-DLBCL), tak vzorec buněk světlé zóny (na NF-kB a MYC závislý tFL, podobný ABC-DLBCL) [27]. Ze srovnávacích studií pak vyplynulo, že větší procento případů tFL (70–80 %) je geneticky bližší GCB-DLBCL [11,27,40]. Ze srovnání genomických profilů vzorků tFL se vzorky obou subtypů de novo DLBCL vyplynulo, že mezi hlavní společné znaky tFL a GCB-DLBCL patří translokace BCL2, amplifikace REL a mutace EZH2, GNA13 a TNFRSF14 (graf 2) [11]. Nelze však tvrdit, že by tFL a GCB-DLBCL byly totožné, jelikož byly pozorovány i genetické aberace specifické spíše pro tFL. Specificky se jeví například bialelická delece CDKN2A/B (~30 % případů tFL a 0 % případů GCB-DLBCL) (graf 2) [11]. V menším procentu případů (< 30 %) pak tFL vykazuje větší podobnost s expresním vzorcem ABC-DLBCL [27,40]. Mezi typické aberace ABC-DLBCL, které se vyskytují jak u FL, tak u tFL, patří mutace v genech způsobující aktivace signální dráhy NF-kB. Konkrétně se jedná o mutace CARD11, MYD88 a TNFAIP3 (graf 2), přičemž pouze mutace MYD88 byly zřetelně více zastoupené u případů tFL podobného ABC-DLBCL (20 % případů oproti 5 % případů) oproti tFL podobnému GCB-DLBCL [10]. Zároveň je pro tFL podobný ABC-DLBCL typické, že ve vyšší míře vzniká z FL bez charakteristické translokace BCL2 a zároveň u něj často dochází ke zvýšené expresi IRF4 (tab. 1) [40]. Obecným závěrem vyplývajícím z těchto studií je, že tFL vzniká z agresivní subpopulace FL, u které vinou zisku dalších mutací (často sdílených právě s de novo DLBCL) za vlivu nádorového mikroprostředí dochází k transformaci, přičemž na genetické úrovni tFL zůstává na pomezí mezi FL a některého z molekulárních subtypů de novo DLBCL.

Závěr

Molekulární mechanizmy rané progrese a transformace FL nejsou zatím zcela popsány. Předpokládá se, že příčinou heterogenity klinického průběhu u pacientů s FL je právě komplexita tohoto onemocnění na buněčné a molekulární úrovni. Jedním z významných zdrojů této komplexity je vznik maligních subklonálních populací v lymfatických uzlinách pacienta, které vznikají procesem tzv. divergentní evoluce. Subklonální populace mohou nabýt biologicky zřetelně jiných charakteristik, což může vést ke vzniku buněk s vysokou mírou proliferace a následnému zániku folikulární architektury germinálního centra a tím „transformaci“ choroby na agresivní lymfom. Taková histologická transformace (typicky do DLBCL) je spojena se zvýšenou agresivitou onemocnění a patří mezi nejčastější příčinu úmrtí u pacientů s FL [50]. I přesto, že se na histologické úrovni od sebe tFL a DBLCL téměř neodlišují, ze studií vyplývá, že genom a také transkriptom tFL je oproti de novo DLBCL unikátní. V průběhu transformace FL dochází k alespoň částečnému zachování expresního profilu typického pro FL a z obou subtypů DLBCL je pak u většiny případů tFL pozorována vyšší podobnost exprese s GCB-DLBCL spíše než ABC-DLBCL. Proto je důležité přistupovat k tFL jako k unikátní biologické entitě. Na základě těchto studií bylo popsáno několik faktorů, u kterých se předpokládá důležitá role v procesu transformace. Klíčové jsou mutace genů zapojených do oprav DNA (TP53, CDKN2A/B) a dále pak mutace genů se značně pleiotropním účinkem, jako jsou transkripční faktory. Zatímco u epigenetických regulátorů je jejich role dobře popsána hlavně při vzniku choroby, deregulovaná exprese transkripčních faktorů může být jednou z klíčových události v procesu transformace. Transkripční faktory se významně podílejí na kontrole procesů jako je buněčný cyklus, opravy DNA, proliferace, diferenciace, buněčný metabolizmus a buněčná smrt, přičemž buňky s aberantní regulací těchto drah mohou být pozitivně selektovány. Jako jeden z velmi důležitých transkripčních faktorů deregulovaných při transformaci FL se jeví např. MYC. Kromě regulace exprese množství protein-kódujících genů, s aktivitou MYC pak také úzce souvisí deregulovaná exprese miRNA, které slouží jako globální regulátory transkriptomu tím, že každá jednotlivě může mít desítky až stovky cílů. V neposlední řadě hrají zásadní roli ve vzniku a progresi FL i nenádorové buňky a jejich komplexní interakce s maligními B-lymfocyty v mikroprostředí lymfomu. Zatímco se buňky FL snaží uniknout rozpoznání nádorově specifickými T-lymfocyty, jiné nenádorové buňky poskytují signály nutné k přežití a proliferaci buněk FL. Krom již dříve popsaných FL-makrofág interakcí skrze oligomanózové motivy na BCR se v současnosti stále větší pozornost věnuje interakcím s TFH-lymfocyty.

Závěrem lze konstatovat, že pochopení biologie tFL a agresivních subtypů FL je klíčové pro zlepšení stratifikace pacientů a personalizaci léčby. Pro FL a jeho časnou progresi či transformaci je přetrvávající snaha o nalezení biomarkerů, které by umožnily stratifikaci pacientů a mohly tak přispívat např. k úpravě terapeutické strategie. Jako jeden z možných kandidátů se jeví například exprese vybraných miRNA, které jsou díky své krátké délce velmi stabilní ve fixovaných tkáňových vzorcích, a proto mohou sloužit jako relativně snadno dostupné biomarkery. Z recentních studií však vyplývá, že bude obtížné predikovat riziko transformace z analýzy biopsie jednotlivé uzliny vzhledem k vysoké heterogenitě subklonálních populací mezi jednotlivými lymfomovými uzlinami. Výše zmíněné rozdíly v mutačním a transkripčním profilu různých FL subpopulací mohou hrát roli v rozdílné odezvě na danou léčbu. V neposlední řadě se v dnešní době do klinických studií dostává stále více cílených léčiv, která specificky ovlivňují klíčové biologické procesy neoplastických buněk (např. EZH2 inhibitory) nebo aktivují imunitní systém proti nádoru (checkpoint inhibitory, imunomodulační léčiva). Jako experimentální cíle se začínají také testovat inhibitory transkripčních faktorů, například Omomyc, který inhibuje funkce transkripčního faktoru MYC [51]. Vývoj a správná optimalizace nových léčiv je však závislá na znalostech molekulárních mechanizmů, na popsání klíčových signálních drah a interakcí v buněčném mikroprostředí.

 

Poděkování

Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. NU22-03-00117 a NU23-08-00448; Projektem Národní ústav pro výzkum rakoviny (Program EXCELES, ID: LX22NPO5102) – Financováno Evropskou unií – Next Generation EU; podpořeno MZČR-RVO (FNBr, 65269705); a MUNI/A/1224/2022.

 

Autoři deklarují, že v souvislosti s předmětem studie nemají žádné komerční zájmy.
The authors declare that they have no potential conflicts of interest concerning drugs, products, or services used in the study.

Redakční rada potvrzuje, že rukopis práce splnil ICMJE kritéria pro publikace zasílané do biomedicínských časopisů.
The Editorial Board declares that the manuscript met the ICMJE recommendation for biomedical papers.

doc. MUDr. Mgr. Marek Mráz, Ph.D.
CEITEC – Středoevropský technologický institut
Masarykova univerzita
Kamenice 5 625 00, Brno
e-mail: marek.mraz@email.cz

Obdrženo/Submitted: 20. 1. 2023
Přijato/Accepted: 26. 3. 2023