Histopatologická diagnostika myokarditid

Souhrn

Histopatologické vyšetření endomyokardiální biopsie je dodnes zlatým standardem v diagnostice myokarditid (MK). Mikroskopická diagnóza se dlouhá léta opírala o tzv. Dallaská kritéria, která MK na morfologické úrovni definovala jako přítomnost zánětlivé celulizace a známek poškození kardiomyocytů. Vysoké procento falešně negativních výsledků a značná subjektivita v interpretaci nálezů však vedly ke změně těchto kritérií a zařazení imunohistochemie do diagnostického procesu. Morfologická klasifikace MK pak vychází ze složení zánětlivého infiltrátu. Nejčastějším typem MK v bioptické praxi je MK lymfocytární, méně časté jsou pak MK obrovskobuněčné, granulomatózní, eozinofilní a neutrofilní. Cílem tohoto doškolovacího článku je informovat o aktuálním stavu histopatologické diagnostiky MK a v návaznosti na předchozí práci v tomto čísle časopisu „Štěchovský, Adla, Bonaventura: Myokarditidy a kardiomyopatie z pohledu kardiologa“ komentovat rozdílný klinický a patologický pohled na tuto skupinu chorob.

Klíčová slova:

Dallaská kritéria – endomyokardiální biopsie – histopatologie – myokarditida

Mikroskopické vyšetření endomyokardiální biopsie (EMB) s pozitivním záchytem zánětlivé celulizace je dodnes považováno za zlatý standard v diagnostice myokarditid (MK) (1). Nicméně nutnost invazivního výkonu a vysoké procento falešně negativních výsledků jsou předmětem přetrvávající nespokojenosti na klinické i patologické úrovni. Kontinuální snaha o zkvalitnění klinických diagnostických metod a zpřesnění histopatologických kritérií je tak pochopitelná a výsledkem jsou časté změny v interpretaci EMB i její pozice v rámci multidisciplinárního diagnostického algoritmu.

V předchozí práci „Štěchovský, Adla, Bonaventura: Myokarditidy a karidomyopatie z pohledu kardiologa“ si autoři kladli za cíl informovat o klinické klasifikaci MK a přiblížit čtenářům kardiologickou část diagnostického procesu. Tento doškolovací článek na předchozí text navazuje histopatologickou diagnostikou MK, komentuje její výhody a limitace, klasifikuje MK z morfologického pohledu a informuje o aktuálně užívaných mikroskopických diagnostických kritériích.

TECHNICKÉ ASPEKTY ODBĚRU A ZPRACOVÁNÍ VZORKU

Rozhodnutí provést EMB obvykle vychází z klinické suspekce na závažné nebo rychle probíhající onemocnění a každá EMB tak představuje pro patologa diagnostickou výzvu. Množství materiálu je většinou značně limitováno a jakkoliv nesprávně provedený odběr, transport či zpracování vzorku mohou zásadním způsobem snížit výtěžnost biopsie a ovlivnit výslednou diagnózu. Při suspekci na myokarditidu se EMB obvykle provádí z pravé srdeční komory transjugulární nebo femorální cestou. Žilní přístup je méně technicky náročný než přístup arteriální a v rukou zkušeného kardiologa představuje relativně bezpečnou proceduru s nízkým procentem život ohrožujících komplikací. Nevýhodou je však vysoké procento falešně negativních výsledků, které se v případě odběru standardního počtu vzorků (obvykle 3-4) pohybuje okolo 70 % a u některých diagnóz, jako např. sarkoidóza srdce, dosahuje až 90 % (2,3). Vyšší záchytnost má kombinovaný odběr z pravé i levé komory, případně echokardiograficky či skiaskopicky navigovaná EMB (4-6). Standardní odběr EMB pro potřeby světelné mikroskopie by měl zahrnovat alespoň 3 vzorky o velikosti 1-2 mm³ (7). Případné další vzorky a jejich počet se odvíjí od klinicky zvažované diagnózy. V případě MK je často odebírán jeden vzorek navíc, který je využit k izolaci nukleových kyselin a průkazu přítomnosti virů metodou polymerázové řetězové reakce (PCR). U kardiomyopatií, kde je mnohdy zapotřebí provést i další specializovaná vyšetření (elektronová mikroskopie, imunohistochemie,...) je množství materiálu obvykle větší. Odebraný materiál by měl být kardiologem šetrně vyjmut z bioptických kleští (nejlépe jehlou, pinzeta drobné vzorky často zhmoždí) a transportován na patologické oddělení. Vzorky jsou zasílány zásadně v nativním stavu, o případné formolové fixaci či jiné formě zpracování rozhoduje až patolog. Vhodný není ani transport ve zkumavce naplněné fyziologickým roztokem, nasáklý plovoucí vzorek může komplikovat diagnostický proces nepříjemnými artefakty, které mohou věrně imitovat intracelulární edém a v některých případech i dokonce imponovat jako střádavé metabolické onemocnění. Jako ideální se jeví vzorek položit do Petriho misky na kus gázy navlhčené fyziologickým roztokem (8). Vlhké prostředí zabrání vyschnutí vzorku a zároveň nedojde k jeho nasáknutí.

Materiál je doporučeno fixovat v 10% pufrovaném formolu o pokojové teplotě (7). Jak již bylo zmíněno, jeden vzorek lze ponechat v nativním stavu a využít jej pro potřeby mikrobiologického vyšetření (8-10). Peroperační histopatologická diagnostika ze zmraženého materiálu není doporučována z důvodu obtížného a často nespolehlivého rozpoznávání zánětlivých infiltrátů (7). Vzorky jsou následně prokrájeny v sériových řezech na více skel, minimem by mělo být 10 řezů. Kvalitně provedené barvení hematoxylinem a eozinem je pak základním kamenem diagnostiky MK. Z dalších specializovaných metod má význam Massonův trichrom nebo Movatův pentachrom ke zhodnocení fibrotizace (7,11). Imunohistochemické vyšetření v diagnostice MK je komentováno níže.

HISTOPATOLOGICKÁ KRITÉRIA PRO DIAGNOSTIKUMYOKARDITID

Prvními standardizovanými diagnostickými kritérii byla tzv. Dallaská kritéria z roku 1987 (12) (tab. 1), která byla extenzivně užívána v bioptické praxi po více než dvě následující dekády. Podle těchto kritérií je pro diagnózu MK vyžadována „Přítomnost zánětlivého infiltrátu v myokardu spolu s nekrózou a/nebo degenerací okolních kardiomyocytů, neodpovídající ischemickému poškození v rámci koronárního onemocnění.“ Jak vyplývá z definice, degenerací myocytů nemusí být nutně vyvinutá nekróza. Naopak, nález je mnohdy diskrétní, v podobě mírné hypereozinofile nebo „setřelého“ vzhledu cytoplazmy, ztráty příčného pruhování či přítomnosti intracytoplazmatických lymfocytů. Při každém nálezu zánětlivého infiltrátu je tak zapotřebí v jeho okolí po těchto změnách aktivně pátrat. V první biopsii je dle Dallaských kritérií nález zánětlivého infiltrátu spolu s výše popsanou degenerací kardiomyocytů hodnocen jako aktivní MK. Pakliže je přítomný pouze zánět bez prokazatelné destrukce myocytů, odpovídá obraz tzv. borderline MK. V případě následných kontrolních biopsií je pak kombinace zánětlivého infiltrátu a myocytárního poškození hodnocena jako perzistující MK a samotný zánět (který bývá obvykle mírnější než v první biopsii) jako hojící se MK. V rámci bioptické zprávy by měl patolog specifikovat složení zánětu a vyjádřit se k přítomnosti a distribuci fibrotizace. Je důležité zmínit, že přítomnost či absence fibrózy nijak nesouvisí s diagnózou aktivní nebo perzistující MK, terminologie vychází čistě z faktu, zda se jedná o první nebo následnou biopsii (13).

Dallaská kritéria s sebou nicméně přinesla i řadu kontroverzí. Je to předně jejich značná subjektivita, a to nejen stran hodnocení diskrétního myocytárního poškození, ale i přítomnosti zánětlivého infiltrátu. Zejména lymfocytární celulizace může být zaměněna s jádry žírných buněk, příčně zachycenými jádry fibroblastů nebo endoteliemi kapilár (14). Problematické jsou v tomto zejména pediatrické EMB, dětský myokard je totiž výrazně buněčnější než dospělý. Mezi další limitace pak patří vysoké procento falešně negativných výsledků a nemožnost rozpoznání proběhlé MK z první biopsie (14,15). Dallaská kritéria se tak v řadě publikací stále častěji stávala terčem kritiky (za vše hovoří práce od Baughmana KL: Diagnosis of myocarditis: death of Dallas criteria, 14). Zásadní změnu přinesl společný projekt Světové Zdravotnické Organizace a International Society and Federation of Cardiology Task Force on the Definition and Classification of Cardiomyopathies. Jeho výsledkem bylo etablování tzv. Marburských kritérií (tab. 2), jejichž součástí se stal i imunohistochemický průkaz lymfocytů v bioptickém vzorku (16). Dle těchto kritérií je MK na mikroskopické úrovni definována nálezem 14 a více leukocytů detekovaných imunohistochemicky na mm² vzorku, z nichž minimálně 7 musí tvořit T-lymfocyty a maximálně 4 makrofágy. Dříve používaný průkaz antigenů LCA a CD3 je dnes nahrazen protilátkou proti CD45RO, která má v diagnostice MK vyšší záchytnost (17). Obdobně jako v Dallaských kritériích je i zde pro diagnózu akutní MK v první biopsii vyžadována přítomnost zánětlivého infiltrátu spolu s myocytárním poškozením. Pouhá přítomnost zánětu, která by dříve odpovídala borderline MK, byla nahrazena termínem chronická MK (znovu zcela nezávisle na přítomnosti či absenci fibrotizace). Diagnóza MK v následné biopsii pak odpovídá kritériím v první biopsii, jednotlivé kategorie se liší pouze podle toho, zda intenzita zánětu ubývá či nikoliv.

Marburská kritéria přinesla nepochybně zpřesnění diagnostiky MK díky využití imunohistochemických metod a v současné době jsou součástí doporučených postupů European Society of Cardiology (9) a figurují i v oficiálních doporučených postupech pro odběr a zpracování EMB dle Association for European Cardiovascular Pathology a Society for Cardiovascular Pathology (18). Bohužel, ani Marburská kritéria však neodkázala odstranit některé subjektivní obtíže v hodnocení, zejména myocytárního poškození. Obligátní použití imunohistochemie navíc může v řadě případů vést k nadhodnocení výsledků, což se týká zejména resekčních a post mortem vzorků. Jak Dallaská, tak i Marburská kritéria byla etablována pro EMB. Neexistuje však validace pro nekroptický materiál či explantovaná srdce (19). Samostatnou kapitolou je pak přítomnost lymfocytů v myokardech pediatrických pacientů, která se zdá být fyziologická ve vyšším množství než v myokardu dospělém. V nedávné době se objevila snaha stanovit kritéria pozitivity pro MK u dětí do 1 roku (20,21), což vedlo k extrémnímu nárůstu záchytu MK v nekroptickém materiálu u novorozenců a kojenců zemřelých pod obrazem syndromu náhlého úmrtí. U malých dětí (novorozenci, kojenci) se tak stále doporučuje spíše spoléhat na Dallaská kritéria (19).

V neposlední řadě je zapotřebí zmínit, že obě kritéria jsou platná pro diagnostiku lymfocytární MK. Pro jiné druhy MK (eozinofilní, obrovskobuněčná,...) není nezbytný nález myocytárního poškození (i když ve většině případů přítomno je).

DETEKCE PŘÍTOMNOSTI VIRŮ Z BIOPTICKÉHO VZORKU

Průkaz virové nukleové kyseliny metodou PCR dle některých doporučení patří do rukou patologa (22), v řadě případů však patologické oddělení pouze izoluje nukleové kyseliny a následně je poskytne mikrobiologickému ústavu nebo vzorek na mikrobiologii odesílá přímo kardiolog v rámci bioptického odběru. Jak již bylo zmíněno v předchozí práci, samotný průkaz přítomnosti virové nukleové kyseliny bez nálezu zánětlivé celulizace není pro diagnózu myokarditidy dostačující. Viry lze metodou PCR detekovat i v EMB nebo explantovaných srdcích s jinými diagnózami, například dilatační kardiomyopatií, a dokonce i v dárcovských srdcích či náhodně odebraných vzorcích z nekropsie (23,24). Někdy se prokáže i přítomnost více virů zároveň (25). Každý vzorek z EMB navíc obsahuje určité množství krve a PCR provedená z bioptického materiálu tak nezaručuje, že se jedná o virus pocházející přímo z dané tkáně a ne jen z periferní cirkulace. Řada autorů tak upřednostňuje přímý průkaz virů formou in situ hybridizace (26-30). Klinický význam by tak mohl mít paradoxně spíše negativní nález. Dle některých prací (22) totiž absence virové nukleové kyseliny v EMB s histopatologicky prokázanou myokarditidou predikuje lepší prognózu.

JEDNOTLIVÉ MORFOLOGICKÉ VZORCE MYOKARDITID

Ve všech odvětvích nenádorové patologie platí základní poučka, že patolog nevidí konkrétní choroby, nýbrž morfologické vzorce a každý z těchto vzorců má svojí diferenciální diagnózu. Stejně tak je tomu i v histopatologické diagnostice MK, kdy nevycházíme z etiologické klasifikace (MK virová, bakteriální, autoimunitní,...), ale z klasifikace morfologické, která se odvíjí od složení zánětlivého infiltrátu.

Lymfocytární myokarditida

Lymfocytární MK je nejčastějším typem MK v bioptické praxi. Definuje jí převaha lymfocytů v zánětlivém infiltrátu spolu s absencí mnohojaderných buněk či granulomů (obr. 1A a 1B). Minoritní příměs neutrofilů či eozinofilů je častá a diagnózu nevylučuje. Nicméně převaha granulocytů či směsná buněčná populace by měla vést k úvaze nad jiným typem MK nebo MK ve fázi hojení (15,31,32). Zánět bývá většinou fokální, méně často difúzní. Jeho distribuce je zcela náhodná, bez jakékoliv predilekční lokalizace, z čehož vyplývá vysoké procento falešně negativních výsledků (3).

Z etiologického hlediska je tento typ MK nejméně specifický. Většinu případů tvoří virová MK, agens však mnohdy není detekováno a zvažován je autoimunitní proces, ať již primární nebo v návaznosti na předchozí infekci (32-34). V malé části případů může lymfocytární vzorec vykazovat i bakteriální MK, zejména Lymeská borelióza, nebo parazitní onemocnění typu toxoplazmózy nebo Chagasovy nemoci, kde může napomoct přímý záchyt agens v cytoplazmě kardiomyocytů (často spolu s rizikovou epidemiologickou anamnézou a tkáňovou či periferní eozinofilií) (4,9,35,36).

Obraz lymfocytární MK je z morfologického hlediska neodlišitelný od celulární rejekce. U pacientů po transplantaci srdce tak patolog neodkáže odlišit rejekční zánětlivý infiltrát od infekčního (37).

Lymfohistiocytární myokarditida

Tato skupina je definována směsnou populací lymfocytů a makrofágů s nekonstantní příměsí mnohojaderných buněk. Spadají sem dvě podkategorie:

Obrovskobuněčná myokarditida

I v případě obrovskobuněčné MK jsou dominantní buněčnou populací lymfocyty. Je to však právě přítomnost mnohojaderných histiocytů, většinou doprovázená i vyšším počtem jednojaderných makrofágů, která ji odlišuje od lymfocytární MK (obr. 2). Součástí zánětu bývají i eozinofilní granulocyty, často i ve větším počtu (38-40). Z klinického hlediska jde o závažné, často fulminantně probíhající onemocnění, což reflektuje i mikroskopický nález s extenzivním, často až difúzním postižením myokardu. EMB má v tomto případě vysokou záchytnost (až 80%) (41). Onemocnění většinou postihuje obě srdeční komory, popsána však byla i obrovskobuněčná MK s predilekční lokalizací v síních. Jedná se nejspíše o samostatnou jednotku, která má indolentní průběh a dobrou prognózu (42,43). Jako MK s mnohojadernými buňkami se v některých případech mohou manifestovat i specifické infekce (ačkoliv ty většinou nabývají obrazu granulomatózní MK) nebo tento obraz může napodobovat reakce na cizorodý materiál (např. různé srdeční implantáty) (44).

V diferenciální diagnóze je nutné vyloučit zejména granulomatózní myokarditidu (tab. 3). Jakýkoliv záchyt epiteloidního granulomu vylučuje obrovskobuněčnou MK a téměř jistě znamená diagnózu srdeční sarkoidózy, která představuje drtivou většinu granulomatózních zánětu srdce. Velké procento srdečních sarkoidóz však dobře formované granulomy postrádá a přítomny jsou jen izolované mnohojaderné buňky. Diagnóza je v těchto případech složitá a je zapotřebí si všímat doprovodných histopatologických nálezů. K odlišení těchto dvou afekcí napomůže výše zmíněná intenzita zánětu, která je v případě obrovskobuněčné MK výraznější. Dalším pomocným nálezem je přítomnost eozinofilů, která je pro obrovskobuněčnou MK typická a u sarkoidózy téměř vždy chybí, nebo je zastihneme jen zcela ojediněle (45). V případě, že je mikroskopický nález nejasný nebo neodpovídá klinické prezentací (například obraz obrovskobuněčné MK u pacienta s mírným průběhem onemocnění) je doporučován termín lymfohistiocytární MK s obrovskými buňkami (37).

Granulomatózní myokarditida

Granulomatózní MK definuje přítomnost epiteloidních granulomů. Z etiologického hlediska se v drtivé většině případů jedná o sarkoidózu, čemuž odpovídá i morfologie granulomů, které jsou kompaktní, okrouhlé, bez nekrózy, často doprovázené extenzivní fibrotizací. Napomoct může i nález asteroidních či Schaumannových inkluzí, jejich přítomnost však není 100% patognomická. Granulomy většinou zastihneme v komorovém septu a volné stěně levé komory. Z toho důvodu má standardní EMB z pravé komory zpravidla malou výtěžnost (2,39,40,46). Jak již bylo zmíněno výše, přítomnost granulomů není pro diagnózu sarkoidózy srdce podmínkou a často zastihneme pouze izolované mnohojaderné buňky. V případě nálezu granulomů je zapotřebí zvážit i tuberkulózní či mykotickou etiologii, která mívá na rozdíl od jiných orgánů málokdy nekrotizující charakter. Jakýkoliv záchyt granulomu v srdci by tak měl vést k cílenému vyloučení těchto agens barvením Ziehl-Nielsen nebo PAS (8,44). Napomůže i klinické zasazení, mnohdy jde o imunokompromitované pacienty s extrakardiálním postižením, zpravidla plicním (46).

Eozinofilní myokarditida

Diagnóza eozinofilní MK nebývá obtížná díky obvykle dobře patrné eozinofilní zánětlivé celulizaci, která tvoří výhradní nebo minimálně značně převažující složku zánětu. Eozinofily jako minoritní komponenta jsou naopak necharakteristický nález, který může doprovázet i jiné typy MK (47,48). Mírnější eozinofilní zánět s jen minimálním doprovodným poškozením kardiomyocytů zpravidla svědčí pro hypersenzitivní MK, většinou léky indukovanou (zejména antibiotika, diuretika, psychofarmaka) (15,31). Denzní eozinofilní zánět s extenzivním myokardiálním poškozením pak odpovídá nekrotizující eozinofilní MK, která obvykle přichází v rámci některých ze syndromů spojených se systémovou eozinofilií, jako např. primární hypereozinofilní syndrom nebo léky indukovaná systémová eozinofilie (tzv. DRESS syndrom - drug rash with eosinophilia and systemic symptoms), popřípadě koexistuje s postižením endokardu jako Löfflerova endomyokarditida (47-52).

Neutrofilní myokarditida

Predominance neutrofilů je charakteristická pro neutrofilní myokarditidu. Většinou značí bakteriální infekci a objevuje se v rámci diseminované bakterémie nebo sepse, proto se s tímto obrazem často setkáváme při pitvě. Někdy můžeme pozorovat i drobné mikroabscesy. Objemné intramurální abscesy přicházejí spíše jako komplikace bakteriální endokarditidy (9,31,35,36).

Hojící se a zhojená myokarditida

Ve fázi hojení se začínají stírat původní histopatologické vzorce a jsou nahrazovány směsnou zánětlivou celulizací s účastí neutrofilů, lymfocytů, eozinofilů a početnějších makrofágů. Právě takovýto směsný obraz by měl vést k úvaze o subakutním charakteru onemocnění. Často bývají přítomny i okrsky granulační tkáně nebo fibrotizace. Jizvení bývá nepravidelné, mnohdy obkružuje reziduální kardiomyocyty a postrádá perivaskulární či subendokardiální distribuci typickou pro ischemické poškození. Subepikardiálně lokalizované jizvení pak při klinickém vyloučení embolizace do periferních větví koronárních arterií téměř vždy znamená zhojenou myokarditidu (37,53).

Myokardiální vaskulitida

Myokardiální vaskulitida přichází obvykle v rámci systémových autoimunitních onemocnění typu revmatoidní artritidy či lupus erythematodes nebo jako součást systémových vaskulitid. Častější bývá i u uživatelů kokainu. Z morfologického pohledu jde o intramyokardiální kapilaritidu, která mikroskopicky imponuje jako delikátní difúzní síťovitý lymfocytární zánět v intersticiu, obvykle bez doprovodné destrukce kardiomyocytů. Obraz tak může věrně imitovat borderline MK, ta však prakticky nikdy nemívá difúzní charakter (37).

ZÁVĚR

Histopatologický nález zánětlivého infiltrátu spolu s myocytárním poškozením je nejspolehlivějším průkazem MK. Jelikož etiologie MK zůstává na klinické úrovni mnohdy neobjasněna, a naopak složení zánětlivého infiltrátu ovlivňuje terapeutický postup, má jeho záchyt přímý vliv na prognózu pacienta. Změny v diagnostických kritériích spolu se zavedením imunohistochemie bezpochyby přispěly k vyšší záchytnosti MK v EMB. Výsledky však stále nejsou optimální a procento falešně negativních výsledků je stále vysoké. Úzká spolupráce patologa s klinickým lékařem je zde, stejně jako v jiných odvětvích nenádorové patologie, naprosto stěžejní.

PROHLÁŠENÍ

Autor práce prohlašuje, že v souvislosti s tématem, vznikem a publikací tohoto článku není ve střetu zájmů a vznik ani publikace článku nebyly podpořeny žádnou farmaceutickou firmou.

Práce byla podpořena MZ ČR – RVO, FN v Motole 00064203.

MUDr. Ondřej Fabián

Ústav patologie a molekulární medicíny 2. LF UK a FN Motol

V Úvalu 84

150 06, Praha 5

tel.: +420 224 435 645

e-mail: Ondrej.Fabian2@fnmotol.cz