Kontaminace léčiv nitrosaminy, staronový problém

Souhrn

Přehledový článek se zabývá problematikou nitrosaminů jako nečistot v léčivech. Léčivé přípravky kontaminované nitrosaminem vyvolávají oprávněné obavy týkající se bezpečnosti těchto léčiv. Nitrosaminy jsou prokázanými kancerogeny a mutageny. Z léčiv se jedná o valsartan a další blokátory receptorů pro angiotensin II obsahující tetrazol, ale dále o ranitidin, nizatidin, pioglitazon, metformin, rifampicin, rifabutin, vareniklin a další léčiva, z nichž některá již byla z klinické praxe stažena. Detekce nadlimitních nečistot ve farmaceutických substancích pak vede k výpadkům ve výrobě a nedostatku některých léčiv v praxi. Příslušný amin za vhodných podmínek reaguje s nitrosačním činidlem, tedy prakticky v kterékoli fázi syntézy farmaceutické substance, a nečistoty typu nitrosaminů tak mohou vznikat po celou dobu životnosti hotového léčivého přípravku. Regulační orgány pro léčiva po celém světě stanovily přísné pokyny pro zjišťování kontaminace nitrosaminy pro všechny léčivé přípravky.

Klíčová slova:

nitrosaminy – výroba farmaceutických substancí – kontaminanty.

Úvod

Nitrosaminy jsou sloučeniny vznikající v kyselém prostředí reakcí dusitanů a primárních, sekundárních, terciárních či kvartérních aminů (viz Obr. 1). Byly poprvé popsány v 70. letech 19. století Otto Wittem (1). Nitrosaminům dlouho nebyla věnována dostatečná pozornost. To se změnilo v roce 1956, kdy Magee a Barnes publikovali zprávu o karcinogenním potenciálu N-nitrosodimethylaminu (NDMA), který vyvolával zhoubné primární jaterní nádory u potkanů (2). Později bylo prokázáno, že po delší expozici nitrosaminům dochází k nádorovým onemocněním žaludku, jater a plic rovněž u lidí. Vedle karcinogenicity byla u nitrosaminů odhalena i jejich genotoxicita, projevující se alkylací nukleových bazí (3).

Tak jak se zvyšovala citlivost analytických metod, byly postupně odhalovány v našem životním prostředí další nitrosaminy, tj. především v potravinách (především uzeniny a konzervované masné výrobky s obsahem nitrátů a nitritů), v pitné vodě (např. po dezinfekci chloraminem), v kosmetických přípravcích, v tabákovém kouři (nitrosaminy zde vznikají při sušení a fermentaci tabáku), a rovněž v léčivech. Zdrojem nitrosaminů ve farmaceutické výrobě mohou být nevhodné syntetické postupy, popř. i některé reaktivní sloučeniny či meziprodukty, používané při výrobě farmaceutických substancí, jako jsou azidy, dále některé katalyzátory, nekvalitní rozpouštědla, popř. nevhodné látky používané k čištění výrobních linek (4).

V současné době jsou nitrosaminy klasifikovány směrnicí Evropské lékové agentury (European Medicines Agency, EMA) ICH M7(R1) jako nečistoty třídy 1 nebo jako „známé mutagenní karcinogeny“. Tato směrnice slouží ke standardizování postupu, který lze použít pro identifikaci, kategorizaci, kvalifikaci a ke kontrole mutagenního znečištění za účelem omezení potenciálního karcinogenního rizika (5).

EMA a americká léková agentura (Food and Drug Agency, FDA) v únoru 2021 zveřejnily seznam nejčastějších nitrosaminů, které se mohou vyskytovat v léčivech jako nečistoty (Tab. 1). Na tento seznam postupně přibývají další a další nitrosaminy (6).

Nitrosaminy a léčiva

Starší čtenáři si jistě vzpomenou na příběh aminofenazonu. Analgetikum a antipyretikum aminofenazon byl syntetizován Friedrichem Stolzem a Ludwigem Knorrem koncem 19. století a od roku 1897 prodáván společností Hoechst AG jako lék proti horečce Pyramidon® až do jeho konečného nahrazení bezpečnějším propyfenazonem. Problematická dimethylaminoskupina se z aminofenazonu uvolňuje neenzymatickou hydrolýzou a reaguje s dusitany (viz výše) za vzniku nitrosodimethylaminu. Kvůli riziku vzniku agranulocytózy, útlumu kostní dřeně způsobenému právě nitrosaminy, byl aminofenazon stažen z praxe v roce 1977 a v praxi byl poté nahrazen izosterem propyfenazonem (viz Obr. 2) (7). Další léčivo ze skupiny pyrazolonů metamizol (syntetizován 1920) představuje v mnoha částech světa neopioidní analgetikum první linie, ale v některých zemích (např. Velká Británie, Švédsko, Japonsko a Austrálie) není registrován kvůli riziku vzniku agranulocytózy, vzácného, ale potenciálně smrtelného nežádoucího účinku. O skutečném výskytu metamizolem indukované agranulocytózy se stále diskutuje, rozsáhlá studie odhaduje riziko její incidence na méně než 1 : 1 000 000 za rok. Rovněž z hlediska tvorby nitrosaminů představuje metamizol výrazně nižší riziko než aminofenazon, potenciálním zdrojem tvorby nitrosaminů může být až jeden z metabolitů metamizolu (8).

Další negativní jevy spojené s nitrosaminy v léčivech byly publikovány poměrně nedávno. V červnu 2018 byly zaznamenány první detekce N-nitrosodimethylaminu (NDMA) ve valsartanu, popř. v dalších sartanech, což se v praxi projevilo jako výpadky v dodávkách léčiv s obsahem těchto sartanů. Typickými zástupci jsou právě antihypertenziva typu blokátorů angiotensinového receptoru ze skupiny sartanů, obsahující tetrazolové uspořádání (losartan, valsartan, irbesartan, kandesartan, olmesartan). Výše zmíněné azidy se používají při syntéze léčiv s obsahem tetrazolového kruhu (viz Obr. 3) (9).

Všichni máme v živé paměti celosvětový zákaz ranitidinu (a nizatidinu) z r. 2019. Příběh ranitidinu sahá do konce 70. let, kdy James Whyte Black objevil H-2 antihistaminikum cimetidin. Od r. 1976 se derivát imidazolu cimetidin stal prvním v praxi používaným H-2 antihistaminikem a odstartoval éru tzv. blockbusterů ve farmacii, kdy se v r. 1983 stal nejprodávanějším léčivem s tržbami překračujícími 1 miliardu dolarů. V r. 1988 za objev antihypertenziva propranololu a zmíněného cimetidinu J. W. Black obdržel Nobelovu cenu za medicínu. Bohužel záhy bylo zjištěno, že se cimetidin váže na receptory pro androgeny, a má nežádoucí antiandrogenní účinek. Cimetidin byl nahrazen ranitidinem, u něhož antiandrogenní účinky nebyly zjištěny. Bazický imidazol byl v molekule ranitidinu nahrazen nebazickým furanem. Potřebná bazicita molekuly (mj. pro tvorbu ve vodě rozpustné soli) tak musela být zajištěna zavedením dimethylaminu do postranního řetězce. Význam H-2 antihistaminik postupně klesal, jejich úlohu převzaly inhibitory protonové pumpy, a to zejména po r. 2001, kdy vypršela patentová ochrana omeprazolu. Ranitidin byl však v praxi široce používán v letech 1980 až 2020. V r. 2020 byly přípravky s obsahem ranitidinu v Evropě i USA staženy z praxe na základě zjištění z r. 2019, že se z ranitidinu intramolekulárně uvolňuje N-nitrosodimethylamin (NDMA), sloučenina s prokázanými kancerogenními vlastnostmi (kolorektální karcinom). Dlouhodobé užívání ranitidinu je spojeno i s vyšší pravděpodobností rozvoje rakoviny jater ve srovnání s kontrolními skupinami famotidinu nebo inhibitorů protonové pumpy (10). Thiazolový analog (me-too drug) nizatidin byl patentován v roce 1980 a zaveden do praxe v roce 1988. Byl rovněž celosvětově stažen v r. 2020 (Obr. 4) (11, 12).

Postupně byly nitrosaminy v nadlimitních hodnotách detekovány i u dalších léčiv. Příkladem je thiazolidindionové antidiabetikum pioglitazon používané při léčbě diabetu 2. typu. V lednu 2019 byla u některých šarží pioglitazonu nahlášena přítomnost NDMA. Příčinou bylo použití dusitanů a dalších nitrosačních činidel při výrobě farmaceutické substance a rovněž použití rozpouštědel (např. dimethylformamidu) kontaminovaných NDMA (13). Problém s nitrosaminy nastal i u dalšího antidiabetika. Jedná se o velmi jednoduchou molekulu metforminu. Protože biguanidové perorální antidiabetikum metformin je relativně stabilní, pro přeměnu na NDMA vyžaduje kritické koexistující vnější faktory, jako jsou nitrosační činidla, vlhkost a teplo. NDMA vzniká během výrobního procesu během mokré granulace a je iniciován nadměrným teplem při procesu sušení farmaceutické substance (14). V roce 2020 byly publikovány kontaminace nitrosaminy antituberkulotických léčiv ze skupiny ansamycinů rifampicinu a rifabutinu. Detekované nitrosaminy (NMP a CPNP) pocházejí z procesu syntézy obou léčiv (15). V roce 2021 byla zaznamenána zvýšená přítomnost dalšího nitrosaminu, N-nitroso-vareniklinu, v přípravku obsahující vareniklin, což je léčivo určené pro odvykání kouření. Tato skutečnost vedla nakonec k dočasnému přerušení výroby a k výpadkům v dodávkách léčiv s obsahem vareniklinu (16).

Lze konstatovat, že v současnosti narůstají počty nově detekovaných nitrosaminů v léčivech geometrickou řadou. Prakticky u každého léčiva s potřebnými strukturními předpoklady (především s aminoskupinou) byl v poslední době zaznamenán jeho nitrosovaný derivát jako nečistota (Nitrosamine Drug Substance-Related Dirts, NDSRIs).

Diskuze

Nečistoty původně nalezené v léčivých přípravcích od roku 2018 byly jednoduché nitrosaminové sloučeniny, jako jsou NDMA a NDEA. Ty se mohou vyskytnout zejména při výrobě účinných látek a obvykle je lze eliminovat změnami ve výrobním procesu. V průběhu dalších analýz byly identifikovány složitější sloučeniny typu nitrosaminů (NDSRIs) jak v hotových léčivých přípravcích, tak ve farmaceutických substancích (Active Pharmaceutical Ingredient, API). Existuje řada potenciálních příčin vzniku těchto nečistot. Mohou vznikat při výrobě nebo následném skladování léčivých přípravků, například když API reagují se stopovými dusitany v pomocných látkách. Jaké jsou hlavní příčiny kontaminace léčivých přípravků nitrosaminy? Tyto příčiny můžeme klasifikovat takto:

• Výroba farmaceutických substancí
  • Nitrosační činidla, včetně dusitanu sodného, kyseliny dusité, anhydridu kyseliny dusné a nitrosylhalogenidů, mohou pocházet z recyklovaných rozpouštědel nebo opětovně použitých katalyzátorů z různých procesů nebo napříč výrobními linkami s nedostatečnou kontrolou a nevhodným monitorováním.
  • Specifické reakční podmínky v přítomnosti určitých surovin a výchozích sloučenin.
  • Kontaminované suroviny, recyklovaná rozpouštědla (dimethylformamid).
  • Nesprávná optimalizace výrobních procesů pro API, tj. nevhodné nebo špatně kontrolované reakční podmínky z hlediska teploty, pH nebo pořadí, v jakém jsou činidla, meziprodukty nebo rozpouštědla přidávány, může také vést k tvorbě nitrosaminových nečistot.
• Výroba léčivých přípravků
  • Nestabilita API vůči zevním faktorům (zvýšená teplota, vlhkost, kyselé prostředí, délka skladování).
  • Další příčinou může být nevhodně zvolená metoda čištění výrobních linek. NDMA je vedlejším produktem ozonizace a chloraminace.
  • Rizika během výroby a adjustace léčivého přípravku, např. reakce sekundárních aminů v tiskařských barvách s určitými nitrocelulózovými laky nebo potahovými materiály při zahřátí.
  • Nitrosaminy vznikající při výrobě léčivého přípravku je téměř nemožné z léčivého přípravku odstranit, na rozdíl od situace při výrobě API s více fázemi syntézy a s následnými purifikačními kroky.
  • V létě 2023 upravily lékové autority (EMA či FDA) své pokyny pro eliminaci nečistot typu nitrosaminů v léčivých přípravcích. Tyto pokyny zavádějí model hodnocení rizik založený na chemických strukturních vlastnostech (Carcinogenic Potency Categorization Approach, CPCA), aktualizují přijatelné dávky (Acceptable Intake, AI) nitrosaminů v léčivých přípravcích. Do té doby používaná standardní zkouška mutagenity (Amesova zkouška) byla rozšířena s cílem dále zlepšit citlivost předchozí metody a přizpůsobit ji vlastnostem určitých nitrosaminů a je také popsána ve zmíněných pokynech jako vylepšený Amesův test (Enhanced Ames Test, EAT). Účelem je stanovení přípustného příjmu nitrosaminů, u kterých dosud nebyl definován (17, 18).

Analytické metody

Z analytického hlediska představují nitrosaminy poměrně složitý problém, vyžadují velmi citlivé metody s vysokou specificitou. Analýza se potýká s tím, že se jedná o hodně malé molekuly, může docházet k falešně pozitivním výsledkům v přítomnosti jiných nečistot (dimethylformamid), vzorky API mohou být nestabilní při vyšší teplotě a uvolňovat N-nitrosamin (ranitidin při analýze plynovou chromatografií) (19) a k tomu všemu se jedná o stopovou analýzu v jednotkách ppb (miliardtin) nebo i nižších. Vhodné metody je tedy nutné hledat mezi těmi nejlepšími, co má farmaceutická analýza k dispozici. Evropský lékopis (potažmo i Český lékopis) reaguje na potřebu zkoušení nitrosaminů a v roce 2022 zavedl kapitolu 2-5-42 N-nitrosaminy v léčivých látkách, kde je popsána analýza 7 nitrosaminů v 5 API ze skupiny sartanů. 3 lékopisné metody využívají kapalinovou chromatografii s hmotnostní detekcí s trojitým kvadrupólem nebo plynovou chromatografii opět s hmotnostní detekcí s jednoduchým nebo trojitým kvadrupólem. Častý lékopisný limit pro příbuzné látky bývá 0,1 % (tj. 1 mg nečistoty v 1 g API). Limit pro nitrosaminy u sartanů je 30 ppb (tj. leží více než 33 000× níže, tj. 1 mg nečistoty v 33 kg API). Obdobné statě najdeme i v United States Pharmacopeia.

Amesův test

Roku 1973 Bruce Ames a jeho spolupracovníci na University of California v Berkeley navrhli test pro detekci mutageneze indukované chemikáliemi (20) a dále jako screennig genotoxicity, tedy zda má studovaná látka potenciál indukovat poškození DNA (21). Amesův test je stále jedním z nejčastěji používaných krátkodobých testů pro testování mutagenity chemických sloučenin, a tedy i léčiv.

Závěr

Přítomnost nitrosaminů v léčivech či uvolňování nitrosaminů z léčiv je pro pacienty závažným rizikovým faktorem zejm. z hlediska vzniku nádorových onemocnění. Je nezbytné zajistit, aby výrobci a příslušné orgány usilovali o zavedení co nejpřísnější kontroly přítomnosti nitrosaminů v léčivech a zároveň minimalizovali možnosti jejich výskytu jak během jejich výroby, tak v hotovém léčivém přípravku. Bylo navrženo a zavedeno několik preventivních opatření pro predikci a řízení podezření na kontaminaci nitrosaminy nebo potenciálními mutagenními nečistotami ve farmacii. Kontrola kvality léčiv v průběhu výrobních procesů samotnými výrobci je nezbytná pro sledování a snižování rizik potenciální tvorby nečistot, aby se předcházelo pozdějšímu finančně nákladnému stahování léků z trhu. Na druhé straně je však důležité si uvědomit, že případné stažení léčivého přípravku z trhu je signálem, že „systém funguje“ a že dříve neidentifikované a neobjevené zdroje kontaminace, jako jsou nitrosaminy, jsou nyní detekovány a z klinické praxe včas eliminovány, což pomáhá vylepšovat bezpečnost farmakoterapie. Bezpečnost pacientů je prvořadou prioritou, farmaceutický průmysl a regulační orgány musí zajistit, aby léky byly nejen účinné, ale i bezpečné.