Guidelines EAU pro léčbu mužské infertility
14. Kryoprezervace ejakulátu

13. Poruchy ejakulace

14. Kryoprezervace ejakulátu

14.1 Definice

Kryoprezervace znamená skladování biologického materiálu při teplotách hluboko pod nulou, např. –80 °C nebo –196 °C (bod varu tekutého dusíku). Při těchto níz­kých teplotách dochází ke zpomalení nebo přerušení biochemických procesů bu­něč­ného metabolizmu, při teplotě –196 °C jsou biochemické reakce způsobující buněčnou smrt úplně zastaveny.

14.2 Úvod

Kryoprezervaci poprvé použili zvěrolékaři ve 40. letech minulého století a v 50. le­tech byla tato metoda přizpůsobena pro skladování lidských spermií. V roce 1954 bylo dosaženo prvního těhotenství s po­uži­tím kryoprezervované spermie [1]. V dnešní praxi zahrnují klinické indikace pro kryo­prezervaci uchovávání spermií, testiku­lární tkáně a tkáně vaječníků a časných embryí.

14.3 Indikace pro uchovávání spermií

Možnost skladování spermií je dostupná na mnoha klinikách a používá se v následujících případech:

• Před chemoterapií či radioterapií při léčbě karcinomu [2] nebo benigního onemocnění, která může způsobit steri­lizaci pacienta.
• Před operací, která může ovlivnit fertilitu (např. operace hrdla močového měchýře u mladších mužů nebo odstranění druhého varlete u mužů s maligním onemocněním varlete, před vazektomií).
• U mužů s progresivním zhoršováním kvality ejakulátu, které je způsobeno onemocněním spojeným s rizikem ná­sled­ného vzniku azoospermie (tj. hypofyzární makroadenomy, kraniofaryngiomy, syndrom prázdného sedla, chro­nické nefropatie, nekontrolovaný diabetes mellitus, roztroušená skleróza).
• U paraplegiků, u nichž byly spermie získány pomocí elektroejakulace nebo penilní vibrostimulace.
• U mužů s psychogenní anejakulací, u nichž byly spermie získány pomocí elektro­ejakulace či metodou odběru spermií.
• Poté co aplikace gonadotropinu u mužů s hypogonadotropním hypogonadizmem způsobí navození spermatogeneze.
• U mužů s NOA (pravděpodobnost nalezení spermií při TESE je přibližně 60–70 %), kryoprezervaci lze užít pro oddělené uchování spermií získaných při ICSI, což zabrání zbytečné hypersti-mulaci partnerky. Kryoprezervace také umožňuje předejít opakovanému prová­dění procedur odběru spermií.
• V jakémkoli případě nálezu spermií při odběru spermií, např. pokud selže zrušení vazektomie nebo v některých případech epididymální obstrukce, kte­rou nelze léčit pomocí operace.
• Pro uchování spermií od dárce – kryo­prez­ervace a 3–6měsíční karanténa snižují riziko přenosu infekce ze spermií od dárce, ve většině zemí se již čerstvé spermie neužívají.

14.4 Preventivní opatření a techniky

14.4.1 Proces zmrazení a rozmrazení

V dnešní době dostupné kryoprezervační techniky nejsou optimální, neboť při kryo­prezervaci a dlouhodobém skladování dochází k poškození buněk. K poškození dochází nejčastěji během zamrazovací a rozmrazovací fáze. Hlavní příčinou po­ško­zení během zamrazování je vznik ledových krystalů a dehydratace buněk způsobující narušení buněčné stěny a nitrobuněčných organel. Po rozmrazení dochází k významnému zhoršení morfologie, motility i vitality spermií a kryoprezervace zvyšuje i riziko poškození DNA spermií [3–6]. K dalšímu poškození může dojít při kontaminaci vzorků mikroorganizmy a při vyšší koncentraci superoxidových radikálů [7,8]. Pro omezení tvorby ledo­vých krystalů se před zmrazením přidává kryoprezervační roztok. Pro komerční účely jsou k dispozici různé druhy roztoků, z nichž většina obsahuje různý podíl gly­cerolu a albuminu. Po zmrazení je tkáň ponořena do tekutého dusíku.

Pro minimalizaci rizika poškození při zamrazování a rozmrazování byly vyvinuty nejrůznější techniky:

• Rychlá metoda [9,10]: Vzorek je před ponořením do tekutého dusíku pone­chán 10 min ve fázi vypařování.
• Pomalá metoda [11]: Vzorek je ve vypařovací fázi postupně ochlazován po dobu 40 min pomocí programovatelného automatického zamrazovacího zařízení, které je nastaveno na rychlost ochlazování 1–10 °C/min.

Dostupné metody závisí na laboratorním vybavení. Ať již užíváme jakoukoli zamrazovací techniku, je třeba ji testovat na dárcovských spermiích a vyšetřením po rozmrazovací fázi. Dále je třeba pravidelně provádět kontrolní testování. Pravděpo­dob­nost přežití spermií se snižuje spolu s prodlužující se dobou jejich skladování a spolu s opakováním zamrazovací--rozmrazovací fáze. Maximální doba pro skladování lidských spermií není známa, většina laboratoří a kontrolních komisí uvádí limit 10 let [12]. V některých případech však může být nutná delší doba skladování (např. u 17letého chlapce podstupujícího chemoterapii při léčbě testiku­lárního karcinomu).

14.4.2 Kryoprezervace velmi malého počtu spermií

Standardní kryoprezervace ve stéblech je účinný způsob uchování velkého počtu sper­mií, např. dárcovský inseminační program. MikroTESE však umožňuje získání pouze malého počtu spermií. V tomto případě je jednou možností zamrazení testikulární tkáně a získání spermií až po rozmrazení nebo zamrazení velmi malého počtu spermií. V případě, že jsou spermie zamrazeny ve stéblech, může být velmi obtížné je po rozmrazení nalézt. Lepším řešením je za­mrazení spermií ve formě pelet [13] nebo umístění spermií do kontejneru [14].

14.4.3 Testování na přítomnost infekce a prevence křížové kontaminace

Skladování spermií ve stéblech je často užívaná metoda. Velké množství stébel je uloženo v kanystrech; stébla jsou naložena v tekutém dusíku. Kontaminace tekutého dusíku mikroorganizmy způsobuje kontaminaci všech stébel. Nejrozšířenějším bezpečnostním opatřením je přijímání vzorků pouze od pacientů, jejichž ejakulát byl testován na přítomnost infekce. Dárcovské vzorky by měly být testovány na virové infekce (hepatitida B a C, HIV) a pohlavně přenosné infekce (Ch. tracho­matis, gonorea, syfilis).

Dokud nejsou známy výsledky testo­vání, je třeba vzorky uchovávat v samo­statné nádobě v karanténě [15] (http://www.hfea.gov.uk/docs/8th_Code_of_Practice(2).pdf) (datum přístupu prosinec 2011).

Některé laboratoře užívají další bez­peč­nostní pojistku v podobě dvojitého oba­lení stébel před zmrazením, tato metoda však představuje nadstandardní náklad a do­konce může ovlivnit proces zmrazení a snížit kvalitu vzorků po rozmrazení. V některých centrech se testuje také přítomnost cytomegalovirů (CMV) s možností odděleného skladování CMV-negativních a CMV-pozitivních vzorků.

Značný etický problém představuje skla­dování vzorků před chemoterapií u mužů, kteří jsou hepatitis- či HIV pozitivní. Jen málo klinik disponuje zařízením umožňujícím skladování HIV pozitivních vzorků. Účinnost antiretrovirových prepa­rátů však zvyšuje počet HIV pozitivních mužů, kteří si přejí uchovat sperma. Další problém představuje riziko přenosu HIV na děti počaté HIV pozitivními spermiemi, protože přibližně v 5 % případů může dojít k selhání technik proplachu spermií.

14.4.4 Preventivní opatření předcházející poškození skladovaného materiálu

Jakékoli laboratorní zařízení umožňující dlouhodobé skladování biologického ma­te­riálu by mělo disponovat metodami, které zabraňují nepředvídané ztrátě mate­riálu způsobené selháním skladovací nádoby. To platí zejména pro spermie u pacientů podstupujících sterilizující chemoterapii zhoubného nádoru, u nichž nebude možné získat žádné další spermie. Úroveň bezpečnostních opatření závisí na ceně a možnostech dané laboratoře. Pokud je to možné, doporučuje se dodržovat tato opatření:

• Všechny skladovací nádoby by měly být opatřeny poplašným systémem, který je aktivován v případě zvýšení teploty nebo úniku tekutého dusíku.
• Poplašný sytém by měl upozornit službu konajícího laboratorního pracovníka 24 hod denně, 365 dní v roce.
• V ideálním případě by měla laboratoř vlastnit prázdný kontejner, do něhož by bylo možné přesunout vzorky po selhání skladovací nádoby.

14.4.5 Vzorky „sirotci“

U pacientů s maligním onemocněním a v mnoha dalších situacích může před užitím skladovaných vzorků uplynout řada let. V průběhu této doby může majitel ně­kterého vzorku zemřít nebo ho nelze nijak kontaktovat. Majitel tak po sobě zane­chává tzv. sirotčí vzorky. Povinnost laboratoře a legální vlastnictví těchto vzorků může způsobovat značné potíže.

Nejlepším řešením je vyžádat si od vlastníka vzorku před nebo hned po uskladnění prohlášení, které stanoví, jak se vzorkem naložit v případě úmrtí nebo nedohledatelnosti pacienta. V některých zemích takové vyjádření ukládá zákon. Možnosti nakládaní vlastníka se vzorkem spermatu závisí na situaci a na právních normách daného státu, přičemž přicházejí v úvahu tyto možnosti:

• svolení ke zničení vzorku
• svolení k využití vzorku manželkou či partnerkou
• svolení k využití vzorku k výzkumným účelům
• svolení k poskytnutí vzorku jinému infertilnímu páru

14.5 Biologické aspekty

Kryoprezervace způsobuje zhoršení kvality spermií. Po rozmrazení se zhoršuje mot­i­lita [16] i morfologie [17] spermií, dochází k poškození mitochondriálních akrozomů a bičíku spermií [19]. Zmrazení spermií zhoršuje motilitu spermií o 31 %, aktivitu mitochondrií o 36 % a vede k porušení morfologie u 37 % spermií [9]. Motilita sou­visí se schopností rozmrazeného vzorku uplatnit se při IVF. Zlepšení lze dosáhnout výběrem subpopulace spermií s nejlepší motilitou a integritou DNA a jejich následným zmrazením v semenné plazmě [13].

14.6 Závěry a doporučení pro kryoprezervaci ejakulátu

Cílem kryoprezervace je zabezpečit mate­riál pro budoucí techniky asistované reprodukce.

Techniky kryoprezervace dnes nejsou ani zdaleka optimální, v budoucnosti bude nutné tyto metody vylepšit, a zvýšit tak úspěšnost uchovávání spermií.

Lékař by měl kryoprezervaci doporučit a důkladně objasnit pacientům se specifickým onemocněním před tím, než podstoupí operaci, chemoterapii nebo radio­terapii, která může narušit jejich reprodukční funkci.

V případě, že je indikována testikulární biopsie, doporučuje se současně provádět kryoprezervaci.

Kryoprezervaci ejakulátu je třeba nabídnout všem mužům, kteří jsou kandi­dáty na chemoterapii, ozařování či ope­rační intervenci, která může narušit spermatogenezi nebo vyvolat ejakulační poruchy (stupeň doporučení: B).

V případě, že kryoprezervace není do­stupná v bydlišti pacienta, doporučuje se před zahájením terapie navštívit nejbližší centrum, které kryoprezervaci zajišťuje (stu­peň doporučení: C).

Souhlas s kryoprezervací by měl zahrnovat i pacientovu instrukci, jak se vzorkem nakládat po jeho úmrtí nebo v případě, že jej nelze nijak kontaktovat (stupeň doporučení: C).

Je třeba dodržovat bezpečnostní opa­tření zabraňující přenosu virové, sexuálně přenosné či jiné infekce skladovaného materiálu z dárce na příjemce a kontaminaci uchovaných vzorků. Tato opatření zahrnují testování pacienta, užívání rychlých metod testování a karanténu vzorků do doby, než jsou známy výsledky testů. Vzorky mužů pozitivních na HIV a hepatitidu by měly být skladovány v jiné nádobě než vzorky mužů bez prokázané infekce (stupeň doporučení: C).

15. Zkratky užité v textu