Neinvazivní RHD genotypizace plodu na DNAizolované z periferní krve RhD negativníchtěhotných žen

English info

Non-invasive fetalRHD genotyping on DNA isolated from maternal plasmain RhD negative pregnancies

In this prospective study, we assessed the feasibility of fetal RHD genotyping by analysis of DNAextracted from maternal plasma samples collected from RhD negative pregnant women using RQ-PCRand primers and probes targeted toward exon 7 and exon 10 of RHD gene.We analysed 46 samples from39 RhD negative pregnant women including 5 sensitised (1x anti-D, 2x anti-D and anti-C, 2x non-specificantibodies in enzymatic assay) and correlated the results with serological analysis of cord blood afterthe delivery. Non-invasive prenatal fetal RHD exon 7 genotyping analysis of maternal plasma sampleswas in complete concordance with the analysis of cord blood in all 20 RhD negative pregnant womendelivering 12RhDpositive and8RhDnegativenewbornsuntilnow.RHDexon 10 specificPCRampliconswere not detected in 2 out of 12 studied plasma samples from women bearing RhDpositive fetus, despitethe positive amplification in RHD exon 7 region observed in all cases. We supposed that false negativeresults might be caused by a partly deletion or aberrant structure of the 3´ untranslated exon 10 regionof RHD gene where specific primers and probe should anneal. The specificity of both RHD exon 7 andexon 10 systems approached 100% since no RHD positive signals were detected in women currentlypregnant with RhD negative fetus (n = 8). Prediction of fetal Rhesus D status from maternal plasma ishighly accurate and enables implementation into clinical routine. We suggest that safe non-invasiveprenatal fetal RHD genotyping using maternal plasma should involve the amplification of at least twoRHD specific products. Fetal RHD genotyping may allow the identification of fetuses at risk ofhaemolytic disease of newborn. However,we suggest to apply a non-invasive prenatal RHD genotyping assay in the routine testing of allRhDnegativewomen involving both sensitised as well as nonsensitizedpregnancies, which is the majority.

Key words:
fetal DNA, haemolytic disease of newborn, real-time PCR, maternal plasma, RHD gene

Autoři: I. Hromadníková ¹; L. Vechetová ¹; K. Veselá ¹; B. Benešová ³; J. Doucha ²; E. Linhartová ³; R. Vlk ²; E. Kulovaný ²
Působiště autorů: 2. dětská klinika, 2 Gynekologicko-porodnická klinika, 3 Krevní banka 12. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Fakultní nemocnice Motol, Praha ¹
Vyšlo v časopise: Transfuze Hematol. dnes,, 2003, No. 4, p. 152-158.
Kategorie: Články

Souhrn

Vtéto prospektivní studii shrnujeme naše zkušenosti se zavedením nové neinvazivní metody prenatálnídiagnostiky RHD genotypizace plodu z periferní krve těhotných žen s využitím PCR v reálném časea specifických primerů a TaqMan sond pro exon 7 a exon 10 RHD genu. Celkem jsme analyzovali 46vzorků od 39 RhD negativních těhotných žen (z toho 5 aloimunizovaných: 1x anti-D, 2x anti-D a anti-Ca 2x přítomnost nespecifických protilátek v enzymatickém testu). Výsledky neinvazivní prenatálníRHD genotypizace plodu provedené na DNA extrahované z periferní krve matek jsme korelovalis výsledky imunohematologické analýzy pupečníkové krve po porodu dítěte. Výsledky genotypizaceplodu v oblasti exonu 7 RHD genu byly ve shodě s vyšetřením pupečníku u všech těhotných žen, kterédoposud porodily (n = 20, z toho 12 RhD pozitivních a 8 RhD negativních dětí). V případě genotypizaceplodu v oblasti exonu 10 RHD genu jsme nedetekovali RhD pozitivitu plodu u 10 z 12 těhotenství.Předpokládáme, že tyto dva falešně negativní výsledky mohly být způsobeny částečnou delecí neboaberacemi RHD genu v 3´ netranslatované oblasti exonu 10, kde se specifické primery a TaqMan sondaváží k cílové DNA. Specificita metody pro oba RHD (exon 7 a exon 10) RQ-PCR systémy dosáhla 100 %,jelikož jsme v periferní krvi těhotných žen, které porodilyRhDnegativní děti (n = 8),nedetekovali žádnéRHD pozitivní amplifikační signály. Neinvazivní predikce RhD statutu plodu je rychlá a spolehliváa může být zahrnuta do rutinních vyšetření prenatální diagnostiky. Pro spolehlivou diagnostiku všakdoporučujeme, aby byla vždy prováděna amplifikace alespoň dvou různých oblastí RHD genu. NeinvazivníprenatálníRHD genotypizace plodu umožňuje identifikaci plodů v riziku hemolytického onemocnění.Doporučujeme, aby byl v průběhu těhotenství u každé RhD negativní ženy vyšetřen neinvazivněRHD genotyp plodu, nejlépe v I. nebo II. trimestru, a to i u nesenzibilizovaných těhotenství, kterých jevětšina.

Klíčová slova:
fetálníDNA,hemolytické onemocnění plodu, kvantitativníPCR v reálnémčase, mateřskáplazma, RHD gen

Plné znění tohoto článku není v digitalizované podobě.

V případě zájmu kontaktujte NTO ČLS JEP, které vám může poskytnout sken časopisu.