Protilátkové repetitorium

Listopadově-vánoční epidemie (bráníme se matoucímu označení první, druhá, třetí vlna) ještě zdaleka není u konce, počty lidí, kteří prodělali COVID-19, velmi rychle rostou, ale my jako bychom si nevšimli, že se v populaci během této doby naprosto dramaticky změnil poměr „k infekci náchylných“ a „ již odolných“ osob. Češi a Američané mají jedno z nejvyšších procentuálních zastoupení osob, které prodělaly COVID-19 (1). Zatímco v USA bylo zjištěno 7,7 % obyvatel s pozitivním testem PCR detekujícím SARS-CoV-2, v České republice to bylo 8,8 % obyvatel. Americké Centrum pro kontrolu a prevenci nemocí (CDC) doporučuje sledovat hladiny protilátek, protože si je vědomo toho, že mnoho pacientů s COVID-19 není podchyceno, protože nebyli testováni PCR vůbec nebo byl test falešně negativní (2). Oproti tomu v Česku se protilátkám proti koronaviru zatím věnuje jen minimální pozornost, doporučuje se zejména pro testování dárců rekonvalescentní plasmy (3) a výsledky těchto vyšetření se stále ještě neevidují. Pro laiky, ale i pro odbornou veřejnost je velmi obtížné zorientovat se v problematice stanovování protilátek a diagnostiky séroprevalence (tedy potvrzení onemocnění na základě výskytu specifických protilátek). V tomto repetitoriu se pokusíme odpovědět na nejčastější otázky a shrnout naše zkušenosti s vyšetřením protilátek, které jsou podložené daty z několika českých laboratoří.

Kdy stanovovat protilátky?

Pro potřebu „potvrzení prodělané infekce“ se doporučuje stanovovat IgG protilátky po pozitivním PCR/antigenním testu v odstupu minimálně 3 týdny (3,4). IgG protilátky se tvoří jako poslední (až po IgM a IgA izotypu), jsou nejspecifičtější a nejdéle v organismu přetrvávají. V infekční sérologii jsou považovány za důkaz proběhlé infekce. Ne u všech se tvoří stejně rychle. U starších osob pozorujeme, že stoupají po dlouhou dobu (dva i více měsíců), pak nějaký čas přetrvávají v přibližně stejné výši, později pozvolna klesají. V případě „Břevnické studie“ prováděné u skupiny seniorů s průměrným věkem 85 let (5), byly vysoké hladiny IgG protilátek zjištěny ještě 10 měsíců po prodělané infekci. U mladých dárců rekonvalescentní plasmy, kteří byli opakovaně vyšetřovaní v ostravské laboratoři, zůstávají protilátky detekovatelné po řadu měsíců ve stejné výši nebo dochází jen k mírnému poklesu jejich hladin (dosud nepublikováno).

Můžeme pomocí protilátek zjistit právě probíhající COVID, když PCR je negativní?

Pro průkaz akutně probíhající infekce se používá PCR a antigenní test. Pouze v případě, kdy máme pacienta se symptomy typickými pro COVID-19, ale opakovaně negativním PCR testem, a pochybujeme o diagnóze, můžeme nechat stanovit protilátky IgM nebo IgA izotypu nebo „celkový imunoglobulin“ ve druhém týdnu infekce. Nevýhodou těchto vyšetření však je nižší specificita, tedy riziko falešně pozitivního výsledku (protilátky nemusí být specifické k SARS-CoV-2, ale mohou zkříženě reagovat i protilátky vytvořené proti jiným koronavirům nebo jiným antigenům). Proto je vhodné vyšetření doplnit konfirmačním virus-neutralizačním testem (VNT) detekujícím specificky protilátky pouze proti viru SARS-CoV-2. Není-li VNT dostupný, pak je vhodné alespoň vyšetření protilátek běžnými metodami zopakovat a sledovat vzestup IgG (4).

Liší se protilátky proti S (spike) a proti N (nukleocapsid) proteinu?

Protilátky se liší tím, že reagují buď s více specifickým S proteinem nebo méně specifickým N proteinem. Zatímco struktura N proteinu je u SARS-CoV-2 a jiných běžných koronavirů hodně podobná, struktura S proteinu a jeho podjednotek S1, S2 a receptor binding domain (RBD) je pro SARS-CoV-2 specifická. Protilátky proti N proteinu jsou detekovány s vyšší senzitivitou, ale protilátky proti S proteinu, které jsou opravdu „protikovidové“, jsou specifičtější (3,6).

Jakou metodou vyšetřovat protilátky?

Protilátky je třeba vyšetřovat vždy v laboratoři, a to metodami chemiluminiscenčními (CLIA) nebo enzymoimunoanalytickými (ELISA, EIA) (3,6). V současnosti jsou na trhu dostupné kvalitní spolehlivé certifikované soupravy a už to není taková „džungle“ jako na jaře. Analyzátory umožňují vyšetřit velmi rychle stovky pacientů a vydávat výsledky v řádu desítek minut. Z prověřených metod máme dobré zkušenosti s metodami zahraničních výrobců Diasorin, Abbott, Roche, Beckman Coulter, Euroimmun, jejichž parametry spolehlivosti byly testovány i FDA (6), ale použitelné jsou i metody českých výrobců Testline, Vidia (1,3). Přehled testů včetně výrobci deklarovaných specificit a senzitivit a cutoff hodnot je uveden v tab. 1.

Tab. 1. Přehled nejčastějších metod používaných ke stanovení protilátek proti SARS-CoV-2. Specificity a senzitivity jsou uvedeny v dokumentech výrobců.

Bylo by vhodné (a zatím se tak neděje), aby u výsledkové zprávy pro pacienta (lékaře) nebo na webových stránkách laboratoře byla uvedena informace, jakým testem bylo vyšetření protilátek proti koronaviru provedeno, jaká je hodnota cut-off, jeho senzitivita a specificita. Proč je to důležité, vysvětlujeme např. v publikaci „Testování COVID-19 – co bychom měli mít na paměti“ (4). Jen hladina protilátek a závěr „pozitivní“ nebo „negativní“ je nedostačující informací pro správnou interpretaci výsledku.

Je ke stanovení protilátek možné použít rychlotesty?

S tzv. rychlotesty (neboli laterální imunodifúzí) máme velmi špatné zkušenosti a ustoupili jsme od jejich používání. Testy, které jsme měli k dispozici, nebyly kvalitní a velmi často je nebylo možné vyhodnotit, protože chyběl proužek v kontrolní zóně (7). Tyto testy mají velmi nízkou senzitivitu, a proto jsou výsledky často falešně negativní. Setkali jsme se ale i s falešně pozitivními výsledky, proto jsme na ně zanevřeli úplně. Přehled specificit a senzitivit rychlotestů, tak jak je zjistily nezávislé laboratoře, je uveden na stránkách FIND (8).

Pokud jsou protilátky pozitivní, znamená to, že má pacient ochranné (neutralizační) protilátky?

Pokud je výsledek protilátek IgG jen těsně vyšší než hodnota cut-off (tedy hraniční hodnota testu určená výrobcem), je vhodné vyšetření s odstupem 2 týdnů zopakovat. Po prodělaném onemocnění (v onom období přibližně 3–10 týdnů) by měla hladina IgG protilátek stoupat. Výrobci mají nastavené hranice pozitivity pomocí kalibrátoru (tzv. cut-off). Z našich zkušeností s „reinfekcemi“ vyplývá, že hodnoty IgG těsně nad hranicí mohou být falešně pozitivní, hodnoty cca nad dvojnásobkem cut-off již lze považovat za protektivní. V současné době připravujeme publikaci, ve které jsou tyto hodnoty protilátek, které již lze považovat za protektivní, spočítány na základě titrů neutralizačních protilátek stanovených VNT (virus neutralizačním) testem.

Co jsou neutralizační protilátky?

Neutralizační protilátky se váží na povrchové proteiny viru (S protein) a tím zalepí viru „klíč“ pro vstup do buňky. Ve virologické laboratoři sérum pacienta smícháme s živou virovou suspenzí a s buněčnou linií a společně tuto směs buněk kultivujeme několik dní (5). Pokud byly v séru neutralizační protilátky, pak buňky zůstanou živé, virus se nenamnoží a pacient je vůči infekci imunní (velmi pravděpodobně). Pokud však v séru neutralizační protilátky nebyly, virus buňky napadne, v nich se namnoží a buňky odumřou. Daný pacient tedy nemá ochranné protilátky a pravděpodobně není imunní. (Pozn. buněčnou imunitu pro tuto chvíli nechme stranou, protože ji neumíme rutinně prokázat).

Mám protilátky, mám se nechat očkovat?

Pokud (a) máte nebo jste měl pozitivní IgG protilátky, (b) prodělal jste COVID-19 s klinickými příznaky (zejména teplotou, ztrátou čichu / chuti), (c) měl jste pozitivní test PCR nebo antigenní test, (d) nakazil jste další osoby (i infekčnost je dobrý marker), pak předpokládáme, že váš imunitní systém moc dobře ví, jak na koronavirus při dalším kontaktu vyzrát a očkování není (zatím) třeba. Vakcinace není u lidí po COVID-19 kontraindikována, ale v období tří měsíců po prodělaném onemocnění se nedoporučuje (9). Je možné, že vaše imunita bude přetrvávat po řadu let, ale to ještě nejsme schopní určit. V této chvíli můžeme doporučit kontrolu hladiny protilátek za přibližně 3 měsíce a zvážit pozdější přeočkování podle individuální situace. Vakcín je málo a je především potřeba očkovat lidi v ohrožených skupinách, kteří dosud nemocní nebyli (9).

Jak dlouho budu imunní po prodělaném onemocnění?

V Česku byly potvrzeny protilátky nejdéle po deseti měsících od prodělané infekce. Senioři z „Břevnické studie“ (5), kteří byli nemocní v březnu a dubnu 2020, byli sledováni po celou dobu epidemie. Ani během podzimu a zimy 2020 neonemocněli. Autor studie má informace o tom, že v zařízení byl zachycen u dvou osob pravidelnými antigenními testy koronavirus, ale nedošlo k onemocnění dotyčných osob, ani k šíření nákazy mezi seniory nebo zdravotnickým personálem. V Plzni bylo zaznamenáno několik opakovaných infekcí u osob z původního souboru (7), ale v případě druhého výskytu byl průběh onemocnění mírný. V Gennetu (4) byl zaznamenán výskyt COVID-19 u dvou osob, které měly na jaře pozitivní pouze IgA protilátky a IgG bylo tehdy negativní nebo hraniční. Podzimní infekce koronavirem vyvolala klasický vzestup IgG i IgA protilátek. Tedy zatím se žádné překvapení neobjevilo.

Kolik lidí prodělalo infekci koronavirem v České republice?

Séroprevalenční studie, které se zaměřily na stanovení počtu lidí s protilátkami, se v Čechách provedly naposledy na jaře. V jihočeské séroprevalenční studii byla v květnu zjištěna pozitivita protilátek u 1,9 resp. 2,9 % dobrovolníků a vybraných profesních skupin v Písku a ve Strakonicích (10). Pokud bychom tehdy tyto výsledky zobecnili na celou jihočeskou populaci, zjistili bychom, že na jednu osobu PCR pozitivní připadalo přibližně 50 osob s protilátkami. V celé republice bylo tehdy asi 10 tisíc PCR pozitivních osob, poměr 1:50 by tedy znamenal, že už v květnu mohlo mít infekci za sebou až půl milionu osob!

V současnosti nemáme kapacitu tuto séroprevalenční studii zopakovat, což je velká škoda, protože nevíme, kolik lidí u nás infekci opravdu prodělalo. Můžeme to jen odhadovat. Víme, že téměř milion lidí mělo pozitivní PCR test, což je přibližně 10 % populace (1). CDC uvádí, že v USA, kde je situace podobná té v České republice, na jednu PCR pozitivní osobu (evidovaného pacienta) připadá 4,6 osob neevidovaných, z nichž většinu můžeme detekovat na základě vyšetření protilátek (11). Pokud by u nás byl tento poměr podobný, pak by v Česku již onemocnění prodělalo asi 50 % populace. Abychom tuto domněnku mohli potvrdit či vyvrátit, bylo by nutné provést séroprevalenční studii na reprezentativním vzorku obyvatelstva. To se bohužel nestalo, ale nějaká data přece jen máme. V laboratořích, kde se vyšetření protilátek provádí, ať už z indikace lékařů (imunologů, hematologů, infektologů) nebo pro samoplátce (jednotlivé zájemce nebo organizace), můžeme zjistit, jak roste každý měsíc podíl séropozitivních výsledků v závislosti na počtu nemocných s COVID-19 v populaci. Z výsledků vyšetření protilátek, které byly provedené v laboratořích v Gennetu, resp. ve Vidii jsme zjistili, že mezi zdravotníky, kteří se zde nechali otestovat v listopadu až lednu, mělo protilátky asi 30 % osob. Polovina pozitivních osob byla po prodělaném onemocnění, druhá polovina netušila, že infekci prodělala, protože byla bez příznaků.

Jak měřit a správně interpretovat výsledky vyšetření protilátek?

Protilátky je třeba stanovovat ve správný čas a kvalitním testem. Vhodné je stanovovat protilátky v prvním nebo druhém měsíci po prodělání onemocnění pro potvrzení „imunity“. Později protilátky mohou mizet. Při hodnocení výsledků se vždy ptejme „Zda a kdy byl pacient nemocný?“ a „Kdy a jak u něj byly stanoveny protilátky?“ Většina výsledků bude v souladu s našimi očekáváními.

V ojedinělých případech se může stát, že výsledek vyjde negativní, i když daná osoba měla jasné projevy COVID-19. Jedno z vysvětlení je, že imunitní systém reagoval tvorbou takových protilátek, které zrovna použitý test nezaznamenal (například vytvořil jen protilátky proti N proteinu, ale test detekuje protilátky proti S proteinu). Pak stojí za to vyšetření zopakovat pomocí jiného testu. Dále je dobré vědět, že zvlášť mladí lidé mají asymptomatický průběh nebo jen mírné potíže, aktivují proti koronaviru především buněčnou imunitu a při nižší virové náloži většina kontaktu imunitního systému s virem proběhne na sliznicích. Protilátek se tak nevytvoří dost a testy budou negativní. U těchto osob je vyšší riziko, že při kontaktu s vyšší virovou náloží, která už přes sliznice projde, onemocní a budou mít výraznější klinické projevy. Někdo nemusí protilátky vytvořit vůbec a to, že již infekci prodělal, poznáme jen díky aktivované buněčné imunitě. Tu sice ještě rutinně nestanovujeme, ale už se začínají objevovat první diagnostické sady, takže časem zvládneme i toto.

Objevují se zprávy o reinfekcích, proč k nim dochází?

Pokud reinfekci definujeme jako opakované onemocnění po styku se stejným virem, pak je třeba říct, že reinfekce jsou mimořádně vzácné (12). Při obrovských počtech nakažených je ale zákonité, že k nim tu a tam dojde. U této otázky se v našem autorském týmu objevila největší diskuse a vysvětlení předkládáme hned několik:

Vysvětlení první: Je třeba si uvědomit, že většina reportovaných reinfekcí jde patrně na vrub nesprávné interpretaci výsledku testů. Specificita PCR testování není stoprocentní. I kdyby bylo pouhé jedno procento pozitivních PCR testů falešně pozitivních, což považujeme za dolní odhad, znamenalo by to, že desítkám tisíc lidí vyšetřených v ČR v minulých měsících byl sdělen falešně pozitivní výsledek. V mnoha případech se tento falešně pozitivní výsledek navíc jistě časově setkal s klinickými projevy respiračního onemocnění, a proto bylo dané onemocnění označeno za kovid. Pokud se takový člověk později skutečně koronavirem nakazí, bude se to téměř jistě interpretovat jako reinfekce. Celá tato situace se může samozřejmě odehrát i v opačném pořadí – první infekce mohl být kovid a druhá bude mít falešně pozitivní PCR výsledek u respiračního onemocnění jiného typu. Pokud bychom znali skutečné parametry PCR testování v ČR – tedy přesnou sensitivitu, specificitu a předtestovou pravděpodobnost infekce – uměli bychom lépe odhadnout skutečný počet falešně pozitivních výsledků a mohli bychom správně odlišit tyto případy od skutečných reinfekcí. Tato čísla bohužel stále nejsou k dispozici.

Vysvětlení druhé: PCR mohlo být správně pozitivní, ale dotyčná osoba infekci neprodělala tak silnou, aby vytvořila dostatek protilátek a klinický projev byl u ní velmi mírný (ucpaný nos, anosmie). Tedy dotyčná osoba slabě onemocnění prodělala, ale má významné riziko, že pokud bude znovu nakažena, a to vyšší dávkou viru, onemocní „na neschopenku“.

Vysvětlení třetí: Ani vyšetření protilátek není stoprocentně specifické. “Reinfekce“ se může objevit u lidí s opakovaně hraničními IgG protilátkami, ale negativními IgA. Jev je možné vysvětlit přítomností zkříženě reagujících IgG protilátek. Takto někdy reagují vzorky sér u pacientů s EBV, CMV, chřipkou, autoimunitními onemocněními (např. s pozitivním revmatoidním faktorem). Záleží na typu použité soupravy. Po prodělané infekci koronavirem výrazně stoupnou IgG a objeví se i IgM a IgA protilátky.

Pozor si musíme také dát, zaznamenáme-li přítomnost pouze IgA nebo IgM bez pozitivních IgG. V tomto případě s časovým odstupem dvou týdnů vyšetření protilátek zopakujeme a nedojde-li k serokonverzi (tvorbě IgG), pak tato pozitivita neznamená prodělané onemocnění, ale falešnou pozitivitu.

Co říci na závěr? COVID-19 je z pohledu imunologa normální virová infekce, která ovšem může mít občas atypický průběh a která navíc postihla imunologicky naivní populaci. Vymýcení koronaviru není možné a nám nezbývá než se smířit s tím, že se tento nový koronavirus stane dalším členem široké rodiny virů, které stále žijí na našich sliznicích a jednou za čas nám znepříjemní život. Než si virus ochočíme (nebo si on ochočí nás) je třeba činit uvážlivá preventivní opatření, abychom příliš nezatížili zdravotní systém, ale abychom se postupně vrátili do normálního života. Rozhodovat bychom se měli na základě dat, a nikoliv dojmů, pocitů a senzačních zpráv. Pokud jsou mezi čtenáři pracovníci laboratoří ochotní přispět svými daty a poznatky, spojte se prosím s námi, ať máme těch kvalitních dat co nejvíce. Pak teprve budeme „Best in COVID“!

Kontakt:

zuzana.kratka@gennet.cz