Laureáti Nobelovy ceny

V roce 1968 získali Nobelovu cenu za fyziologii nebo medicínu tři američtí badatelé na poli genetiky – biochemici Robert William Holley, Har Gobind Khorana a Marshall Warren Nirenberg.

HAR GOBIND KHORANA (1922)

Uprostřed té části severoindického Paňdžábu, která je dnes pákistánskou provincií, leží nedaleko Khánewálu víska Rajpúr. Na počátku 20. století v ní žila stovka chudých analfabetů a mezi nimi gramotný patwárí (místní úředníček vedoucí soupis osetých ploch) Šrí Ganpat Ráj Khoráná se ženou Šrímat Krišnou Déví a pěti dětmi. Nejmladší z dětí Har Gobind se v Rajpúru narodil někdy kolem 9. ledna 1922, navštěvoval tu školičku pod korunou stromu a pak ve velikém paňdžábském městě Multánu střední školu s nezapomenutelným učitelem Ratanem Lálem. Chudý hoch si přitom přivydělával na tržišti předčítáním dopisů vesničanům. Díky vládnímu stipendiu vystudoval Har Gobind Khoráná (v anglickém přepisu Khorana) na Paňdžábské univerzitě v Láhauru chemii u přesného experimentátora Móhana Singha, v roce 1943 dosáhl bakalaureátu a v roce 1945 magisterského stupně, vždy s vyznamenáním.

Další indické vládní stipendium mu umožnilo studium organické chemie u otcovsky starostlivého Rogera J. S. Beera v anglickém Liverpoolu, zakončené doktorátem v roce 1948 za výzkum stavby bakteriálního pigmentu violaceinu, zatímco v jeho vlasti vznikla Néhrúova prozatímní vláda (1946), Indický národní kongres (1947), dvě britská dominia, která se hned spolu pustila do války (1947), a pak byl zavražděn Gándhí (1948). Khorana studoval v následujícím akademickém roce alkaloidy u Chorvata sarajevského původu Vladimira Preloga na slavné Eidgenossische technische Hochschule v Curychu, přečetl tam spoustu německé chemické literatury a objevil pro sebe dílo Fritze Zetscheho o karbodiimidech.

Po návratu z Evropy našel hinduista Har Gobind své rodiště už na území islámského Pákistánu, mnozí jeho přátelé uprchli do Indie a marně tam sháněli zaměstnání. Stejně se v Indii vedlo i jemu, naštěstí však získal stipendium pro Cambridgeskou univerzitu, kde v práci u průkopníka výzkumu nukleotidů Alexandra Robertuse Todda a v debatách s fyzikem i molekulárním biologem Francisem Crickem strávil 3 roky. V jediné společné publikaci s Toddem pak Khorana referuje, že nalezl fosforylační činidlo překonávající nesnáze syntézy oligonukleotidů (Studies on Phosphorylation. XI. The Reaction between Carbodiimides and Acid Esters of Phosphoric Acid. A New Method for the Preparation of Pyrophosphates. J Chem Soc 1953; 2257–2260; s Toddem).

V roce 1952 se Har Gobind oženil se Švýcarkou Esther Elisabeth Siblerovou, pozdější matkou jejich dvou dcer a syna a jeho celoživotní oporou, a na pozvání od Rady Britské Kolumbie pro výzkum přijal místo přednosty oddělení organické chemie na univerzitě ve Vancouveru se skrovným vybavením, zato se zárukou velké badatelské svobody. Jeho počátečním záměrem bylo užití karbodiimidů při syntéze nukleotidových koenzymů a příbuzných sloučenin. S Johnem G. Moffatem úspěšně syntetizoval acetylkoenzym A, čímž tuto pro metabolismus bílkovin, lipidů i sacharidů klíčovou sloučeninu, až dosud pracně a draze získávanou extrakcí z kvasnic, zlevnil a biochemickému výzkumu zpřístupnil (The Total Synthesis of Coenzym A. J Amer Chem Soc 1959; 81: 1265; s Moffatem).

V roce 1955 se Khorana seznámil s Ochoovým objevem enzymu polynukleotidfosforylázy a Kornbergovým průkopnickým výzkumem enzymatické syntézy DNA. Tyto pokroky podněcovaly i jeho k účasti na výzkumu nukleových kyselin jako klíče ke genetickému kódu. Se spolupracovníky syntetizoval všech 64 možných nukleotidových tripletů dvojité šroubovice DNA (permutace čtyř bází – adeninu, cytosinu, guaninu a thyminu). S ohlasem nedávné úspěšné syntézy acetylkoenzymu A mu tehdy do Vancouveru přicházelo i mnoho pracovních nabídek, on z nich v roce 1960 zvolil místo spolupřednosty Ústavu pro výzkum enzymů Wisconsinské univerzity v Madisonu a syntézu tripletů dokončil tam (Synthesis of Nucleotides, Nucleotide Coenzymes and Polynucleotides. Fed Proc 1960; 19: 931–941).

V roce 1961 odhalili Francis Crick a Sydney Brenner v Cambridgi existenci transferové RNA, zprostředkující syntézu bílkovin. Téhož roku oznámili biochemici z National Health Institutes v Bethesdě Marshall Warren Nirenberg a Johann Heinrich Matthaei, že vytvořili syntetickou messenger-RNA, jejíž vpravení do bakterie Escherichia coli způsobilo vždy fenylalaninový přírůstek v řetězci aminokyselin, a dále, že když syntetizovali polyribonukleotid z uracilových tripletů, vznikl řetězec polypeptidu sestávající pouze z fenylalaninu, z čehož usoudili, že fenylalanin je kódován uracilovým tripletem. Jejich pokusy prokázaly, že messenger-RNA přenáší z DNA genetickou informaci pro tvorbu specifických bílkovin.

Khorana, od roku 1962 profesor biochemie, od roku 1964 „Conrad A. Elvehjem professor“ biologických věd Wisconsinské univerzity a od roku 1966 americký občan, v těch letech se svou výzkumnou skupinou v Madisonu objevil, že genetický kód je do buňky přenášen vždy ve trojicích (kodonech), přičemž zjistil, že některé kodony tvorbu bílkovin spouštějí nebo zastavují, dále prokázal, že tři nukleotidy kódují vždy aminokyselinu a do roku 1966 určil příslušnou kombinaci nukleotidů pro každou ze 20 aminokyselin i pro množství „degenerovaných“ variant. Syntézou specifických polyribonukleotidů prokázal účast meziproduktu RNA v překladu sekvence nukleotidů v DNA do sekvence aminokyselin v bílkovině (Polynucleotide Synthesis and the Genetic Code. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1966; 31: 39–49; s Büchim a kol. – Idem. Harvey Lect 1966–1967; 62: 79–105).

V roce 1968 byl „za svůj výklad genetického kódu a jeho funkce v syntéze bílkovin“ (konkrétně za potvrzení Nirenbergových výsledků luštění genetického kódu pro fenylalanin, lysin a prolin a za zásluhu o konečné prolomení celého kódu pro syntézu bílkovin) vyznamenán třetinovým podílem na Nobelově ceně za fyziologii nebo medicínu. Dalšími podílníky pak byli zmíněný Nirenberg a Robert William Holley z Cornellovy univerzity (ten za izolaci a charakterizaci transferové RNA).

Na slavnostním shromáždění ve Stockholmu 10. prosince 1968 představil laureáty králi a Královské švédské akademii věd profesor Karolinského lékařsko-chirurgického institutu Peter Reichard. Úvodem připomněl zrození genetiky jako vědy v nadlouho zapomenutém poznání brněnského augustiniána Gregora Mendela z pokusů s křížením hrachu, že děděné znaky jsou určovány „elementy“ dědičnosti (1866), připomněl také izolaci „nukleinu“ z buněčných jader Švýcarem Friedrichem Miescherem (1868), aniž kdo souvislost mezi oběma objevy tušil, dále zmínil zásluhu Švéda Einara Hammarstena o probuzení vědeckého zájmu na počátku čtyřicátých let 20. století a průkaz Američana Oswalda Averyho, že nikoli bílkovina, nýbrž nukleová kyselina obsahuje genetickou informaci (1944), z čehož povstala molekulární biologie, jejíž výzkum je v roce 1968 Nobelovou cenou vyznamenáván už popáté od roku 1958. Reichard vystihl význam Nirenbergovy syntézy jednoduché nukleové kyseliny pro rozluštění prvního znaku genetického kódu (1961) i Nirenbergův a zejména Khoranův přinos pro konečné rozluštění celého genetického kódu v následujících letech, zatímco Holley objevil nukleovou kyselinu převádějící genetický kód do abecedy bílkovin, připravil ji v čisté formě a konečně v roce 1965 určil její přesnou chemickou stavbu – u biologicky aktivní nukleové kyseliny vůbec poprvé. Dne 12. prosince 1968 měl Khorana nobelovskou přednášku (Nucleic Acid Synthesis in the Study of the Genetic Code. Nobel Lectures, Physiology or Medicine 1963–1970. New York: American Elsevier 1973; 341–369).

Ani takový úspěch, jakým bylo rozluštění genetického kódu, neuhasil Khoranovu badatelskou ctižádost. Jeho příštím cílem byla syntéza celého genu. K tomu je ovšem třeba znát sekvenci párů jeho nukleotidových bází a ta byla tehdy známa u jediného genu díky Robertu Holleyovi. Už když tento segment kvasinkové DNA o 77 párech bází, kódující transferovou RNA pro inkorporaci alaninu do bílkoviny, představil Holley v roce 1965 jako první gen, který kdy byl sekvenován, Khorana se rozhodl syntetizovat jej. Náročnost úkolu si vynutila vynalezení zvláštní metodiky: nejprve tvořit segmenty dvojšroubovicové DNA o délce 8 až 12 párů bází, na každý z obou konců každého segmentu připojit přečnívající jednovláknovou sekvenci o délce čtyř nukleotidů, ve vodním prostředí a v přítomnosti spojovacího enzymu nechat tyto konce, aby se vzájemně našly a spojily a takto krok za krokem sestavit konečný polynukleotid. V červnu 1970 potom Khorana s příznačnou skromností na malém sympoziu biochemiků na Wisconsinské univerzitě oznámil, že se spolupracovníky syntetizoval první umělý kvasinkový gen (Studies on Polynucleotides. 103. Total Synthesis of the Structural Gene for an Alanine Transfer Ribonucleic Acid from Yeast. J Mol Biol 1972; 72: 209–217; s Agarwalem a kol.). Zároveň oznámil, že s většinou své výzkumné skupiny odejde na podzim do Massachusettského technologického institutu jako „Alfred P. Sloan Professor“ biologie a chemie (svému příteli pak vysvětloval: „Zůstaneš intelektuálně naživu déle, pokud každou chvíli měníš své prostředí“).

Ještě před odchodem z Wisconsinu zahájil Khorana práci na syntéze jiného, delšího genu, kódujícího montáž transferové RNA přenášející tyrozin v bakterii Escherichia coli. Gen byl izolován a popsán v cambridgeské laboratoři molekulární biologie Sidneyem Brennerem a Johnem Smithem, kteří vyslovili domněnku, že tento gen může „léčit“ geneticky defektního bacila, neschopného tvořit bílkoviny. Na rozdíl od kvasinkového genu skýtal tento gen naději na funkční průkaz, že konečný produkt není pouhou řadou inertních nukleotidů, nýbrž živým, fungujícím genem.

Následující desetiletí vyplnil Khorana pilnou prací na stavbě celé molekuly bakteriální DNA o délce 207 párů bází. Jeho metodika zahrnovala chemickou syntézu 26 deoxyribooligonukleotidových segmentů, polynukleotidligázou katalyzované spojení několika segmentů k tvorbě všech čtyř duplexů DNA s přiměřenými jednovláknovými konci a spojení duplexů k tvorbě celého komplexu DNA. V sérii 17 článků, z toho 12 v roce 1976 a 5 v roce 1979, popsal pak, pokaždé s dlouhou řadou spoluautorů, všechny postupné kroky té mravenčí práce od chemické syntézy deoxyribopolynukleotidových segmentů odpovídajících nukleotidovým sekvencím 1–31, 27–51, 47–78, 71–103, 100–126 přes polynukleotidligázou katalyzované spojení deoxyribopolynukleotidových segmentů k tvorbě duplexu DNA odpovídajícího nukleotidovým sekvencím 1–26, 23–60 a 23–66, 57–94, 86–126, enzymatické spojení k tvorbě duplexu celé DNA, syntézu duplexu DNA odpovídajícího sekvenci 23 nukleotidových jednotek při konci C-C-A, syntézu deoxyribopolynukleotidových segmentů odpovídajících nukleotidovým sekvencím 1–29 v oblasti promotoru, syntézu oligonukleotidových segmentů odpovídajících terminálním oblastem, syntézu oblasti promotoru, enzymatická spojení k tvorbě celé DNA o délce 207 párů bází a transkripci syntetického genu in vitro až k demonstraci supresorové aktivity transferové RNA in vivo, prokazující, že Khorana se spolupracovníky syntetizoval první umělý bakteriální gen (Total Synthesis of the Structural Gene for the Precursor of a Tyrosine Suppressor Transfer RNA from Escherichia coli. I.–XII. J Biol Chem 1976; 251: 565–694, XIII.–XVII. J Biol Chem 1979; 254: 5754–5816; spoluautoři Agarwal, van de Sande, Minamoto, Jay, Sekiya, Loewen, Panet, Caruthers, Kleppe, Ramamoorthy, Belagaje aj.).

Pak náhle a natrvalo přesunul Khorana svůj zájem na chemii a molekulární biologii membránového proteinu bakteriorodopsinu (The Preparation of Lipid-Depleted Bacteriorhodopsin. Biochim Biophys Acta 1977; 466 (2): 315–324; s Wildenauerem) a na molekulární mechanismy v buňkách zrakových drah obratlovců, především stavbu a funkci rodopsinu a mutace rodopsinu u retinitis pigmentosa (Structure and Function in Rhodopsin. 7. Point Mutations Associated with Autosomal Dominant Retinitis Pigmentosa. Biochemistry 1994; 33 (20): 6121–6128; s Kaushalem). Jako „Alfred P. Sloan Professor Emeritus“ biologie a chemie Massachusettského technologického institutu od roku 2007 setrvává Har Gobind Khorana u téhož tématu dodnes (Location of the Retinal Chromophore in the Activated State of Rhodopsin. J Biol Chem 2009; 284 (15): 10190–10201; s Ahujaovou a kol.). Dokladem jeho celoživotní píle je 12 let nepřetržité práce bez jediného dne dovolené, zato si dosud každodenně dopřává dlouhé procházky, vždy ovšem s papírem a tužkou, připraven zaznamenat každou myšlenku, která by ho přitom mohla napadnout.

MUDr. Pavel Čech
Kabinet dějin lékařství 3. LF UK
Ruská 87, 100 00 Praha 10
e-mail: pavel.cech@lf3.cuni.cz