Léčba AL‑ amyloidózy –  výsledky jednoho pracoviště a přehled publikovaných zkušeností s novými léky (bortezomibem, thalidomidem a lenalidomidem) u AL‑ amyloidózy

Overview

Pacienti:
Od roku 1999 bylo na našem pracovišti léčeno 15 pacientů s depozity lehkých řetězců ve formě AL‑ amyloidózy a 2 pacienti s depozicí lehkých řetězců ve formě amorfních hmot (light chain deposition disease). Medián věku při stanovení diagnózy byl 63 (34– 77) let. Depozita lehkých řetězců způsobovala nefrotický syndrom u 12 (70 %) pacientů, renální insuficienci se sníženou filtrací u 4 (23 %) pacientů, kardiomyopatii u 4 (23 %) pacientů, hepatosplenomegalii u 2 (12 %) pacientů, manifestní koagulopatie u 2 (12 %) pacientů, periorbitální hematomy u 2 (12 %) pacientů, viscerální a somatickou neuropatii u 2 (12 %) pacientů. Léčba založená na vysokých dávkách dexametazonu v kombinaci s adriamycinem a s vinkristinem (VAD) nebo s cyklofosfamidem (CAD nebo jen CD) byla použita u 11 osob. U 4 z nich byla zakončena vysokodávkovanou chemoterapií s autologní transplantací a v těchto 4 případech bylo dosaženo kompletní hematologické a orgánové léčebné odpovědi s trváním remise 113+, 87+, 50, 45+ měsíců. U zbývajících 7 pacientů, u nichž léčba založená na vysokých dávkách dexametazonu nebyla zakončena vysokodávkovanou chemoterapií, dosáhli 3 pacienti kompletní hematologické remise (CR) a velmi dobré parciální remise (VGPR), ve 2 případech s kompletní orgánovou léčebnou odpovědí. Ve 3. případě nelze orgánovou odpověď pro krátké sledování hodnotit. V dalších 2 případech byla dosažena PR bez orgánové léčebné odpovědi a 2 pacienti v průběhu léčby zemřeli. Léčba obsahující prednison a alkylační cytostatika byla použita u 2 nemocných se závažným orgánovým poškozením, oba nemocní v krátké době v důsledku nemoci zemřeli, takže není možné hodnotit léčebnou odpověď. Kombinace thalidomidu, dexametazonu a cyklofosfamidu (CTD) byla použita u 4 pacientů. Dva z těchto pacientů nedokončili ani 2 cykly, jeden pro nezvladatelnou obstipaci po thalidomidu, druhý pro úmrtí. Dva absolvovali celkem 5 a 6 cyklů této léčby s efektem PR s vytvořením plató po předchozím poklesu koncentrace monoklonálního imunoglobulinu. Léčebná kombinace bortezomib (Velcade), cyklofosfamid a dexametazon (VCD) byla použita ve 3 případech. V 1. případě (po ukončených 6 cyklech CTD s výsledkem PR) navodila kompletní hematologickou remisi, ve 2. (intolerancí thalidomidu již v 1. měsíci léčby) navodila také kompletní remisi a ve 3. případě (po 5 cyklech CTD s výsledkem PR) dosáhla aplikace 2 cyklů CVD také CR. Pouze jedna ze 3 pacientek je sledována déle než 12 měsíců a je možné u ní vyhodnotit orgánovou léčebnou odpověď, u této pacientky vymizel nefrotický syndrom, takže byla dosažena orgánová CR.

Závěr:
Časné stanovení diagnózy (bez velkého orgánového poškození) umožní podávat agresivní léčbu (vysokodávkovanou chemoterapii s autologní transplantací) s nadějí na kompletní hematologickou a orgánovou léčebnou odpověď. Nové léky thalidomid a bortezomib dále rozšiřují léčebné možnosti, dle našich limitovaných zkušeností a publikovaných informací lze považovat bortezomib za velmi účinný a dobře tolerovaný lék vhodný v kombinacích pro pacienty s diagnózou AL‑ amyloidóza.

Klíčová slova:
AL‑ amyloidosis –  ligh chain deposition disease –  monoklonální gamapatie –  thalidomid –  bortezomib –  vysokodávkovaná chemoterapie s autologní transplantací –  nefrotický syndrom –  kardiomyopatie –  neuropatie –  koagulopatie

Úvod

Amyloidóza z lehkých řetězců (immunoglobulin light chain amyloidosis) –  akronymem AL-amyloidóza –  je důsledkem tvorby monoklonálních lehkých řetězců se specifickou mutací, která způsobuje odlišnou prostorovou konfiguraci jejich molekul. Díky této odchylné struktuře amyloidogenní lehké řetězce spontánně agregují a vytvářejí oligomery, a ty pak vytvářejí depozita amyloidových fibril ve stabilní lineární struktuře. Podstatně méně často se ukládají ve formě amorfních hmot (light chain deposition disease) [1].

Obecnou histochemickou vlastností depozit patologických proteinů v lineární amyloidové struktuře je charakterické zelené zbarvení v polarizovaném světle po barvení konžskou červení (obr. 1– 4). V elektronovém mikroskopu jsou zřetelné nevětvené fibrily průměru 7,5– 10 nm. Ale nejen molekuly monoklonálních lehkých řetězců mohou tvořit amyloidová depozita, existuje více než 11 dalších molekul s amyloidogenní mutací, které také mohou tvořit amyloidová depozita, obtížně odlišitelná od depozit monoklonálních lehkých řetězců [2]. Pro terapeutický plán je zásadní správná typizace amylogenních proteinů, protože omyl může mít tragické následky, např. provedení vysokodávkované chemoterapie s autologní transplantací kostní dřeně u pacienta s amyloidózou tvořenou mutovaným transtyretinem, u něhož je naopak vhodná léčba transplantací jater, a nikoliv kostní dřeně. Proto je nutné provést veškerá dostupná vyšetření a v nejasných případech před zahájením vlastní léčby konzultovat i specializovaná pracoviště [3– 5].

Průkaz monoklonální gamapatie však neznamená jednoznačný důkaz toho, že se jedná o AL- amyloidózu. Asi 3 % starších osob mají monoklonální gamapatii. Proto je možný současný výskyt hereditárního typu amyloidového depozita a monoklonální gamapatie. V roce 2002 byla uveřejněna analýza 350 pacientů s nálezem amyloidu a monoklonální gamapatie, u nichž se po prvním vyšetření předpokládala souvislost těchto dvou jevů. Vyšetřili u nich mutace genů dalších amyloidogenních bílkovin (transtyretinu, apolipoprotein A- 1, lysozymu a α-řetězce fibrinogenu). Tato vyšetření odhalila hereditární amyloidózu u 9,7 % nemocných, u nichž se pro přítomnost monoklonální gamapatie předpokládala AL-amyloidóza. V 5 % se jednalo o amyloidózu z α-řetězce fibrinogenu, ve 4 % o amyloidózu způsobenou nerozpoznanou mutací transtyretinu. Amyloidóza z aberantního fibrinogenu poškozuje ledviny podobně jako AL-amyloidóza [6].

Amyloidogenní lehké řetězce jsou produkovány monoklonálními plazmatickými buňkami lokalizovanými v kostní dřeni, případně ve slezině, obvykle v nevelkém množství. S pomocí krevního oběhu se pak dostávající k cílovým orgánům, v nichž se usazují díky zatím neznámým interakcím s matrix jednotlivých tkání (s glykosaminoglykany a s molekulami buněčných membrán). Tyto interakce mohou potencovat tvorbu oligomerů klonálních lehkých řetězců, které již mají cytotoxické vlastnosti a konečné formování amyloidového depozita. To, v kterém orgánu dojde k nejmasivnějšímu poškození, je determinováno geny variabilní části lehkého řetězce, a tedy strukturou amyloidogenního lehkého řetězce [7– 9].

Klinické projevy mohou být velmi pestré a jsou popsány ve vícero českých publikacích [10– 16] a z didaktických důvodů je připomínáme obr. 5– 10.

Výskyt amyloidózy není dostatečně zmapován. Autoři z Mayo klinik uvedli 0,5– 1,2 případů na 100 000 obyvatel [17]. Incidenci dle francouzských autorů uvádí tab. 1.

Cílem léčby je rychlá eliminace tvorby amyloidogenních lehkých řetězců, což je podmínkou, aby došlo ke zlepšení funkce amyloidem poškozených orgánů [19,20]. V klinické studii bylo histologicky prokázáno, že po dokončení chemoterapie dochází k postupnému odbourávání a odstraňování amyloidu v místech jeho depozic. Při opakovaném vyšetřování podkožního tuku břišní stěny u pacientů po dokončení léčby AL-amyloidózy bylo zjištěno, že depozita amyloidu vymizela u 80 % pacientů, kteří po 3,2 letech zůstávali v trvalé kompletní remisi, zatímco u 9 pacientů v parciální remisi nedošlo k vymizení amyloidových depozit [21].

Tato práce mění dosavadní pohled na léčbu této nemoci. Jasně dokazuje, že cílem léčby u AL-amyloidózy musí být dosažení kompletní hematologické remise. Dosažení parciální hematologické remise se dnes nepovažuje za dostatečné, protože neumožní reparační pochody v amyloidem poškozených tkáních a orgánech (schéma 1).

Problémem je skutečnost, že s mírou poškození orgánů a tkání se snižuje tolerance nežádoucích účinků léčby. Proto je zásadní, podobně jako u mnohočetného myelomu, stanovit tuto diagnózu v nejranějších fázích nemoci, kdy malé poškození tkání a orgánů umožní podat agresivní léčbu a kdy po dosažení kompletní remise by mělo dojít ke kompletní orgánové léčebné odpovědi.

Cílem následující analýzy je poukázat na skutečnost, že:

• časná diagnostika a účinná léčba mohou vést ke kompletní a dlouhotrvající hematologické i orgánové remisi
• a nové léky v čele s bortezomibem přinášejí prospěch těchto nemocným.

Tato publikace patří k edukační aktivitě České myelomové skupiny zvané CRAB, s cílem přispět k časnějšímu stanovení diagnózy mnohočetného myelomu a dalších monoklonálních gamapatií [22].

Soubor nemocných a léčba

Soubor nemocných a klinické příznaky, které byly indikací k léčbě

V posledních 10 letech (od roku 1999) bylo na našem pracovišti vyšetřeno léčeno celkem 17 nemocných s poškozením organizmu depozity monoklonálních imunoglobulinů. V 15 případech šlo o depozita lehkých řetězců ve formě AL-amyloidu a 2krát v amorfní (neamyloidové) formě. Soubor se skládá z 11 žen a 6 mužů. Medián věku těchto 17 pacientů se systémovou AL- amyloidózou a light chain deposition disease v době diagnózy byl 63 (34– 77) let.

Mimo uvedených 17 pacientů se sy­stémovou formou depozit monoklonálních lehkých řetězců jsme v průběhu 10 let diagnostikovali 4 případy solitárního izolovaného ložiska amyloidu, 2krát v bronchu, 1krát v laryngu a 1krát v močovém měchýři. Vyjma solitárního ložiska nebylo zřetelné žádné další poškození amyloidem ani monoklonální gamapatie. Ve 2 případech tracheobrochiální amyloidózy jsou tito nemocní sledováni u plicních specialistů. Ložisko v močovém měchýři a v laryngu bylo odstraněno operačně a tito pacienti jsou sledováni mimo naše pracoviště.

Diagnóza AL- amyloidózy byla stanovena na histologickém průkazu amyloidu ve tkáni nejméně jednoho orgánu a současném bio­chemickém průkazu monoklonální gamapatie. Poté následovalo vždy vyšetření obvyklé u mnohočetného myelomu, jehož cílem bylo zjistit, zda se u konkrétního pacienta s monoklonální gamapatií a s poško-zením organizmu depozity lehkých řetězců má stav klasifikovat jako mnohočetný myelom s přidruženou AL-amyloidózu anebo jako primární systémová AL-amyloidózu bez splnění diagnostických kritérií mnohočetného myelomu. Zásadní pro toto rozlišení je prokázání či neprokázání klonálních plazmocytů v kostí dřeni, jak vyplývá z kritérií International Myeloma Working Group z roku 2003 [23] (tab. 2a a 2b), která pak doplněná o upřesnění léčebných odpovědí vyšla v roce 2009 [24]. Z hlediska bio­logie AL-amyloidózy není toto členění zásadní, neboť jde o pohledy z různých úhlů na jeden bio­logický jev s kontinuálním přechodem od nulového po vysoký počet klonálních plazmocytů v kostní dřeni. Nicméně z hlediska formálního je toto rozdělení důležité, protože pro mnohočetný myelom jsou registrovány nové léky (bortezomib, thalidomid a lenalidomid), zatímco pro primární systémovou amyloidózu registrovány nejsou.

Z popisovaných 15 pacientů s depozity lehkých řetězců ve formě AL-amyloidu nebyla naplněna kritéria mnohočetného myelomu v 8 případech, takže diagnóza byla uzavřena jako primární systémová AL-amyloidóza. U 7 pacientů ve vzorku kostní dřeně, získaném trepanobio­psií, byly imunohistochemicky v plazmocytech prokázány lehké řetězce λ, méně často κ, a tím prokázána jejich klonalita. U těchto 7 pacientů byla diagnóza uzavřena jako symptomatický mnohočetný myelom provázený AL-amyloidózou, přesně dle kritérií IMWG 2003. Zajímavé je, že u pacientů s diagnózou uzavřenou jako mnohočetný myelom s přidruženou amyloidózou nebyla stejně jako u pacientů s diagnózou primární systémová AL-amyloidóza detekována osteolytická ložiska ani difuzní osteoporóza.

Přínos vyšetření vzorku kostní dřeně průtokovou cytometrií

Pomocí průtokové cytometrie (FC) byla vyšetřena kostní dřeň u 7 pacientů ze 17 (3 s mnohočetným myelomem provázeným amyloidózou a 4 s primární systémovou AL-amyloidózou). Plazmocyty (PC) byly identifikovány jako CD38+CD138+ buňky s mediánem zastoupení 0,2 % (0,2– 2,2). Dle mediánu počtu CD45+PC 40,4 % (12,2– 76,0) lze usoudit, že u všech pacientů bylyv různé míře nalézány klonální CD45- PC,což bylo dále potvrzeno sníženým za-stoupením CD19+PC 29,0 % (2,5– 69,3)a zvýšeným zastoupením CD56+PC 41,3 % (2,7– 96,3). U jedné pacientky došlo ke ztrátě CD56 na patologických PC a u další pacienty byly naopak nalezeny CD19+ l + klonální PC. Překvapivě PC téměř všech hodnocených pacientů exprimovaly též znak CD27, nicméně k významu jeho exprese se prozatím nelze vyjádřit (obr. 11). Je zřejmé, že analýza PC pomocí senzitivní průtokové cytometrie může napomoci orientaci a stanovení diagnózy tím, že prokáže patologickou populaci plazmocytů v kostní dřeni, jinými metodami nedetekovanou. Průkaz klonální plazmocytární populace v kostní dřeni při histologickém nálezu amyloidu, jehož složení se ne vždy podaří pojmenovat, umožní uzavřít diagnózu jako AL-amyloidóza.

Současně pak FC může sloužit k monitorování účinnosti léčby.

Depozita lehkých řetězců v neamyloidové podobě

U 2 pacientů s nefrotickým syndromem a sníženou filtrací (zvýšená hodnota kreatininu) odhalila bio­psie ledvin depozita lehkých řetězců ve formě amorfních hmot, takže u nich byla diagnóza uzavřena jako light chain deposition disease. Plazmocelulární proliferace v kostní dřeni měla u jednoho charakter monoklonální gamapatie nejistého významu a u druhého pak mnohočetného myelomu. Charakter souboru dokumentuje tab. 3.

Spektrum orgánového poškození

V uvedeném sedmnáctičlenném souboru pacientů s poškozením organizmu depozity lehkých řetězců byl nejčastějším příznakem nemoci nefrotický syndrom 12 pacientů (70 %). Snížená filtrace se zvýšenou hodnotou kreatininu v séru byla nalezena jen u 4 nemocných (23 %). Poškození srdce bylo echokardiograficky prokázáno u 4 (23 %) nemocných, v jednom z těchto případů byla amyloidová kardiomyopatie prokázána bio­pticky. Všichni pacienti s kardiomyopatií měli sníženou fyzickou zdatnost (NYHA II– III).

Hepatosplenomegalie byla palpačně a sonograficky prokázána u 2 (12 %) nemocných, bio­psie jater však nebyla u žádného z pacientů provedena, na souvislost s AL-amyloidózou jsme pouze usuzovali, protože nebyl znám žádný další důvod pro tyto změny.

Klinicky manifestní koagulopatie byla přítomna ve 2 případech (12,0 %). V jednom případě byla zřejmě kombinované etiologie (trombocytopatie i alterace koagulačních faktorů), ve druhém případě šlo o izolovaný deficit faktoru X, jeho nejnižší hodnoty oscilovaly kolem 10 %. Snížená hladina faktoru X u této pacientky způsobovala metrorrhagii. Ta byla důvodem pro kyretáž, a když se krvácení pro kyretáže zhoršilo, následovala hysterektomie. Operace byla komplikována hemoragickým šokovým stavem, který naště­stí pacientka přežila. V resekátu dělohy byl prokázán amyloid.

Závažná somatická a viscerální neuropatie s klinicky závažnou ortostatickou hypotenzí byla diagnostikována u 2 (12 %) nemocných, syndrom karpálního kanálu měli 4 (23 %) nemocní. Pacienty s typickými velkými periorbitální hematomy v našem souboru nemáme. U 2 (12,0 %) pacientů z našeho souboru však byly přítomny pouze malé, diskrétní hematomy na víčkách. Stejně tak se v našem souboru nevyskytla makroglosie (typický příznak AL- amyloidózu, který se u jiných typů amyloidózy nevyskytuje). Příznaky poškození organizmu depozity lehkých řetězců a základní charakteristiku souboru shrnuje tab. 4.

Léčba

Léčba pacientů této skupiny nebyla homogenní, a to jak pro odlišný bio­logický stav jednotlivých nemocných, tak pro měnící se socioekonomické podmínky a dostupnost použitých protinádorových léčiv v posledních 9 letech. Při volbě léčebného režimu bylo přihlíženo k celkové fyzické a mentální zdatnosti, věku a k hodnotám krevního obrazu před léčbou.

Klasickou léčbou, používanou jak u mnohočetného myelomu, tak u primární AL-amyloidózy i light chain depo­sition disease při MGUS, je kombinace vinkristinu, adriamycinu a dexametazonu (VAD). Tuto léčbu jsme použili u 6 (35 %) pacientů.

Vinkristin je však možné vyměnit za cyklofosfamid. Kombinací CAD byli léčeni 2 (12 %) pacienti.

Dalším léčebným schématem, které jsme použili v našem souboru, je kombinace cyklofosfamidu (buď perorálně 50 mg denně dlouhodobě, nebo 500 mg/ m² i.v. infuze ve 14denních intervalech) a podávání dexametazonu (20– 40 mg) 1.– 4. den a 15.– 18. den ve 28denních intervalech. Toto léčebné schéma bylo použito u 2 (12 %) pacientů.

Kombinace cyklofosfamidu, thalidomidu a dexametazonu byla použita ve 4 (23 %) případech a u 3 z nich jsme po 6 cyklech změnili léčbu na kombinaci bortezomibu (Velcade), cyklofosfamidu a dexametazonu (VCD).

Léčebné režimy, které mají prednison místo dexametazonu, jsme použili pouze ve 2 (12 %) případech, jednou to byla kombinace vinkristin, melfalan, cyklofosfamid a prednison (VMCP) a jednou to byla kombinace prednisonu a cyklofosfamidu.

Vysokodávkovanou chemoterapii (melfalan 100 mg/ m², maximálně 140 mg/ m²) jsme použili u 4 (23 %) nemocných.

Nežádoucí účinky léčby

Léčebné režimy založené na dexametazonu jsou sice účinné, ale mají pravidelné nežádoucí účinky. Běžnými nežádoucími účinky uvedených dávek dexametazonu jsou psychické problémy, které jsou u někoho největší právě ve dnech užívání dexametazonu (poruchy spánku, agresivita, či naopak deprese), u jiného naopak jsou nejintenzivnější těsně po vysazení dexametazonu (detrakční syndrom s výraznými projevy fatigue). Tyto účinky postihnou více či méně každého léčeného. Běžným nežádoucím účinkem je také manifestace latentního diabetes mellitus či dekompenzace stávajícího diabetes mellitus. S dekompenzací diabetu jsme se setkali u 4 nemocných, u 2 z nich to bylo důvodem k hospitalizaci, 2 to zvládali s navýšením inzulinu dle aktuálních hodnot glykemií, měřených doma glukometrem. Dalším problémem jsou infekce. V našem souboru 17 léčených bylo celkem 10 hospitalizací pro infekční komplice v průběhu léčby. V jednom případě šlo o závažný pásový opar s dlouhodobě trvajícími neuralgickými bolestmi.

U pacientů s nefrotickým syndromem, závažnou hypoalbuminemií, se objevuje další problém, který u pacientů s mnohočetným myelomem se v té míře nevyskytuje. Retence tekutin v době užívání dexametazonu působila ve 3 případech závažné problémy a u jedné pacientky retence tekutin při dexametazonu vyústila v počínající plicní edém. Proto rizikové osoby s nefrotickým syndromem jsme hospitalizovali po dobu podávání dexametazonu a dle vývoje hmotnosti upravovali dávky furosemidu.

Myelosuprese není pro používané režimy typická. Problémem bylo však neurotoxické působení vinkristinu, zvláště pokud nasedlo na viscerální neuropatii související s amyloidózou. Proto jsme ve 2 případech museli pro subileózní stav po 1. cyklu chemoterapie VAD vysadit vinkristin a pokračovat pouze kombinací AD.

U 4 pacientů s AL-amyloidózou při mnohočetném myelomu byl použit režim s thalidomidem. V jednom případně byl režim CTD opuštěn ihned po 1. cyklu pro nezvladatelnou obstipaci, jedna pacientka zemřela po 2 cyklech CTD a 2 pacientky absolvovali 5 a 6 cyklů CTD. Typickými nežádoucími účinky, které tento režim provázely, byla zácpa, fatigue a postupně nastupující příznaky neuropatie.

Režim založený na bortezomibu dostali celkem 4 pacienti, obvykle následoval při netoleranci thalidomidového režimu anebo při nedosažení CR thalidomidovým režimem. Při této léčbě dominovaly nežádoucí účinky dexametazonu (retence tekutin, psychické problémy). Neuropatie, které provází léčbu Velcadem, byla jen mírná, pouze I. a II. stupně, srovnatelná jako u pacientů s mnohočetným myelomem.

Výsledky léčby

V případě AL-amyloidózy a ligh chain deposition disease je nutné hodnotit jak hematologickou léčebnou odpověď (změny koncentrace monoklonálního imunoglobulinu a volných lehkých řetězců a změny v počtu plazmocytů v kostní dřeni), tak také orgánovou odpověď. Hematologickou léčebnou odpověď a orgánovou léčebnou odpověď hodnotíme dle kritérií z roku 2005 [25], jejich český překlad byl zveřejněn v časopise Vnitřní lékařství [10].

Kompletní hematologické léčebné odpovědi bylo dosaženo celkem 8krát (47 %).

Velmi dobré parciální léčebné odpovědi (koncentrace M-Ig je poklesla na tak nízké hodnoty, že není možné kvantitativní stanovení denzitometrií, ale je stále prokazatelné pomocí imunofixační elektroforézy) bylo dosaženo u 2 (12 %) pacientů.

Parciální léčebné odpovědi bylo dosaženo u 2 (12 %) pacientů.

U 5 pacientů nebylo dosaženo žádné léčebné odpovědi.

Orgánovou léčebnou odpověď bylo možné hodnotit jen u 13 pacientů, u 4 ji pro krátký interval ji hodnotit.

K vymizení příznaků poškození orgánu monoklonálním imunoglobulinem (neboli k orgánové CR) došlo celkem u 5 (38 %) pacientů. U jedné nemocné byla orgánová léčebná odpověď hodnocena jako parciální.

U 6 pacientů nedošlo k žádným změnám orgánového poškození, v 1 případě se míra orgánového poškození v průběhu léčby zhoršovala.

Jednoznačným předpokladem k orgánové léčebné odpovědi bylo dosažení kompletní hematologické remise. Léčbu, léčebné odpovědi a dobu sledování celého souboru uvádí tab. 5.

Doba sledování a délka přežití

Z uvedeného souboru 17 pacientů zemřelo 5 pacientů, takže není možné stanovit medián přežití. Medián sledování celého souboru je 18,5 (0,3– 124) měsíců. Průměrná doba sledování je 39,6 měsíců. Tento rozdíl mezi medián a průměrem je způsobem relativně vyšším počtem nemocných s touto diagnózou v posledních letech.

Nicméně z údajů uvedených v tab. 5 je zřetelné, že dosažení kompletní hematologické remise je velmi často provázeno dosažením kompletní orgánové léčebné odpovědi a dlouhodobými remisemi.

Diskuze

Prognostické členění pacientů s AL-amyloidózou

Tolerance, a tím i výsledky léčby u pacientů s AL-amyloidózou závisí na míře poškození orgánů a tkání nemocného depozity amyloidu. Volba léčebného re-žimu je výsledek odhadu poměru pravděpodobnosti závažných nežádoucích účinků léčby při zjištěné míře a rozsahu poškození organizmu amyloidem a přínosu léčby pro konkrétního pacienta.

V poslední době se ukazuje, že prognosticky nejzávažnější je míra poškození srdce amyloidem [26,27]. Proto prognostická klasifikace zohledňuje míru poškození srdce. Je založen na 2 parametrech, na hodnotě troponinu a hodnotě NT- (N-terminální) proBNP (proBrain Natriuretic Peptide).

ProBNP je peptid o délce 108 aminokyselin, tvořený myocyty dominantně v levé komoře v důsledku napětí srdeční stěny. Po uvolnění je štěpen na 2 fragmenty, na aktivní BNP obsahují 77. až 108. aminokyselinu a na NT-proBNP obsahující 1.– 76. aminokyselinu. BNP i NT- proBNP jsou markery srdečního selhání.

Autoři z Mayo kliniky navrhli a ověřili jednoduchý klasifikační systém, založení na troponinu a NT-proBNP. Pacienti, kteří měli obě hodnoty ve fyziologickém rozmezí, tvořili skupinu s nízkým rizikem, pacienti s oběma parametry nad fyziologickou hranicí tvořili skupinu s vysokými rizikem. Střední skupiny tvořili pacienti s jednou patologickou a jednou fyziologickou hodnotou. Uvedené hodnoty byly zvýšené také u několika pacientů s normálními echokardiografickými nálezy, kteří ale při dalším sledování měli nepříznivý průběh a krátkou dobu přežití, podobně jako ostatní pacienti se zvýšenými hodnotami. Proto se autoři domnívají, že tato laboratorní klasifikace svou přesností předčí echokardiografické vyhodnocení [28]. Italští autoři k této klasifikaci připojili ještě další parametry, tak jak je uvádíme v tab. 6 [29].

Za pacienty s nízkým rizikem považuje Palladini nemocné mladší 65 let, s postižením maximálně 2 orgánů, s hodnotami troponinu a NT-proBNP ve fyziologickém rozmezí, clearencí kreatininu nejméně 50 ml/ min a plicní difuzní kapacitě nad 50 % a systolickým tlakem nad 90 mm Hg. Tito nemocní mohou být považováni za kandidáty pro vysokodávkovanou chemoterapii. Počet těchto pacientů však obvykle nepřesahuje 15 % všech pacientů s AL-amyloidózou.

Pacienti s vysokým rizikem mají krátký medián přežití asi kolem 3,5 měsíce a představují přibližně 20 % všech pacientů s AL-amyloidózou Tito nemocní jsou velmi křehcí a špatně tolerují nežádoucí účinky chemoterapie. Nicméně i tito nemocní mohou profitovat z léčby, pokud jim jejich zdravotní stav umožní, aby ještě žili tak dlouho, aby mohli dokončit chemoterapii a mít prospěch z případné kompletní remise. Ze skupiny 22 těchto pacientů zemřelo 6 nemocných před dokončením 3. cyklu chemoterapie CTD a pouze 8 pacientů dosáhlo hematologické léčebné odpovědi a z nich 4 dosáhli dlouhodobého zlepšení funkce srdce [29]. Jsou však popsány i další případy, kdy kombinovaná léčba obsahující thalidomid přinesla nejen hematologickou léčebnou odpověď, ale i zlepšení srdeční funkce [30].

Podobně jako u mnohočetného mye-lomu důležitým prognostickým faktorem je také masa patologických plazmocytů, a tedy produkce volných lehkých řetězců. Výše jejich koncentrace v době stanovení diagnózy má prognostickou výpověď. O míře léčebné odpovědi svědčí více změny v koncentraci volných lehkých řetězců než změny koncentraci kompletní molekuly monoklonálního imunoglobulinu [31– 38].

Léčebné alternativy

Režimy kombinující cytostatikum s vysokou dávkou dexametazonu

Klasickým léčebným postupem v předchozích desetiletích byla léčba melfalanem a prednisonem [39]. Tato léčba přinášela však nevelký počet léčebných odpovědí, nevedla tedy k zásadnímu prodloužení přežití [40]. Léčba kombinací více alkylačních cytostatik také nevedla k zásadnímu zlepšení [41]. Zvýšení počtu léčebných odpovědí přineslo až přidání vysokých dávek dexametazonu do léčebných schémat, počet léčebných odpovědí byl vyšší než v předchozích studiích. Monoterapie dexametazonem a udržovací léčba dexametazon + interferon dosáhla 24 % kompletních remisí [42].

Podobně i další klinické studie, v nichžbyly použity léčebné režimy obsahující vysoké dávky dexametazonu, prokázaly vyšší počet léčebných odpovědí než dříve používaný alkeran a prednison (alkeran a dexametazon) [43], VAD a jemu podobné režimy [44,45], střední dávky melfalanu a dexametazon [42,46]. Ve studii zveřejněné roku 2007 dosáhla kombinace melfalan + dexametazon léčebné odpovědi v 67 % případů (33 % CR) a orgánové léčebné odpovědi ve 48 %. Dosažené léčebné odpovědi trvaly v 70 % nejméně 3 roky [47]. Poslední vyhodnocení dat z italského centra uvádí v souboru 126 pacientů 26 % CR, 36 % PR a 33 % orgánových léčebných odpovědí [48]. Menší počet léčebných odpovědí uvádí studie se 70 pacienty nevhodnými k transplantační léčbě, u 22 z nich pro časné úmrtí nebylo možné hodnotit léčbu a ze zbytku 48 hodnotitelných nemocných bylo dosaženo jen 15 % hematologických léčebných odpovědí [49]. Je zřejmé, že výsledky léčby zásadně závisí od složení léčebné skupiny nemocných.

V našem souboru jsem chemoterapii VAD, CAD či jen AD použili v 9 případech, ve 4 z nich pak zakončili vysokodávkovaným melfalanem. Z 5 léčených klasickými režimy VAD, CAD a AD bylo v 1 případě dosaženo CR a poději i orgánové CR, v jednom případě VGPR s kompletní orgánovou CR, v jednom případě PR bez orgánové léčebné odpovědi a ve 2 případech nebyla dosažena žádná léčebná odpověď a tito pacienti po 5 a 6 měsících od zahájení léčby zemřeli.

Thalidomid v léčbě AL-amyloidózy

Po roce 2000 se do klinického použití dostaly nové léky pro mnohočetný myelom, thalidomid, bortezomib a lenalidomid. Registrační klinické studie, na jejichž základě jsou tyto léky používány u mnohočetného myelomu, byly opakovaně zveřejňovány. Naproti tomu mnohem méně pozornosti bylo věnováno přínosu těchto léků pro AL-amyloidózu, neboť toto onemocnění je méně časté, a tak se farmaceutickým firmám nevyplatí provádět velké registrační studie. Práce, které vyhodnocují jejich podání, musí tedy vždy uvést, že byly použity of lable.

Nicméně díky akademickým studiím, v rámci nichž byly tyto nové léky u AL-amyloidózy použity, máme již k dispozici informace, které potvrzují, že tyto léky přinášejí minimálně stejně velký prospěch pacientům s AL-amyloidózou jako pacientům s mnohočetným myelomem.

Thalidomid v monoterapii je v případě AL-amyloidózy málo účinný při použití v nízkých dávkách a špatně tolerovatelný při použití dávek vyšších [50,51].

Palladini, který používal maximální tolerovatelné dávky, až 400 mg, uvádí symptomatickou bradykardii u 26 % léčených [52].

Při kombinaci s dexametazonem se však účinnost léčby zvyšuje a počet léčebných odpovědí dosáhl 48 % [52]. Kombinovaná léčba (cyklofosfamid, thalidomid a dexametazon) v dávkách upravovaných dle předpokládané tolerance dosáhla celkem 74 % léčebných odpovědí [53]. Kombinace melfalanu, dexametazonu a thalidomidu pomohla i v případech závažné kardiální formy amyloidózy, pokud srdeční postižení umožnilo absolvovat alespoň 3 cykly [29]. Největší popsaný soubor vyšel z britských ostrovů, celkem 202 pacientů bylo léčeno tímto režimem. Hematologickou léčebnou odpověď popisují o 62 % hodnocených pacientů, z toho bylo 25 % CR a 3 % nCR. Léčebná odpověď byla dosažena u 67 % nově léčených nemocných a u 54 % nemocných s relapsem nemocí. Celkový počet orgánových léčebných odpovědí dosáhl 42 %. Frekvence dosažení orgánové léčebné odpovědi však závisí od toho, který orgán je poškozen.

Orgánová léčebná odpověď byla dosažena při poškození ledvin u 46 % léčených, při poškození jater u 29 % léčených, při poškození nervů u 13 % léčených, při poškození srdce u 8 % léčených, při poškození gastrointestinálního traktu u 25 % [54]. Nicméně jsme v literatuře našli 2 zveřejněné srovnávací studie klasické léčby melfalanem a dexametazonem (MD) s kombinací thalidomidu, dexametazonu a cyklofosfamidu (CTD). Po 12 měsících léčby byla orgánová léčebná odpověď prokázána u 44/ 113, tedy 39 % pacientů léčených režimem CTD a u 12/ 56, tedy 21 % pacientů léčených MD (p = 0,03). Autoři uvádějí, že mezi oběma režimy nebyl rozdíl v počtu hematologických kompletních remisí, celkovém počtu hematologických odpovědí, toxicitě a celkovém přežití, pouze medián nástupu léčebné odpovědi (dle FLC) byl 3 měsíce po MD a 2 měsíce po CTD [55]. Shodné závěry získané na podstatně menším souboru pacientů (12 MD + 12 CTD) uvádějí i další autoři [56]. Zkušenosti s thalidomidem shrnuje tab. 7.

V našem souboru nemocných dostali celkem 4 pacienti režim CTD v rámci první linie léčby. Pouze 2 z nich absolvovali více než 2 cykly (5 a 6 cyklů, ale pro nedosažení CR byla léčbě nakonec změněna za bortezomibový režim). V jednom případně pro intoleranci (neřešitelná zácpa) muselo být podávání thalidomidu po měsíci ukončeno a léčba byla změněna na bortezomibový režim a jedna pacientka zemřela v průběhu druhého léčebného cyklu na infekci.

Bortezomib v léčbě AL-amyloidózy

První klinické zkušenosti s bortezomibem přinesly pozitivní překvapení. Kastritis aplikoval bortezomib a dexametazon skupině 18 pacientům (z toho 7 bylo relabujících) a dosáhl 94 % léčebných odpovědí, z toho 44 % kompletních remisí, přičemž medián intervalu do dosažení léčebné odpovědi bylo jen 0,9 měsíce. Při mediánu sledování 11,2 měsíce zaznamenali již 28 % orgánových léčebných odpovědí [59,60]. Tak vysoký počet léčebných odpovědí po klasické léčbě zatím nebyl zaznamenán. Hypotetickým vysvětlením je velmi vysoká citlivost amyloidotvorných plazmocytů na bortezomib. Úlohou proteasomu je regulovaná degradace proteinů. Degradovány jsou nesprávně složené proteiny, aberantní proteiny nebo proteiny, které regulují např. buněčný cyklus nebo apoptózu. Proteasom hraje např. klíčovou roli v regulaci aktivity NF-κB (nukleární faktor κ B), a to degradací jeho inhibitoru I- κB (inhibitor κ B).

Účinek inhibitorů proteasomu (včetně bortezomibu) na myelomové buňky souvisí především s jejich dopadem na funkci faktoru NF-κB, který, je li aktivní, zprostředkovává přežití MM buněk a jejich rezistenci k chemoterapii a radioterapii. V důsledku inhibice degradace proteinů nedochází k degradaci I-κB, a tím k aktivaci NF-κB. Působením bortezomibu je tedy I-κB stabilizován, tím je NF-κB inhibován, a nemůže tak zajistit přežití MM buněk.

Mechanizmus účinku bortezomibu na amyloidogenní plazmatické buňky zahrnuje stejný mechanizmus jako u myelomových buněk, tedy inhibici NF-κB, ale navíc ještě další. Degradace proteasomem je spřažena s uvolňováním proteinů určených k degradaci z lumen endoplazmatického retikula (ER). Pokud je tento proces zastaven, v ER se proteiny hromadí a to způsobuje stres ER. Stres ER představuje stav, při kterém je porušena metabolická a redoxní rovnováha a buňka se stává citlivější k apoptóze, např. v důsledku stabilizace ně­kte­rých proapoptotických proteinů. Dlouhodobý stres ER pak vede k apoptóze.

V případě amyloidózy je v ER postižených buněk velké množství aberantních imunoglobulinů. Inhibice proteasomu působením bortezomibu vede k další akumulaci proteinů v ER, způsobí tak stres ER, který následně indukuje apoptózu [61].

Dávky bortezomibu byly u AL amyloidózy testovány v eskalační studii 0,7– 1,6 mg 1krát týdně a 0,7– 1,3 mg 2krát týdně. Celkem 31 pacientů bylo rozděleno do 7 skupiny. Celkem bylo dosaženo 20 % kompletních remisí opět s krátkým mediánen pro dosažení léčebné odpovědi 1,2 měsíce. Autoři konstatují, že při dávce bortezomibu 1,3 mg/ m² při klasickém dávkování 1, 4, 8, 11 a nebo 1,6 mg/ m² při podávání ve dnech 1, 8, 15, 22 v 35denních cyklu se neliší tolerance od pacientů s myelomem a dosahuje vysokého počtu léčebných odpovědí. V dalších studiích budou tedy používat stejné dávky [62].

Zkušenosti z Velké Británie sumarizuji Wachelaker. V souboru 20 intenzivně předléčených pacientů (medián předchozích léčebných linií = 3), kteří dostávali bortezomib v monoterapii nebo v kombinaci s dexametazonem, dosáhli 15 % kompletních remisi a 65 % parciálním remisi a orgánová léčebná odpověď byla dosažena u 38 % léčených [63.]

Doposud největší soubor pacientů je obsažen souhrnném hodnocení italských, britských a řeckých center, věnujících se léčbě amyloidózy –  obsahující 94 pacientů. Tito pacienti byli léčení bortezomibem v kombinaci s dexametazonem. Celkem bylo dosaženo 71 % léčebných odpovědí, z toho 25 % kompletních. V podskupině, která tuto léčbu dostala jako iniciální, bylo dokonce dosaženo 47 % CR, zatímco ve skupině, jejíž pacienti byli refrakterní či relabovali po jiné iniciální léčbě, to bylo jenom 20 %. Orgánové léčebné odpovědi bylo dosaženo u 30 % pacientů (22 % kardiálních, 17 % renálních a 19 % hepatálních léčebných odpovědí). Opět byl potvrzen krátký interval pro dosažní léčebné odpovědi (medián 1,2 měsíce) a medián intervalu pro dosažení kompletní remise 2,3 měsíce. Autoři svoje pozorování uzavírají slovy: kombinovaná léčba amyloidózy obsahující bortezomib a dexametazon je velmi účinná a má zvladatelné nežádoucí účinky [64]. Pro srovnání u dříve používaných léčebných postupů to bylo 3,5 a 6,2 měsíce. Zkušenosti s bortezomibem v léčbě AL- amyloidózy shrnujeme v tab. 8.

V našem souboru jsme kombinaci obsahující bortezomib použili celkem 3krát při intoleranci thalidomidu anebo při nedosažení kompletní remise thalidomovým režimem. Ve 2 případech tato léčba navolila CD a v jednom VGPR. Naše zkušenosti tedy potvrzují vysoký účinek bortezomibu u AL-amyloidózy.

Lanalidomid v léčbě AL- amyloidózy

Lenalidomid, lék s ověřenou účinností u mnohočetného myelomu, byl použit také v léčbě AL-amyloidózy. První studie ověřovaly dávku. Standardní dávka 25 mg/ den se ale v iniciální léčbě amyloidózy ukázala velmi toxická, a proto byla snížena na 15 mg/ den, podobně jako i v pozdějších studiích (tab. 9). Při použití této dávky bylo dosaženo 29 % kompletních hematologických léčebných odpovědí, 38 dosáhlo PR [69]. Další zkušenosti byly získány na Mayo klinice v Rochesteru. První 3 cykly podávali lenalidomid v monoterapii. Z těchto 23 nemocných nedokončilo 10 plánované 3 cykly a z těch, kteří tyto plánované 3 cykly dokončili, pouze u jednoho došlo k hematologické léčebné odpovědi. Pak přidali k lenalidomidu dexametazon a v průběhu dalších měsíců léčby se zvýšil počet hematologických léčebných odpovědí na 9 z 22 (45 %). Tato studie tedy prokázala nízkou účinnost v lenalidomidu v monoterapii, poukázala na jeho toxicitu a prokázala jeho účinnost v kombinaci s dexametazonem [70]. V analýze souboru z roku 2008 tito autoři uvádějí, že lenalidomid v monoterapii není vhodný pro léčbu AL amyloidózy, ale v kombinaci může být pro tyto nemocné užitečný [71].

Další klinické studie proto začínají testovat revlimid v trojkombinaci (lenalidomid, dexametazon a cyklofosfamid), zatím však bez jasného doporučení pro praxi [72]. Nicméně aplikace revlimidu může být spojena se zhoršováním ledvinných i srdečních funkcí [73]. Současné zkušenosti s touto léčbou sumarizuje tab. 9.

Vysokodávkovaná chemoterapie

Léčba vysokodávkovaným melfalanem s transplantací autologních krvetvorných buněk dosahuje vysokého počtu kompletních hematologických remisí, což sebou přináší zlepšení kvality života a prodloužení přežití [79]. Nicméně tento postup je spojen s určitou toxicitou, a to při zvýšené fragilitě pacientů, způsobené depozity amyloidu, je spojeno se zvýšenou mortalitou, která se pohybuje od 11 % [80] do 27 % [81]. Tuto vysokou mortalitu je možné zmenšit pečlivou selekcí nemocných vhodných pro tuto léčbu, založenou pečlivým vyhodnocením míry srdeční dysfunkce [82– 89].

Další možností, jak snížit mortalitu, je snížení dávky melfalanu na 100– 140 mg/ m². Redukce dávky však snížila počet hematologických odpovědí (53 %) a přitom pořád zůstala nezanedbatelná mortalita [90].

V retrospektivní studii měli pacienti s vysokodávkovanou chemoterapií delší přežití než pacienti léčení melfalanem a prednisonem [91].

První multicentrickou studií, která měla za cíl srovnat klasickou chemoterapii melfalan a dexametazon s vysokodávkovanou chemoterapií, byla studie francouzské myelomové skupiny. V této studii nebyl zjištěn signifikantní rozdíl v počtu hematologických a orgánových léčebných odpovědí v obou skupinách [92].

Kritické hlasy sice vyčítají této studii suboptimální výběr pacientů pro vysokodávkovanou chemoterapii, nicméně vyplývá z ní, že konvenční režim založený na vysokodávkovaném dexametazonu a alkylačním cytostatiku má pořád své místo v léčbě těchto nemocných.

Tato provokativní francouzská studie iniciovala další analýzy této otázky. Randomizovaná studie z Mayo kliniky prokázala, že vysokodávkovaná chemoterapie je jednoznačně lepší než kombinace melfalanu a dexametazu pro pacienty s počtem plazmocytů v kostní dřeni nad 20 % [93].

Důležitost dosažení kompletní remise pro prognózu nemocných zdůrazňuje analýza 80 pacientů, kteří podstoupili vysokodávkovanou chemoterapii s au-tologní transplantací před 10 lety. Sice 22 % léčených umřelo v průběhu 1. roku (14 % důsledkem toxicity léčby a 8 % důsledkem progrese). Z 63 pacientů, kteří přežili 1. rok po transplantaci, se 51 dostalo do kompletní remise nemoci. Pro celou skupinu 80 pacientů byl medián přežití 4,75 roku. Medián přežití pacientů, kteří se dostali do kompletní remise, přesahoval 10 roků, zatímco medián přežití těch, kteří se nedostali do kompletní remise, byl pouze 50 měsíců. Tato studie prokázala, že dosažení kompletní remise navodí u AL- amyloidózy dlouhodobé přežití [94]. A ani postižení srdce není kontraindikací, v souboru 194 pacientů s kardiálním poškozením a vysokodávkovanou chemoterapií byla dosažena hematologická léčebná odpověď u 69 % nemocných a orgánová léčebná odpověď u 47 %, a to za cenu 16,5 % mortality [95].

Z našeho souboru byla vysokodávkovaná chemoterapie podána celkem 4 pacientům a všichni jsou v dlouhodobé remisi trvající 113+, 87+, 50+ a 45+ měsíců. Nikdo z našich pacientů po vysokodávkované chemoterapii s autologní transplantací neumřel na komplikaci ani na progresi nemoci. Vysokodávkovanou chemoterapii považujeme stále za vhodnou volbu pro nemocné bez závažného orgánového poškození.

Vysokodávkovaná chemoterapie následovaná konsolidační chemoterapií

Pro pacienty, kteří po vyskodávkované chemoterapii nedosáhnou kompletní remise, jsou vhodné další léčebné linie. Kombinace thalidomidu a dexametazonu byla v této indikaci zkoušena u 31 nemocných, u 42 % z nich prohlou-bila léčebnou odpověď, ale tolerance této léčby nebyla bezproblémová [58].

V následující klinické studii (27 pacientů) zaměnili thalidomid za bortezomib a u 7/ 8 pacientů došlo ke zlepšení léčebné odpovědi [96].

Časnou konsolidační léčbu navazující na vysokodávkovanou chemoterapii s autologní transplantací, která může prohloubit dosaženou léčebnou odpověď u těch pacientů, kteří nejsou v CR, podporují i výsledky dalších studií [98]. Výsledky nejnovější studie shrnujeme do tab. 10.

Závěry pro praxi

• AL-amyloidóza může mít projevy zře-telné na první pohled –  periorbitálníhematomy, lehká tvorba hematomů nebo makroglosie, anebo může způsobovat poškození organizmu prostému oku lékaře skryté (nefropaties nefrotickým syndromem, kardio-myopatie, neuropatie, syndrom karpálního kanálu, poškození zažívacího traktu, získanou poruchu koagulace).
• Na poškození orgánu amyloidem je nutno pomýšlet při zjištění ně­kte­rého z výše uvedených problémů.
• Prokázat lze amyloid jedině histologickým vyšetřením s cíleným barvením na amyloidózu a typizací bílkovin, z nichž jsou vytvořena amyloidová depozita. Histologie však není vždy schopna prokázat, že se jedná o amyloid z lehkých řetězců. K závěru, že se jedná o amyloid vytvořený z depozit lehkých řetězců, lze sice přijít proteomickou analýzou, tak však není v ČR dostupná. Proto k této diagnóze dospíváme nepřímo, metodou vyloučení jiných příčin amyloidózy a průkazem monoklonální gamapatie na základě bio­chemických metoda a na základě vyšetření kostní dřeně histologicky, ale i flowcytometricky.
• Úspěch léčby závisí na míře poškození organizmu amyloidem, při malém poškození organizmu a věku do 65 let lze použít vysokodávkovanou chemoterapii s vysokou pravděpodobností dosažení úspěchu. V případě pozdní diagnózy a velkého poškození orgánů, zvláště pak srdce, obvykle pacient již léčbu netoleruje a obvykle zmírá dříve, než by mohl nastoupit případný léčebný efekt.
• V případech, kdy nelze použít vysokodávkovanou chemoterapii, se považuje za vhodné podat léčebnou kombinaci obsahující dexametazon, alkylační cytostatikum a případně ně­kte­rý z nových léků.
• Z nových léků lze pro tuto nemoc použít bortezomib, ale také thalidomid či lenalidomid.
• Při léčbě AL-amyloidózy je nutno mít vždy na paměti, že cílem léčby musí být vždy dosažení kompletní hematologické remise (vymizení amyloidotvorných lehkých řetězců, potvrzeno negativní imunofixací a normálním nálezem volných lehkých řetězců v séru).
• Řádově měsíce od dosažení hematologické kompletní remise může dojít k orgánové léčebné odpovědi (vymizení depozit amyloidu v orgánech), a tím ke zlepšení funkce poškozených orgánů.
• Vyšetřování volných lehkých řetězců v séru umožňuje monitorovat účinnost léčby AL-amyloidózy, a 90 % pokles jejich koncentrace je spojen se signifikantně delším přežitím.

Text byl připraven v rámci projektu CRAB –  „Časnou diagnostikou za lepší kvalitu života“, který byl aktivován v roce 2007, a dále v rámci následujících aktivit: MŠMT LC 06027, MSM0021622434, GACR 301/ 09/ P457, IGA NS10408- 3a IGA NS10406- 3.

prof. MUDr. Zdeněk Adam, CSc.
www.fnbrno.cz
e-mail: z.adam@fnbrno.cz

Doručeno do redakce: 26. 11. 2009
Přijato po recenzi: 4. 1. 2010