Bazický fibroblastový růstový faktor (bFGF) a cévní endotelový růstový faktor (VEGF) jsou zvýšeny v plazmě periferní krve nemocných s chronickou lymfocytární leukemií a klesají po intenzivní léčbě obsahující fludarabin

Overview

Chronická lymfocytární leukemie (CLL) je charakteristická výraznou různorodostí prognózy s celkovým přežitím v řádu několika měsíců až desítek let. V současné době není možné přesně určit budoucí klinický průběh u jednotlivého pacienta. Angiogeneze se ukazuje v posledních letech jako potenciální prognostický faktor u řady hematologických malignit včetně CLL. Cílem naší studie bylo změřit klíčové angiogenní faktory bFGF a VEGF (basic fibroblast growth factor, vascular endothelial growth factor) metodou ELISA v plazmě periferní krve u 73 nemocných s neléčenou chronickou lymfocytární leukemií (43 mužů, 30 žen, medián věku 65 let, rozmezí 31-88 let) a 80 zdravých dobrovolníků. Zjistili jsme signifikantně zvýšenou koncentraci u nemocných s CLL v porovnání s kontrolní skupinou (p < 0,0001 pro oba cytokiny). Nebyly nalezeny významné rozdíly v angiogenních faktorech mezi podskupinami s nízkým vs středním vs vysokým rizikem dle Raie či závislost angiogenních faktorů na pohlaví. U skupiny 12 pacientů došlo po intenzivní léčbě založené na fludarabinu k významnému poklesu u obou těchto faktorů (bFGF: p = 0,0005; VEGF: p = 0,0068), které již nebyly signifikantně odlišné od kontrolní skupiny (bFGF: p = 0,524; VEGF: p = 0,728). Naše data prokázala zvýšení zásadních angiogenních aktivátorů bFGF a VEGF u chronické lymfocytární leukemie. Intenzivní léčba kombinující fludarabin a cyklofosfamid ± rituximab by mohla mít také antiangiogenní účinky. Další studie s delší dobou sledování jsou nutné k vyhodnocení vlivu angiogenních ukazatelů na dobu do progrese či celkové přežití.

Klíčová slova:
chronická lymfocytární leukemie - angiogeneze - bFGF - VEGF - prognóza - léčba - fludarabin

Úvod

Angiogeneze, tedy novotvorba cév z již existující vaskulatury, je zásadním procesem při rozvoji malignit [1-4]. Zatímco význam angiogeneze u solidních nádorů je znám již od počátku 70. let 20. století [1], teprve v 90. letech 20. století dochází k výzkumu neovaskularizace u maligních onemocnění krvetvorby. Zvýšená angiogeneze byla zjištěna u akutních a chronických leukemií, maligních lymfomů, mnohočetného myelomu, myeloproliferací i myelodysplazií [3-9]. Některé studie u maligních onemocnění krvetvorby prokázaly souvislost mezi zvýšenou angiogenezí a nepříznivým klinickým průběhem [7-9]. Chronická lymfocytární leukemie (CLL] je nejčastějším leukemickým onemocněním dospělých v západní populace. Toto lymfoproliferativní onemocnění je typické neobyčejnou různorodostí prognózy (s celkovým přežitím od několika měsíců až po desítky let), která neumožňuje dopředu odhadnout klinický průběh u individuálního pacienta [10]. S cílem zpřesnění prognózy CLL jsou hledány nové prognostické parametry, jako v posledních letech např. genetické aberace detekované fluorescenční in situ hybridizací (FISH) či mutační stav genů kódujících variabilní část těžkého řetězce imunoglobulinu (IgVH) [11]. V posledních letech bylo publikováno, že lymfocyty CLL mají schopnost vyrábět angiogenní aktivátory i inhibitory [12] a že ukazatele angiogeneze by mohly mít u CLL prognostický význam [13-16]. Pouze jediná studie zkoumala vývoj koncentrací angiogenních cytokinů při léčbě CLL [17]. Za nejdůležitější aktivátory angiogeneze jsou pokládány cévní endotelový růstový faktor (vascular endothelial growth factor - VEGF) a bazický fibroblastový růstový faktor (basic fibroblast growth factor - bFGF) [3-4,18-20]. Cílem naší práce bylo 1. stanovení těchto angiogenních faktorů v periferní krvi u nemocných s CLL, 2. zhodnocení jejich vztahu ke klinickému stadiu a 3. porovnat jejich hodnoty v závislosti na intenzivní léčbě na bázi fludarabinu.

Nemocní a metody

Do studie bylo zařazeno 73 nemocných s neléčenou chronickou lymfocytární leukemií diagnostikovanou podle klasických kriterií National Cancer Institute - Sponsored Working Group [21]. Jednalo se o 43 mužů a 30 žen, medián věku 65 let, rozmezí 31-88 let. Nízké (Rai 0)/střední (Rai I - II)/vysoké (Rai III - IV) riziko dle modifikovaného Raiova stagingu [22] bylo přítomno u 37/31/5 nemocných. Kontrolní skupinu tvořilo 80 zdravých dobrovolníků. Jako antikoagulans ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA) byla použita. Všechny vzorky plazmy byly po centrifugaci zamraženy při teplotě -70 ºC až do měření. bFGF i VEGF byly stanoveny pomocí komerčně dostupného ELISA kitu (Human VEGF/bFGF Quantikine ELISA kit, R & D Systems, MN, USA). Měření bylo provedeno podle standardní metodiky doporučené výrobcem. Studie byla provedena dle zásad Helsinské deklarace, schválena etickou komisí a nemocní podepsali informovaný souhlas. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Analyse-it (Analyse-it Software Ltd, Velká Británie). Všechna data byla testována na normalitu Shapirovým-Wilkovým testem. Pokud bylo rozdělení dat normální, byl k testování rozdílů koncentrací vůči kontrolní skupině užit parametrický t-test. Pokud neměla data normální rozdělení, byl použit neparametrický Mannův-Whitneyův U test. K testování změny angiogenních faktorů po léčbě byl proveden Wilcoxonův test. Korelace byla stanovena pomocí Spearmanova korelačního koeficientu. Všechny výsledky p hodnot jsou pro dvoustranné testy. P hodnoty nižší než 0,05 byly považovány za statisticky signifikantní.

Výsledky

Deskriptivní statistika i výsledky testování rozdílů v koncentracích bFGF a VEGF mezi jednotlivými skupinami a kontrolami jsou uvedeny v tab. 1. Koncentrace obou cytokinů u nemocných s CLL byly signifikantně vyšší oproti kontrolní skupině (bFGF: průměr ± standardní odchylka 177,1 ± 167,3 pg/ml, 95% IS - interval spolehlivosti - průměru 140,9-213,5 pg/ml vs 11,1 ± 11,3 pg/ml, 95% IS 8,6-13,6 pg/ml, p < 0,0001; VEGF: 144,2 ± 141,6 pg/ml, 95 % IS 113,4-174,9 pg/ml vs 64,2 ± 59,6 pg/ml, 95% IS 51,0-77,5 pg/ml, p < 0,0001), obr. 1. Počet leukocytů v době odběru nekoreloval s koncentracemi angiogenních faktorů (bFGF: r = 0,1; VEGF: r = 0,17), z čehož vyplývá, že hodnoty angiogenních cytokinů nejsou prostým ukazatelem nádorové masy (tab. 2). Z hlediska prognostických faktorů nebyly nalezeny rozdíly v koncentracích bFGF či VEGF u nemocných s nízkým vs středním vs vysokým rizikem dle Raie (což také hovoří proti lineární souvislosti intenzity angiogeneze a nádorové nálože) či u mužů vs u žen (obr. 2 a 3). U 12 nemocných, kteří podstoupili intenzivní léčbu obsahující fludarabin (režim FCR - fludarabin + cyklofosfamid + rituximab, n = 9; protokol FC - fludarabin + cyklofosfamid, n = 3) došlo po léčbě k signifikantnímu poklesu koncentrace bFGF (p = 0,0005) i VEGF (p = 0,0068), aniž by pokles angiogenních cytokinů po léčbě koreloval s počtem leukocytů (obr. 4, tab. 2). Hodnoty bFGF i VEGF u CLL pacientů po léčbě byly již bez statisticky významného rozdílu vůči zdravým kontrolám (p = 0,524, resp. 0,728).

Diskuse

V posledních letech přibývá důkazů o významu angiogeneze u hematologických malignit. Zvýšené koncentrace angiogenních aktivátorů v periferní krvi byly zjištěny u prakticky všech maligních krevních onemocnění [3-9]. První zmínka o angiogenních ukazatelích u chronické lymfocytární leukemie pochází z roku 1995, kdy Duensing et al prokázali zvýšení bFGF v séru u pilotního souboru 18 pacientů s CLL [23]. V pozdějších letech bylo publikováno několik prací zkoumajících cirkulující bFGF i VEGF [5,13,24-29], některé však vykazovaly metodické nedostatky v podobě naprosté absence či nedostatečného rozsahu kontrolní skupiny [5,23,25,29], ev. zařazení i nemocných, kteří před hodnocením angiogeneze již podstoupili cytoredukční léčbu [5,23,25,29]. V naší práci jsou proto zařazeni výhradně nemocní s neléčenou CLL a kontrolní skupina 80 zdravých dobrovolníků (největší ze všech publikovaných prací na dané téma) prakticky vylučuje chybu malých čísel. V naší práci jsme v souladu s literaturou zjistili statisticky významné zvýšení klíčových aktivátorů angiogeneze bFGF a VEGF v periferní krvi ve srovnání s kontrolní skupinou. Co se týče prognostického významu ukazatelů angiogeneze, ve 3 studiích byly nalezeny vyšší koncentrace bFGF u pokročilých vs časných stadií [13,26,28]. Molica et al navíc zjistili souvislost mezi vyšší koncentrací VEGF a časnější progresí nemocných z časných stadií [13]. Bairey et al publikovali korelaci mezi sérovým bFGF a antiapoptotickým proteinem bcl-2 [25]. V našem souboru jsme neshledali signifikantních rozdílů v bFGF či VEGF mezi nemocnými různých klinických stadií. Jednou z možných příčin je odlišné spektrum pacientů (pouze 5 nemocných v pokročilém stadiu) a také použití odlišného materiálu pro hodnocení angiogenních faktorů (plazma vs sérum). Z technického hlediska je zajímavé, že naprostá většina studií hodnotila angiogenní aktivátory v krevním séru periferní krve [14,24-27], pouze ve2 pracích byla použita krevní plazma [5,29]. Otázka, zda je vhodnější měřit ukazatele angiogeneze v séru či plazmě, je kontroverzní a dosud nedořešená, nicméně řada prací dokazuje, že zejména v případě VEGF je kvantifikace v séru zatížena chybou způsobenou uvolněním tohoto faktoru z trombocytů při tvorbě krevní sraženiny, z čehož vyplývají vyšší hodnoty v séru ve srovnání s plazmou a pozitivní korelace s počtem trombocytů [30-33]. Z tohoto důvodu považujeme za přesnější stanovení angiogenních faktorů v plazmě.

Naše pilotní data prokázala významné snížení bFGF i VEGF po chemo(imuno)terapii na bázi fludarabinu, na základě čehož vyslovujeme hypotézu, že tato léčba by mohla mít také antiangiogenní účinky. Tuto domněnku nepřímo podporují publikace dokazující antiangiogenní efekt u některých klasických cytostatik [34,35]. V jediné předchozí studii hodnotící vliv léčby na angiogenní faktory u CLL zjistila Gora-Tybor et al signifikantní pokles bFGF a TGF-β (transformujícího růstového faktoru β) u 18 nemocných léčených monoterapií kladribinem [17]. Dosud neexistuje práce hodnotící angiogenní faktory v závislosti na kombinované léčbě obsahující fludarabin, stejně tak nebyla dosud publikována studie hodnotící vývoj koncentrací VEGF po léčbě CLL. V tomto jsou naše výsledky prioritní. Nedostatkem naší studie je absence srovnání angiogenních faktorů s moderními prognostickými faktory (mutační stav IgVH, genetické aberace vyšetřované pomocí FISH). Souvislost mutačního stavu IgVH a angiogenních aktivátoru jsme již publikovali jako pilotní studii u 46 nemocných [36]. V nynější rozšířené kohortě však nebylo možné z finančních důvodů tato vyšetření provést u starých či polymorbidních nemocných vzhledem k tomu, že velmi drahé stanovení mutačního stavu IgVH či genetických aberací u nich neovlivní volbu terapie.

Závěr

Závěrem shrnujeme, že v naší studii jsme prokázali signifikantní zvýšení zásadních angiogenních cytokinů bFGF a VEGF u skupiny nemocných s dosud neléčenou CLL. Nebyla prokázána souvislost koncentrací těchto faktorů s klinickým stadiem dle Raie, či pohlavím. Agresivní léčba složená z fludarabinu, cyklofosfamidu ± rituximabu vedla k významnému snížení koncentrací těchto angiogenních aktivátorů na hodnoty srovnatelné s kontrolní skupinou. Tyto výsledky by tedy mohly ukazovat na antiangiogenní působení této terapie. Delší doba sledování je nutná k posouzení eventuální spojitosti mezi angiogenními ukazateli parametry jako doba do progrese či celkové přežití; rozsáhlejší kohorta nemocných pak k potvrzení pilotních dat týkajících se poklesu angiogenních faktorů po léčbě. Další výzkum angiogeneze u CLL je cenný nejen z prognostického, ale také léčebného hlediska, neboť v současné době jsou již k dispozici nadějná data z klinických studií využívajících antiangiogenní léky, jako je thalidomid či lenalidomid [37,38].

Tato práce byla podpořena grantem NR/8373 - 3 IGA MZ ČR.

MUDr. Lukáš Smolej

www.fnhk.cz

e-mail: smolej@seznam.cz

Doručeno do redakce: 18. 5. 2007

Přijato po recenzi: 17. 7. 2007